PLoS ONE: Receptor-Anerkendt α2-makroglobulin bindes til celleoverfladen-associeret GRP78 og Aktiverer mTORC1 og mTORC2 signalering i prostatakræft Cells

Abstrakt

Målsætning

tetrameriske α

2 makroglobulin (α

2M), et plasma panproteinase inhibitor, aktiveres ved interaktion med en proteinase, og gennemgår en gennemgribende konformationel ændring udsætte en receptor genkendelsessted i hver af dens underenheder. Aktiverede α

2M (α

2 M *) binder til kræft celleoverflade GRP78 og udløser proliferativ og antiapoptotisk signalering. Vi har undersøgt betydningen af ​​α

2 M * i reguleringen af ​​mTORC1 og TORC2 signalering i væksten af ​​humane prostata kræftceller.

Metoder

Anvender immunpræcipitation teknikker og vestlige blotting samt som kinaseassays, aktivering af mTORC1 og mTORC2 komplekser samt downstream mål blev undersøgt. RNAi blev også anvendt til at lukke munden på ekspressionen af ​​Raptor, Rictor eller GRP78 i parallelle undersøgelser.

Resultater

Stimulering af celler med α

2 M * fremmer fosforylering af mTOR, TSC2, S6- kinase, 4EBP, Akt

T308, og Akt

S473 i en koncentration og tidsafhængig måde. Rheb, Raptor, og Rictor steg også. α

2 M * behandling af celler forhøjede mTORC1-aktivitet som bestemt ved kinase analyser af mTOR eller Raptor immunpræcipitater. mTORC1 aktivitet var følsomme over for LY294002 og rapamycin eller transfektion af celler med GRP78 dsRNA. Nedregulering af Raptor udtryk ved RNAi væsentligt reducerede α

2 M * induceret S6-kinase fosforylering på T389 og kinase aktivitet i Raptor immunpræcipitater. α

2M * -behandlede celler demonstrerer om en fordobling i mTORC2 kinase aktivitet, bestemt ved kinase assay af Akt

S473 phosphorylering og niveauer af p-Akt

S473 i mTOR og Rictor immunpræcipitater. mTORC2 aktivitet var følsomme over for LY294002 og transfektion af celler med GRP78 dsRNA, men ufølsom overfor rapamycin. Nedregulering af Rictor udtryk ved RNAi reducerer α

2M * induceret fosforylering af Akt

S473 fosforylering i Rictor immunopræcipitater.

Konklusion

Binding af α

2 M * til prostatakræft celleoverfladen GRP78 opregulerer mTORC1 og mTORC2 aktivering og fremmer proteinsyntese i prostata kræftceller

Henvisning:. Misra UK, Pizzo SV (2012) receptor-anerkendt α

2-makroglobulin Binder to Cell Overflade-associeret GRP78 og Aktiverer mTORC1 og mTORC2 signalering i prostatacancerceller. PLoS ONE 7 (12): e51735. doi: 10,1371 /journal.pone.0051735

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: 19. juni 2012; Accepteret: 5. november 2012; Udgivet: December 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Misra, Pizzo. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

evne kræftceller til at trives

in vivo

afhænger af mange faktorer, blandt hvilke er repertoiret af proteiner modulerende deres miljø. Mens leveren producerer store mængder af proteinaseinhibitor α

2-makroglobulin (α

2M) den er fremstillet ved cancerceller og er forbundet med tumorvækst [1]. α

2M også lokalt produceret i tumor stromale væv, såsom associeret med prostatacancer [2]. Det er en pan-proteinaseinhibitor, som reagerer med tumorafledte matrixmetalloproteinaser og prostataspecifikt antigen (PSA). Mens PSA har sin nærmeste identificeret med prostatacancer, er det også produceres af andre tumorer, herunder bryst- [3]. Når proteinaser angribe “lokkemad region” i hver af de fire α

2M underenheder, thiolestere briste og proteinet undergår en meget stor konformationsændring udsætter receptor genkendelsessteder i hver underenhed [4]. Foruden proteinaser, eksponering af α

2M til små primære aminer eller ammoniak, ved direkte angreb på thiolestere, inducerer også en stor konformationsændring udsætte disse steder receptorgenkendelse [4]. Disse aktiverede former betegnes α

