PLoS ONE: Hedgehog Signaling Antagonist Fremmer Regression af både lever fibrose og hepatocellulært carcinom i en murin model af Primary Liver Cancer

Abstrakt

Målsætning

Kronisk fibroserende leverskade er en stor risikofaktor for hepatocarcinogenese hos mennesker. Mus med målrettet sletning af Mdr2 (det murine ortolog af MDR3) udvikler kronisk fibroserende leverskade. Hepatocellulært carcinom (HCC) opstår spontant i sådanne mus ved 50-60 ugers alderen, hvilket giver en model af fibrose-associeret hepatocarcinogenese. Vi brugte Mdr2

– /- mus til at undersøge den hypotese, at aktiveringen af ​​pindsvin (Hh) signalvejen fremmer udvikling af både leverfibrose og HCC

Metoder

Nedsat skade og fibrose. blev Hh pathway aktivering og de lever progenitorpopulationer sammenlignet i Mdr2

– /- mus og aldersmatchede kontroller vildtype. En dosis fund eksperiment med Hh signalering antagonist GDC-0449 blev udført for at optimere Hh pathway hæmning. Musene blev derefter behandlet med GDC-0449 eller køretøj i 9 dage, og effekter på lever fibrose og tumor byrde blev vurderet ved immunhistokemi, QRT-PCR, Western blot, og magnetisk resonans.

Resultater

i modsætning til kontrol, Mdr2

– /- mus konsekvent udtrykt Hh ligander og progressivt akkumuleret Hh-responsive lever myofibroblaster og forfædre med alderen. Behandling af alderen Mdr2-mangel mus med GDC-0449 signifikant hæmmede hepatisk Hh aktivitet, nedsat lever myofibroblaster og stamceller, nedsat lever- fibrose, fremmet regression af intra-hepatisk HCCs, og faldt antallet af metastatisk HCC uden at øge dødeligheden.

konklusioner

Hh-aktivering fremmer liver fibrose og hepatocarcinogenese, og hæmmende Hh signalering sikkert vender begge processer, selv når fibrose og HCC er avancerede

Henvisning:. Philips GM, Chan IS, Swiderska M , Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) Hedgehog Signaling Antagonist Fremmer Regression af både lever fibrose og hepatocellulært carcinom i en murin model af primær leverkræft. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10,1371 /journal.pone.0023943

Redaktør: Pranela Rameshwar, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 13 juni, 2011; Accepteret: 27 Juli 2011; Udgivet 2. september, 2011

Copyright: © 2011 Philips et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, delvist af National Institutes of Health (NIH) RO1 DK077794, NIH RO1 AA010154, NIH T32 DK007568 og NIH T32 CA071341. En del af det billeddannende blev udført ved Duke Center for In Vivo Microscopy, støttet, delvist af National Center for Research Resources National Biomedical Technology Research Center (P41 RR005959) og National Cancer Institute Small Animal Imaging Resource Program (U24 CA092656). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er en snigende kræft, der tegner sig for op til 1 million dødsfald om året og er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Skrumpelever, en konsekvens af progressiv leverskader og fibrose, er den største enkeltstående risikofaktor for HCC [2]. En ændret sårheling reaktion på kronisk leverskade, med deraf dysreguleret aktivering af myofibroblaster og progenitor cellepopulationer, har været impliceret i cirrose patogenese og eventuel carcinogenese [3].

tab af funktion mutationer i hepatocyt canaliculære phospholipid flippase MDR3 (ABCB4) er blevet forbundet med en lang række humane galde sygdomme, herunder progressiv familiær intrahepatisk kolestase type 3 (PFIC3), kolestase af graviditet, lægemiddelinduceret kolestase og en voksen biliær cirrhose med funktioner svarende til primær skleroserende cholangitis (PSC) [4], [5], [6], [7]. Mus med en målrettet deletion af Mdr2 (den murine ortolog af MDR3) mangler leverspecifik P-glycoprotein, der transporterer phosphatidylcholin (PC) gennem den canaliculære membran. Fraværet af phospholipider i galde resulterer i progressiv skleroserende cholangitis med tilhørende portal inflammation, kanalsystem, proliferation og portal fibrose. Leverskade manifesterer kort efter fødslen og hepatocellulære karcinomer dukke spontant mellem 50 til 60 ugers alderen [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. I modsætning til xenograftmodeller der er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismer of- og behandlinger uden- HCC, Mdr2