2M *. Selvom GRP78 (glukose reguleret protein hr ~78000) primært er kendt som en hjemmehørende endoplasmatisk reticulum chaperone, vises det på celleoverfladen af ​​mange typer af maligne celler [5] – [10]. Binding af α

2M * til tumorcelleoverfladen GRP78 forårsager dens autophosphorylering [11], [12] aktivering ned stream pro-proliferativ og anti-apoptotiske signaleringskaskader herunder RAS /MAPK og PI 3-kinase /Akt [5] – [10]. Det har derfor været foreslået, at opregulering af celleoverflade GRP78 er en del af den aggressive fænotype i forskellige cancerformer, herunder prostata og melanom [8]. I overensstemmelse med denne hypotese, autoantistoffer mod NH

2-terminale domæne af GPR78 vises i sera fra prostatacancer og melanompatienter, hvor de er en biomarkør for aggressiv adfærd [13], [14]. Disse antistoffer er agonister, der binder til den samme region i GRP78 hvor α

2M * binder [15]. I modsætning hertil monoklonale antistoffer rettet mod carboxyl-terminale domæne af GRP78 er antagonister af α

2M * og anti-GRP78-NH

2-terminale domæne antistoffer i cellekultur og mus [10], [12], [16] – [20]. Baseret på disse og andre observationer, vi hypotesen, at aktiverede α

2M fungerer som en vækstfaktor og celleoverflade-associeret GRP78 som en vækstfaktor-lignende receptor [5] -. [10]

Panel A . α

2M * koncentrationsafhængig proteinsyntese. Panel B. Graduering af α

2M * -induceret-proteinsyntese i en-LN-celler. Søjlerne er: (1) buffer; (2) α

2 M * (50 pM); (3) wortmannin 30 nM /20 min derefter α

2 M * (50 pM); (4) LY294002 (20 uM /20 min) og derefter α

2M *; (5) Rapamycin (100 nM /20 min), derefter α

2M *; (6) Actinomycin D (5 ug /ml /15 min) og derefter α

2M *. Værdierne i felt A og B er middelværdier ± SE fra fire uafhængige forsøg. Værdier markant forskellige på 5% niveauet for α

2M * -behandlede celler markeret med en stjerne (*).

Akt er en Ser /Thr-kinase udtrykt som isoformer, Akt1, Akt2, og Akt3, der kodes af tre forskellige gener [21]. Disse isoformer er næsten identiske i aminosyresekvens; men deres relative ekspression afviger i forskellige mammale væv [21]. Akt er den største nedstrømseffektor i PI 3-kinase-vejen og det regulerer celleoverlevelse, proliferation og metabolisme. PI 3-kinase phosphorylerer PIP2 at generere PIP3 som binder til Akt således fremme dens translokation til plasmamembranen, hvor det er phosphoryleret i Thr308 i det katalytiske domæne af PDK1 og Ser473 i den hydrofobe motiv domæne ved mTORC2 [21] – [24]. Phosphorylering ved begge disse positioner er nødvendig for fuld aktivering af Akt1. Akt1 er også phosphoryleret co-translocationally på Thr450 i “turn” motiv af mTORC2 [25] – [27]. Turn motiv fosforylering af Akt er afgørende for nyligt syntetiserede Akt til at påtage sig sin rette foldning og stabilitet. Mutationer af RAS som aktiverer Akt, forekommer i -30% af epiteliale tumorer og Akt genamplifikation forekommer også i en delmængde af humane cancere. Desuden partiel ablation af Akt er tilstrækkelig til at hæmme udviklingen af ​​tumorer i PTEN +/- mus [28], [29]. I kliniske prøver på prostatakræft overekspression og aktivering af Akt1- er forbundet med høje pre-operative PSA niveauer, højere Gleason kvaliteter, og kortere sygdom tilbagefald gange [29] – [32]. Immunohistokemiske undersøgelser viser en stærkt forøget farvning af p-Akt

S473 i dårligt differentieret prostatacancer [29], [32].