– /- mus tilvejebringe en model, der paralleller den naturlige udvikling af HCC på en baggrund af kronisk inflammation, leverskader og fibrose [15] .

Genekspression analyser i Mdr2-mangel mus og heterozygote kontroller har vist robust og vedvarende induktion af flere adaptive mekanismer, der styrer cellulære reaktioner relateret til oxidativ stress, betændelse, lipid metabolisme, og spredning, hvilket fik spekulationer om, at disse processer bidrage til hepatocarcinogenese [16]. Selv om det ikke formelt vurderet af tidligere undersøgelser af Mdr2-manglende mus, en anden pathway, som kan spille en rolle i fibrose-associeret hepatocarcinogenese er Hedgehog (Hh), fordi Hh-signalering har været impliceret i både fibrogene reparation af leverskade og HCC.

Hh pathway er en evolutionært bevaret signalvej, der aktiveres, når Hh ligander (Sonic hedgehog og indisk pindsvin) binder til Patched (PTC), et transmembrant receptor, som udtrykkes på overfladen af ​​Hh-responsive celler. Ved ligandbinding, er Ptc inaktiveret, lindre dens undertrykkelse af Smoothened (Smo), en trans-membranprotein, der medierer Hh signalering inde i cellen. Smo aktivering kulminerer i den nukleare lokalisering af Gli-familie transkriptionsfaktorer, Gli1, Gli2, og GLI3, som igen, regulerer nedstrøms genekspression. Den vej er inaktiv i normal lever [17], [18], men bliver reaktiveret som en reparation mekanisme i kronisk leverskade [19], [20], [21], [22], [23]. Hh ligander fremmer vækst og levedygtighed myofibroblaster, ophobning af hvilket fører til unormal liver reparation, fibrose og eventuel cirrose [24], [25]. Hh ligander tjener også som levedygtighed og proliferative faktorer for liver epithelial progenitorer, og udvidelse af dette rum er blevet forbundet med dannelse og vedligeholdelse af hepatocellulære karcinomer [26]. Den mulighed, at Hh-aktivering bidrager til hepatocarcinogenese understøttes af den omstændighed, at Sonic hedgehog (Shh) ligand ekspression, ses hos ca. 60% af human HCCs, og ekspression af de Hh-regulerede gener, Gli1 og Ptc, forekommer i 50% af humane tumorer [27], [28], [29], [30].

Baseret på disse observationer, vi postulerede, at Hh-aktivering bidrager til patogenesen af ​​både leverfibrose og fibrose-associeret HCC. For at teste denne hypotese, behandlede vi alderen Mdr2-deficiente mus med Hh inhibitor, GDC-0449, en lille-molekyle inhibitor, som binder til Smoothened (SMO). Denne agent blev valgt på grund af sin menneskelige sikkerhedsprofil i fase 1 forsøg, samt dens effektivitet i faste organer tumorer som basalcellekræft (BCC) og medulloblastom [31], [32], [33]. Vores mål var at bestemme, hvorvidt mus med fremskreden leversygdom og HCCs ville tolerere forbedringer Hh pathway hæmning og erfaring i lever fibrose og /eller tumor byrde.

Metoder

Mus

Mdr2

– /- mus var en gave fra Dr. Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical center, Boston, MA). Alder matchede FVB /NJ vildtype-mus blev opnået fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle mus blev opstaldet med en 12-timers lys-mørke cyklus og givet vand og standard chow

ad libitum

. På aldre, 2, 4, 12, 36 52 og 62-uger blev musene aflivet under generel anæstesi. Levervægt og kropsvægt blev registreret, serum og levervæv blev opsamlet. Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg som er reguleret af National Institute of Health ‘s “Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr”, Duke University Animal Welfare Assurance Number A3195-01.

Serum AST /ALT beslutsomhed

Serum aspartataminotransferase (AST) og alaninaminotransferase (ALT) blev målt ved hjælp af kits kommercielt tilgængelige fra BIOTRON Diagnostics (66-D og 68-D henholdsvis, Hemet, CA) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger .

Western Blot

Samlet protein blev udvundet snap frosset hel levervæv i RIPA buffer. Prøverne blev samlet efter alder (2-4 prøver pr aldersgruppe) bortset fra som anført. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet. Membraner blev probet med de følgende primære antistoffer: Sonic hedgehog (sc-9024; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Indian hedgehog (ab39634; Abcam), β-actin (sc-47.778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732-292462, Genway, San Diego, CA). Alle antistoffer blev fortyndet 1:1000 og blev inkuberet ved 4 ° C natten over. Western blot billeder blev erhvervet ved hjælp af en FluorChem HD2 digitalt mørkekammer-system (Cell Biosciences, Santa Clara, Californien).

Immunhistokemi

4 um formalin-fikseret, blev paraffinindlejrede prøver afvokset og rehydreret. Til bedømmelse vævsarkitektur blev objektglassene farvet med hematoxylin og eosin (H Invitrogen, Carlsbad, CA) i 10 minutter. Snit blev blokeret (Dako Envision, Carpinteria, CA) og inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C: glioblastoma-2 (Gli-2; 18-732-292462; 1:2000; Genway, San Diego, CA); cytokeratin 19 (Troma-III Hybridoma Bank, Iowa City, IA, 1:500); α-fetoprotein (AFP) (Dako, 1:1000); Indisk pindsvin (Abcam, 1:750, Cambridge, MA); Polymer-HRP anti-kanin (K4003, Dako) eller anti-muse (K40011; Dako) eller MACH3 muse AP polymer kit (MP530, Biocare Medical, Concord, Californien, USA) blev anvendt som sekundære antistoffer. 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) Substrat kromogen System (K3466, Dako) og /eller Ferangi Blå (Biocare) blev anvendt i proceduren afsløring. Udeladelse primære antistoffer fra reaktionerne elimineret farvning, som demonstrerede farvning specificitet. Billeder blev erhvervet på et Olympus IX71 (Tokyo, Japan) inverteret mikroskop ved hjælp af DP2-BSW (Olympus) erhvervelse billede softwaresystem.

Kvantitative Real-Time Reverse Transcription PCR

RNA blev isoleret fra hel lever, samt fra reseceret tumorprøver havde standard TriZol ekstraktion som tidligere beskrevet [24]. En tabel med primere er omfattet af det supplerende materiale.

morfometri

formalin-fikserede lever og tumor sektioner blev farvet for CD44 og osteopontin som beskrevet ovenfor, og blev kvantificeret ved morfometrisk analyse med MetaView software (Universal Imaging, Downington, PA). Et minimum af fem tilfældigt udvalgt 10 × eller 20 × felter /afsnit blev evalueret for hver mus.

Kvantitative immunhistokemisk analyse

formalin-fikserede lever og tumor sektioner blev costained for Gli2 og CK19. Et minimum på 5 kanalsystem regioner, 20 × felter per sektion, blev bedømt for hver mus ved at tælle antallet af celler co-mærket.