I panel A er vist effekten af ​​inkubationstiden af ​​celler med α

2M * (50 pM) og panel B er vist virkningen af ​​varierende koncentrationer af α

2M * i 25 minutter på ekspression af: p-mTOR

T2481 (O); Raptor (▵); Rictor (▴); GβL (□); p-TSC (•); og Rheb (▪) som bestemt ved Western blotting. En repræsentativ immunoblot fra tre til fem eksperimenter er vist for hvert protein i Panel A og Panel B. Ekspressionen af ​​disse proteiner er vist i arbitrære fluorescensenheder og udtrykkes som middelværdien ± SE fra tre til fem uafhængige forsøg. Protein lastning kontrol, enten phosphorylerede target proteiner eller actin, blev udført for både Panel A og Panel B er vist nedenfor de respektive immunblots.

pattedyr mål for rapamycin (mTOR), en evolutionært bevaret Ser /Thr kinase, er en vigtig regulator af Akt fosforylering (se anmeldelser [33] – [37], og referencer deri). Der er stigende interesse i at målrette mTOR i behandlingen af ​​cancere, såsom prostata [28], [33], [34], [36], [37]. Dette mål kan kompliceres af, at mTOR er til stede i to fysisk og funktionelt adskilte proteinkomplekser udpeget som mTORC1 og mTORC2 henholdsvis (se anmeldelser 33-37, og referencer deri). Disse to komplekser er forskellige i deres regulering, downstream mål, og følsomhed over for hæmmeren rapamycin. mTORC1 er en homodimer indeholder mTOR Raptor, og GβL; det er følsomt over rapamycin. Aktiveret mTORC1 fremmer cellevækst delvist af direkte phosphorylering den translationelle regulatorer S6-kinase og eIF4E bindende protein (4EBP) (35). Akt-induceret fosforylering af PRAS40 og Deptor forårsager deres afstandtagen fra Raptor og fremmer rekruttering af dens downstream substrater S6-Kinase1 og 2, 4EBP1, og 4EBP2 (se anmeldelser [33] – [37] og referencer deri). Binding af Rheb • GTP til mTORC1 resultater i mTORC1 aktivering, mens binding til Rheb • BNP i sin hæmning. Phosphorylering af TSC2 af Akt1- hæmmer dets GTPase aktivitet fører til øget GTP belastning på Rheb og deraf følgende stigning i mTORC1 aktivitet (se anmeldelser [33] – [37] og referencer deri). S6-kinase regulerer mTORC1 gennem en negativ feedback-signalvejen der phosphorylerer IRS og inhiberer PI 3-kinase og Akt aktivering. Den mTORC2 kompleks, ud over mTOR, indeholder Rictor, GβL, Deptor, Protor, og mSIN1 og er ufølsom overfor akut rapamycin inhibering (se [33] – [37] og referencer deri). Men langvarig mTORC2 udsættelse for rapamycin hæmmer mTORC2 i nogle celletyper [24], [33] – [35]. Protor binder tæt til Rictor, men er ikke påkrævet for mTORC2 aktivitet [33] – [35]. Både mTORC1 og mTORC2 aktiveres af vækstfaktorer, herunder insulin og insulin-lignende vækstfaktor [33] – [35]. Men de mekanismer, hvormed vækstfaktorer aktiverer mTORC2 ikke klart forstået [33], – [37]. mTORC2 associerer med ribosomer og det kan tjene som en opstrøms reguleringsmekanisme [38], [39]. Insulin stimulering af normale celler og cancerceller fremmer mTORC2 binding til ribosomer og PI 3-kinase signalering [38], [39]. GβL binder mTORC1 og mTORC2 nær kinasedomænet og er nødvendig for mTORC2 integritet. Deptor bindes også til både mTORC1 og mTORC2 nær kinase domæne og regulerer negativt både mTORC1 og mTORC2 aktivitet [33] – [37].

I vores tidligere undersøgelser, vi demonstreret, at α

2M * NH

2-binding til celleoverfladen-associeret GRP78 i prostatacancerceller udløser proliferation og anti-apoptotisk signalering. Forbehandling af celler med inhibitorer af disse signalveje, forbehandling med antistoffer mod det carboxyterminale domæne af GRP78 eller transfektion af celler med dsGRP78 RNA, dybt inhiberer disse signalveje [10], [12], [16] – [20] . Stimulering af prostatacancerceller med α

2M * inducerer også syntesen af ​​GRP78 som til dels medieres af transkriptionsfaktoren TFII-I siden celletransfektion med dsTFII-I RNA signifikant undertrykker GRP78 opregulering [40]. Denne behandling også hæmmer celleoverfladen translokation af TFII-I, forfremmet calcium indrejse, og apoptotisk signalering [40]. Stimulering af prostatacancerceller med α

2M * forårsager også transkriptionel og translationel opregulering af PSA-syntese [10], som udskilles og komplekser med α

2M. Behandling af celler med α

2M-PSA-komplekset fremmer DNA og proteinsyntese og opregulerer RAS /MAPK og PI 3-kinase /Akt signalveje ligner dem observeret i α

2M-NH

2 stimulerede celler [10 ]. Ligesom α

2M-NH

2, α

2M-PSA, forårsager en forøget ekspression af p-S6-kinase, p-Akt

T308 og p-Akt

S473, effektoren signalering komponenter af aktiveret mTORC1 og mTORC2 [10]. I betragtning af den afgørende rolle, mTOR signalering i tumorvækst og metastase, og vores bemærkninger om α

2 M * induceret vækst prostatacancerceller, celledeling og opregulering af PI 3-kinase /Akt signalering [6], [7 ], [9], [10], [12], [16], [17], [18], har vi vurderet rolle mTORC1 og mTORC2 signalveje i prostatacancerceller stimuleret med α

2 M *. For at vurdere specificiteten af ​​celleoverfladen GRP78 i α

2M * -induceret signalering begivenheder, vi har tavshed ekspressionen af ​​GRP78 af RNAi samt forbehandling af celler med antistoffer mod carboxyl-terminale domæne af GRP78. For at bestemme specificiteten af ​​mTORC1 i aktivering sin nedstrøms substrat S6-kinase og mTORC2 i phosphorylerende Akt

S473, har vi ansat Raptor og Rictor RNAi behandling hhv. Her viser vi, at α

2 M * aktiverer mTORC1 kinase, som bestemt ved S6-kinase og 4EBP1 phosphorylering og mTORC2 kinase som bestemt af Akt

S473 fosforylering. Silencing GRP78 genekspression ved RNAi eller behandling med grp78 antistoffer stærkt undertrykt α

2M * induceret aktivering af mTORC1 og mTORC2 i disse celler. Disse undersøgelser viser yderligere rolle af cirkulerende α

2 M, en pan proteinaseinhibitor, som en vækstfaktor og chaperonen GRP78 som en vækstfaktorreceptor vigtige for cellulær vækst i patofysiologiske miljøer.

Et repræsentativt immunblot af p-S6-kinase (O) og p-4EBP1 (•) fra tre til fem eksperimenter er vist for hvert protein i panel A og B. p-S6-kinase (O) og p-4EBP1 (•) er udtrykt i arbitrære fluorescensenheder som middel ± SE fra tre til fire uafhængige forsøg. Proteinet lastning kontrol for Panel A og Panel B er vist nedenfor de respektive immunblots.

Materialer og metoder

Materialer

Kultur medier blev købt fra Invitrogen. Receptor-genkendte α

2 M * blev fremstillet ved omsætning af α

2M med methylamin som beskrevet tidligere [9). Antistoffer mod mTOR, p-mTOR

S2481, GβL, p-TSC2

T1462, Rheb, S6-kinase, p-S6-kinase

T235 /236, p-S6-kinase

T389, p-S6-kinase

T229, 4EBP1, p-4EBP1

T37 /46, Akt1, p-Akt

T308, p-Akt

S473 blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) . Antistoffer mod Raptor, Rictor, Protor var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-mSIN1 antistof var fra Bethyl Laboratories, Inc (Montgomery, TX). Anti-actin antistof var fra Sigma (St. Louis, MO). PHAS-1 (4EBP1) var fra Stratgene. GST-S6-kinase konstruktionen blev udtrykt og oprenset i overensstemmelse med den protokol, som Prof Blenis (Harvard University Medical School). Antistoffer mod carboxyl-terminale domæne af GRP78 var fra Aventa Biofarmaceutiske Corp (San Diego, CA). [

3H] Leucin (specifik aktivitet 115,4 Ci /mmol) og [

33P] -γ-ATP (specifik aktivitet 3000 Ci /mmol) var fra Perkin-Elmer Life Sciences. Rapamycin og LY294002 var fra Biomol (Plymouth, PA). Alle andre materialer var af analytisk kvalitet og blev indkøbt lokalt.

•), bestemt ved Western blotting. Et repræsentativt immunblot af p-Akt

T308 og p-Akt

S473 af tre til fire eksperimenter er vist under grafen. Ekspressionen af ​​disse proteiner er vist i arbitrære fluorescensenheder og udtrykkes som middelværdien ± SE fra tre til fire eksperimenter. De protein lastning kontrol for Panel A og Panel B er vist nedenfor de respektive immunblots.