Nedsat hydroxyprolin-assay

hydroxyprolinindholdet i hel lever prøver blev kvantificeret kolorimetrisk som tidligere rapporteret [34]

GDC-0449 behandling

i den indledende dosis-finding kohorte af dyr, 16 Mdr2

-. /- mus (alder 57- 68 uger) blev tildelt til behandling med vehikelkontrol (DMSO, n = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). Mandlige-kvindelige forhold blev afbalanceret mellem grupperne. GDC-0449 (Selleck Chemicals, Houston, TX) var frisk udgjorde dagligt i DMSO. Alle mus fik en daglig intraperitoneal injektion i 9 dage. På dag 10 blev dyrene aflivet. Prøver blev opsamlet som ovenfor. En anden gruppe på 20 Mdr2

– /- mus (alder 51-59 uger gamle) blev underkastet hele kroppen magnetisk resonans at vurdere tumorbelastning og derefter par af mus med sammenlignelige tumorbyrder blev tildelt til behandling med enten DMSO (kontrol, n = 10) eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). Lægemidler blev leveret som beskrevet ovenfor; MRI scanning blev gentaget efter 9

th behandlingsdag; Musene blev aflivet for obduktion og væv høst

Patologi

H . E og sirius rød farvning af leveren sektioner blev evalueret ved et bord-certificeret patolog. Repræsentative sektioner af tumor- og ikke-tumorvæv blev undersøgt. Tumorvæv blev defineret som groft synlige knuder, der var mindst 10 mm i størrelse og resektabel.

Abdominal magnetisk resonans

Dyr blev tildelt en blændende kode, som blev opretholdt under magnetisk resonans (MR ) indsamling og analyse af data. MR muselever billeddannelse blev udført på et 7T Bruker Biospec 70/30 horisontal boring systemet (Billerica, MA). Dyrene blev let bedøvet under isofluoran med løbende overvågning og vedligeholdelse af fysiologiske parametre i hele imaging session (-60 min for hvert dyr). Axial og koronale 2D T2-vægtede hurtig spin-ekko billeder (TURBO-RARE, TE /TR = 11/4200 ms med 1 mm skive tyk, matrix = 256 × 256 og FOV på 2,4 cm x 2,4 cm, 5 gennemsnit, 0,0 mm interslice gap) billeder blev først opnået for screening formål og supplerende anatomisk information. For rettet tumor volumetrisk analyse 64 sammenhængende 500 um tyk 3D FSE proton tæthed billeder forudindtaget mod T1 vægtning (TURBO-RARE, TE /TR = 9/1500 ms, matrix = 256 × 256 × 64 og FOV 2,2 cm × 2,2 cm × 2,2 cm, blev 25 minutter varighed) erhvervet. Alle billeddiagnostiske sekvenser blev udført ved hjælp af respiratorisk gating.

Volumetrisk analyse fra MR datasæt blev udført i Osirix software, et open source billedbehandling applikation udviklet og vedligeholdt af Pixmeo (Genève, SUI). Lever tumorer blev manuelt segmenteret i hvert dyr med en bord-certificeret radiolog (blindet behandling) efterbehandling. Udvalgte områder blev revideret for konsistens på koronale og sagittale repræsentationer, og cross-korreleret med aksiale 2D FSE billeder. For volumetrisk blev to separate målinger volumen opnået for hver læsion, med den gennemsnitlige mængde derefter taget. Pålidelighed mellem (kappa værdi) var = 0,97. T1 og T2-vægtede scanning-sekvenser blev udført.

statistiske analyser

Resultater udtrykt som middelværdi ± SD. Betydning etableret ved hjælp af t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante, når p 0,05

Resultater

Progressiv ophobning af Hh-responsive celler i Mdr2

– /- mus

Forskellige former for akut og kronisk. leverskade inducerer hepatisk ekspression af Hh ligander og aktivering af Hh-responsive celler. Serum niveauer af AST og ALT var konsekvent højere i Mdr2

– /- mus end aldersmatchede kontroller (Figur S1), bekræfter, at knockout mus havde kronisk leverskade. Således vi undersøgte lever fra Mdr2

– /- mus for Hh-aktivering. Sammenlignet med leveren proteinlysater fra vildtype kontroller, lysater fra Mdr2