Prostata Cancer Cell Lines

I en tidligere rapport, vi studerede to prostatakræft linjer 1-LN og DU-145, som udtrykker GRP78 på deres celleoverflade og PC-3 prostatacancer linje, der udtrykker lidt GRP78 på celleoverfladen [10], [12]. Den stærkt metastatisk 1-LN-cellelinien er afledt af PC-3 linje og var en venlig gave fra Dr. Phillip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). PC-3 og DU-145-cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection. Den 1-LN-cellelinien blev afledt fra en flanke tumor model, hvor PC-3-celler blev implanteret i nøgne mus. Cellerne blev opnået fra en lymfeknude-metastase i disse mus. Fordi denne cellelinie udtrykker GRP78 på celleoverfladen og ingen eller meget lidt LRP Vi har flittigt brugt denne linje for undersøgelser af betydningen af ​​celleoverfladen GRP78 i cancercellevækst. Denne cellelinie er tilgængelig for enhver investigator, der ønsker at bruge dem. Afhængigt af forsøgene blev disse celler dyrket enten i 6, 12, 24- eller 48-brøndsplader til konfluens i RPMI-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 12,5 enheder /ml penicillin, 6,5 ug /ml streptomycin og 10 nM insulin (RPMI-S) i en fugtig CO

2 (5%) inkubator. Ved 90% konfluens blev mediet aspireret. Monolagene vasket med iskold HHBSS, en frisk mængde af medium tilsat og cellerne anvendt til eksperimenterne beskrevet nedenfor.

En repræsentativ immunoblot fra tre til fire eksperimenter af mTOR, Raptor, GβL, mSIN1, Rictor og Protor tilstedeværelse i disse respektive immunpræcipitater er vist. Cellerne blev behandlet med: (1) buffer og (2) 50 pM af α

2 M * i 25 min

Bestemmelse af virkningerne af α

2 M * på proteinsyntese. i 1-LN-celler

1-LN-celler (300 × 10

3 celler /brønd) i 48 brønds plader blev dyrket i RPMI-S-medium i en fugtig CO

2 (5%) inkubator ved 37 ° C. På omkring 90% konfluens blev mediet aspireret et volumen RPMI-S blev tilsat efterfulgt af tilsætning af enten buffer eller α

2 M * (50 pM). Til hver brønd blev tilsat [

3H] leucin (2 uCi /ml), og celler blev inkuberet natten over. Reaktionerne blev afsluttet ved opsugning mediet og monolagene vasket tre gange to gange med iskold 5% TCA, efterfulgt af tre vaske med iskold PBS. Celler blev lyseret i et volumen på 1 NaOH (40 ° C /2 H), protein blev anslået og lysaterne blev talt i en væskescintillationstæller. I eksperimenter, hvor modulering af α

2 M * induceret proteinsyntese blev undersøgt, blev cellerne forbehandlet med PI 3-kinase-inhibitoren LY294002 (20 uM /20 min), mTOR inhibitor rapamycin (100 nM /15 min) eller actinomycin D (5 ug /ml /20 min), før du tilføjer α

2 M * (50 pM /natten over). Andre oplysninger om kvantificere [

3H] leucin inkorporering i cellulære proteiner var som beskrevet [41].

fosforylering af S6-kinase og 4EBP1 blev bestemt ved [

33P] -γ-ATP inkorporering og autoradiografi (AR) og ved immunoblotting (IB). Panel A. En bar der viser α

2M * induceret aktivering af mTORC1 og modulation af LY294002 og rapamycin i mTOR immunopræcipitater som bestemt ved autoradiografi. Barerne og stræder i autoradiogrammer er: (1) buffer; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /20 min) og derefter α

2 M * (50 pM /25 min); og (4) rapamycin (100 nM /15 min) og derefter α

2 M * (50 pM /25 min). Et repræsentativt autoradiograf (AR) af tre individuelle eksperimenter er vist nedenfor søjlediagrammet. Phosphorylering af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) udtrykkes i arbitrære fluorescensenheder og er middelværdien ± fra tre uafhængige forsøg. Også vist nedenfor AR er en repræsentativ immunoblot (IB) i tre forsøg med p-S6-kinase og p-4EBP1 opnået fra mTOR immunopræcipitater af celler behandlet som i autoradiografisk analyse i Panel A. Panel B. et søjlediagram der viser virkningen af ​​silencing GRP78 udtryk af RNAi på α

2 M * induceret aktivering af mTORC1 i mTOR immunopreciptates i 1-LN-celler, som bestemt ved autoradiografi. Søjlerne og de baner i autoradiogrammet (AR) er: (1) lipofectamin + buffer; (2) lipfectamine + α

2 M (50 pM /25 minutter); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h), så α

2 M * (til pM /25 min); og (4) scrambled dsRNA (100 nM /48h) end α

2 M * (til pM /25 min). Et repræsentativt autoradiografi af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) af tre forsøg er vist nedenfor søjlediagrammet. Phosphorylering af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) udtrykkes i arbitrære fluorescensenheder som gennemsnit ± SE fra tre uafhængige forsøg. Også vist nedenfor autoradiografen (AR) er et repræsentativt immunblot (IB) p-S6-kinase og p-4EBP1 opnået fra mTOR immunopræcipitater af 1-LN-celler behandlet som i autoradiografisk analyse i Panel B. En immunoblot repræsentant for tre eksperimenter viser ekspressionen af ​​GRP78 i celler transficeret med GRP78 dsRNA er også vist. Banerne i immunblot er: (1) lipofectamin + buffer; (2) lipofectamin + α

2M * (50 pm /25 min); (3) GRP78 dsRNA (100 nM /48h) + α

2M *; og (4) scrambled dsRNAi (100 nM /48h) + α

2 M *. Panel C. et søjlediagram der viser virkningen af ​​silencing GRP78 ekspression ved RNAi på α

2 M * induceret phosphorylering af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) i Raptor immunopræcipitater af 1-LN-celler som bestemt ved autoradiografi. Barer og baner i autoradiografen (AR) er identiske med bar diagram og autoradiografi i Panel B. Et repræsentativt autoradiograf (AR) af S6-kinase og 4EBP1 af tre eksperimenter er vist under overliggeren diagram. Phosphorylering af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) udtrykkes i arbitrære fluorescensenheder som middelværdi ± SE fra tre forsøg. Også vist nedenfor autoradiografen (AR) er et repræsentativt immunblot (IB) i tre forsøg med p-S6-kinase og p-4EBP1 opnået fra Raptor immunopræcipitater af 1-LN-celler behandlet som i autoradiografiske analyse i Panel C. Panel D. autoradiogram viser α

2M * induceret fosforylering af S6-kinase og 4EBP1 i DU-145 prostatacancerceller, men ikke i PC-3 prostatacancerceller. Banerne i autoradiogrammet er: (1) puffer; (2) α

2 M *. For detaljer se afsnittet “eksperimentelle procedurer”. Den viste autoradiogram repræsenterer fire eksperimenter. Panel E. et søjlediagram, der viser, at antistoffer mod carboxyl-terminale domæne af GRP78 inhiberer α

2 M * induceret phosphorylering af S6-kinase (▪) og 4EBP1 (□) i mTOR immunopræcipitater af 1-LN-celler. Søjlerne er: (1) buffer; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) antistoffer mod carboxyl-terminale domæne af GRP78 (3 ug /ml /1 time) og derefter α

2M *. Phosphorylering af S6-kinase og 4EBP1 blev bestemt ved autoradiografisk analyse og udtrykkes i arbitrære enheder og er middelværdien ± SE fra tre forsøg. Værdierne er signifikant forskellige på 5% for α

2 M * og scrambled dsRNA-behandlede celler er angivet med en stjerne (*) i alle Paneler A til E.

Virkninger af 1-LN Cell Inkubation med α

2 M * på p-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, Rheb, Raptor, Rictor, GβL, p-S6-kinase, p-4EBP1, p-Akt

T308 og p-Akt

S473

1-LN-celler (300 × 10

3 celler /brønd) i RPMI-S-medium i plader med 6 brønde blev inkuberet som ovenfor. Ved 90% konfluens blev mediet aspireret, et volumen RPMI-S-medium tilsat til hver brønd. I et sæt eksperimenter blev celler stimuleret med forskellige koncentrationer af α

2M * og inkuberet i 30 min. I et andet sæt af studier blev celler stimuleret med 50 pM af α

2M * og inkuberet i forskellige tidsrum ved 37 ° C i en fugtig CO

2 (5%) incubator. Reaktionerne blev afsluttet ved opsugning mediet, et volumen på lysis buffer A indeholdende 50 mM Tris • HCl (pH 7,5), 120 mM NaOH, 0,1% NP40, 25 mM natriumfluorid, 1 mM natriumpyrophosphat, 0,1 mM natriumorthovanadat, 1 mM PMSF, 1 mM benzamidin, og leupeptin (10 pg /ml) tilsat og anbragt på is i 15 minutter. Lysaterne blev overført til Eppendorf-rør og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester. Supernatanterne blev fjernet til nye rør og deres proteinindhold bestemmes [42]. Til en tilsvarende mængde protein, et volumen på 4 × prøvebuffer tilsat, rør kogt i 5 min og centrifugeret. Prøverne blev elektroforeret i polyacrylamidgeler (12,5%, 10% eller 4-20% gradientgeler efter behov). De protein bands i geler blev overført til Hybond-P-membraner og i separate eksperimenter membraner immunoblottedes med antistoffer mod p-mTOR

S2481, p-TSC2

T1462, Raptor, Rictor, GβL, Rheb, p-S6-kinase

S235 /236, s-4EBP1

T37 /46, p-Akt

T308 eller p-Akt

S473 i 16 timer ved 4 ° C med rotation. Påvisning og kvantificering af immunblots for de respektive antigener blev udført af ECF og Storm 860 phosphorimager. De respektive membraner blev testet igen for proteinet loading kontrol, ikke-phosphoryleret målprotein eller actin, i denne og de følgende undersøgelser. Specificiteten af ​​antistoffer anvendt her og i de nedenfor beskrevne eksperimenter blev bestemt ved behandling af cellerne med ikke-immune antistoffer og cellelysater forarbejdet som ovenfor. Under de eksperimentelle betingelser, blev der ikke reaktivitet af disse kontroller observeret [10], [43], [44].

Panel A. Bar der viser niveauer af Raptor i celler transficeret med Raptor dsRNA og stimuleret med α

2 M * eller insulin. Søjlerne er: (1) lipofectamin + buffer; (2) lipofectamin + α

2M * (50 pM /25 min); (3) lipofectamin + insulin (200 nM /20 min); (4) scrambled dsRNA (100 nM /48 h) + insulin; (5) Raptor dsRNA (100 nM /48 h); (6) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) derefter α

2M *; (7) Raptor dsRNA (100 nM /48 h) derefter insulin (200 nM /20 min); (8) rapamycin (100 nM /20 min) og derefter insulin. Værdier er gennemsnit ± SE fra tre til fire uafhængige forsøg og er udtrykt som arbitrære fluorescensenheder. Værdier er signifikant forskellige ved 5% niveauet for α

2 M *, insulin og scrambled dsRNA-behandlede celler er markeret med en stjerne (*). Et repræsentativt immunblot af Raptor fra tre til fire eksperimenter sammen med sin protein loading kontrol actin er vist under overliggeren diagram. Panel B. et søjlediagram, der viser mTORC1 aktivering i celler behandlet med α

2M * og insulin og virkningen af ​​transfektion med Raptor dsRNA på dets aktivering som målt ved analyse phosphorylering af S6-kinase ved autoradiografi. Barerne og stræder i autoradiografi er: (1) lipofectamin + buffer; (2) lipofectamin + α

2M * (50 pM /25 min); (3) Raptor dsRNA (100 nM /48 h); (4) Raptor dsRNA + α

2 M *; (5) lipofectamin + insulin (200 nM /20 min); (6) scrambled dsRNA (100 nM /48 h) + insulin; (7) Raptor dsRNA (100 nM /20 min), derefter insulin; (8) rapamycin (100 nM /20 min) og derefter α

2M *; (9) LY294002 (20 mM /20 min) og derefter insulin; (10) rapamycin (100 nM /20 min) og derefter insulin. Et repræsentativt autoradiografi af tre eksperimenter af S6-kinase-phosphorylering er vist under overliggeren diagram. Værdier er middelværdien ± SE fra tre eksperimenter og er udtrykt i arbitrære enheder. Værdier er signifikant forskellige på 5% niveauet for α

2 M *, insulin og scrambled dsRNA behandlede celler er markeret med en stjerne (*). Panel C. En bar der viser niveauer af S6-kinase phosphoryleret ved T389 (▪); T229 (se grå firkant) og T 235/236 (□) i celler stimuleret med α

2 M * eller insulin og transfekteret med Raptor dsRNA. Søjlerne er som i panel A. Repræsentative immunblots af p-S6-kinase

T389, p-S6-kinase

T229 og p-S6-kinase

T235 /236 tre eksperimenter sammen med sin protein lastning kontrol er vist under overliggeren diagram. Værdier er middelværdien ± SE fra tre eksperimenter og er udtrykt i arbitrære fluorescensenheder. Værdier er signifikant forskellige på 5% niveau α

2 M *, insulin eller krypteret dsRNA er angivet med en stjerne (*). Panel D. En bar der viser phosphoryleringsniveauerne af 4EBP1, i celler behandlet med α

2 M * og insulin eller transfekteret med Raptor dsRNA. Søjlerne er som i panel A. Et repræsentativt immunblot af p-4EBP1 af tre eksperimenter sammen med sin protein loading kontrol er vist under overliggeren diagram. Værdier er middelværdien ± SE fra tre eksperimenter og er udtrykt i arbitrære fluorescensenheder. Værdier er signifikant forskellige på 5% niveau α

2 M *, insulin og scrambled dsRNA-behandlede celler er markeret med en stjerne (*).

Karakterisering af komponenterne i mTORC1 og mTORC2 komplekser i 1-LN prostatacancerceller stimuleret med α

2M *

1-LN-celler (3 x 10

6 per brønd i plader med 6 brønde) inkuberet natten over i RPMI-S-medium blev vasket to gange med iskold HHBSS og et volumen RPMI-S-medium tilsat til hver brønd. Efter temperaturækvilibrering blev celle i brøndene udsættes for enten buffer eller α

2 M * (50 pM /25 min) og inkuberet som ovenfor. Reaktioner blev stoppet ved at suge mediet og et volumen på CHAPS lysisbuffer (puffer B) indeholdende 40 mM Hepe (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrophosphat, 10 mM β-glycerophosphat, 0,5 mM natriumorthovanadat , 0,3% CHAPS og et Roche proteaseinhibitorcocktail tablet (1 tablet /10 ml) blev tilsat, og cellerne lyseret på is i 15 minutter. Lysaterne blev overført til separate Eppendorf-rør, centrifugeret (1000 rpm /5 min /4 ° C) og supernatanterne anvendt for protein estimation og immunopræcipitation. Lige mængder af lysat-protein (200-250 ug) i separate eksperimenter blev anvendt til immunpræcipitering med Raptor antistoffer (1:50, Santa Cruz Cat # sc81537), eller Rictor antistoffer (1:50, Santa Cruz cat # 81.538) efterfulgt af tilsætning af 40 pi protein A agarose og indhold inkuberet med rotation natten over ved 4 ° C. Raptor og Rictor immunpræcipitater blev udvundet ved mikro-centrifugering (2000 rpm /5 min /4 ° C) og vasket to gange med kold lysepuffer B. Til Raptor og Rictor immunpræcipiterer et volumen på 4 × prøvepuffer blev tilsat, rørene kogt i 5 minutter , centrifugeret, elektroforese (4-20%, 12,5% eller 10% acrylamidgeler), overført til Hybond-P-membraner og membraner immunoblottedes med antistoffer specifikke for mTOR, Raptor, Rictor, GβL, mSIN1 og Protor. Proteinbåndene på membranerne blev kvantificeret som ovenfor [43], [44].

Panel A. En bar diagram, der viser α

2M * induceret phosphorylering af Akt på T308 (▪) og S473 ( □) i kinaseassays af mTOR immunpræcipitater. Barerne og stræder i immunoblot er: (1) buffer; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 uM /25 min) og derefter α

2M *; (4) rapamycin (100 nM /20 min) og derefter α

2 M *. Værdier er gennemsnit ± SE fra fire uafhængige forsøg og er udtrykt som fmol [

33P] -γ-ATP inkorporeret /mg celleprotein. Værdier markant forskellige på 5% niveau for α

2M * -behandlede celler er angivet med en stjerne (*). Panel B. En bar der viser α

2M * induceret fosforylering af Akt på T308 (▪) og S473 (□) i kinaseassays af Rictor immunpræcipitater. Barerne og stræder i immunoblot er: (1) buffer; (2) α

2M * (50 pM /25 min); (3) LY294002 (20 mM /25 min) og derefter α

2M * og (4) Rapamycin (100 nM /20 min).