– /- mus viste en stigning i Sonic hedgehog (Shh) og Indian hedgehog (Ihh) ved Western blot analyse. Dette var tydelig på det første tidspunkt undersøges (2 uger efter fødslen) og opretholdes under hele levetiden for dyrene (op til 64 uger gamle) (figur 1A). Immunhistokemi for Hh-regulerede transskription faktor, Gli2, viste progressiv, aldersrelateret akkumulering af celler med nukleare Gli2 farvning i Mdr2

– /- mus. Sådanne Gli2-positive celler inkluderet stromaceller samt hepatocytic og kanalsystem celler (Figur 1B-C). Sammen antyder disse data, at Hh pathway aktiveres i kronisk skadede lever fra Mdr2-mangel mus, hvilket resulterer i gradvis udvidelse af forskellige Hh-responsive cellepopulationer.

A. Western blot-analyse for Sonic Hedgehog (SHh) og indiske Hedgehog (Ihh) i hele lever ekstrakter samlet fra unge Mdr2

– /- mus (2-16 uger gamle), gamle (36-64 uger gamle) Mdr2

– /- mus og aldersmatchede kontroller (n = 3-5 mus /gruppe /tidspunkt). Et repræsentativt Western blot der viser resultater fra unge mus er vist. Gennemsnit ± SEM data fra ældre mus tegnes. B. repræsentant leversnit farvet for at demonstrere Gli2 fra unge (4 uger gamle), midaldrende (36 uger gamle) og gamle (52 uger gammel) Mdr2

– /- mus. Lille Gli2 ekspression blev bemærket i vildtype mus på alle alderstrin, så resultaterne fra et repræsentativt 36 uger gamle vildtype mus er vist. (10 ×) C. Kvantitativ Gli2 immunhistokemiske data. Antallet af nukleare Gli2 (+) celler blev talt i mindst 5 høj effekt felter (HPF) pr liver sektion i Mdr2

– /- mus og kontroller vildtype ved 4, 36 og 64 ugers alderen (n = 3 -4 mus /gruppe /tidspunkt) og gennemsnit ± SEM tegnes. * P 0,05, ** p 0,01 i Mdr2

– /- grupper vs. respektive kontroller

Behandling af Mdr2

– /- mus med Smoothened inhibitor, GDC-. 0449, er sikkert og nedsætter Hedgehog pathway signalering

for at bestemme den passende dosis af GDC-0449, en pilotundersøgelse blev udført med 16 alderen (57-68 uger gamle) Mdr2

– /- mus. Dyr blev givet en daglig intraperitoneal injektion af 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6), eller DMSO vehikelkontrol (n = 5) i 9 dage og derefter aflivet. Der var ingen statistisk forskel i dødeligheden mellem kontrol og høj dosis (40 mg /kg) GDC-0449 grupper. Ved aflivning, lever /kropsvægt-forholdene af mus i de tre grupper var også lignende, hvilket antyder, at en relativt kort forløb systemisk behandling med GDC-0449 ved 40 mg /kg tåles godt af mus med fremskreden leversygdom og HCC (figur S2A -B). Western blot-analyse af lever lysater fra denne kohorte af dyr viste, at GDC-0449-behandling forårsagede et fald i Shh ligand niveauer ved den højere dosis, og Gli2 ekspression dæmpning ved begge doser (figur S2C).

Hedgehog signalhæmning med GDC-0449 ophæver virkningerne af Hh-signalering på target genekspression

på baggrund af de data, der er erhvervet i vores doseringsforsøg, en anden kohorte af Mdr2

– /- mus (51-59 uger gamle ) blev tildelt til behandling med vehikel (DMSO, n = 10) eller 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) via daglig ip injektion i 9 dage. Samlet overlevelse mellem de to grupper i den anden gruppe var lig med ingen dødsfald i DMSO-behandlingsgruppen og 1 dødsfald i GDC-0449 behandlingsgruppen sekundært til iatrogen skade. Både leverparenkym og tumorer af behandlede mus udviste nedsat ekspression af Hh-vejen target Gli2 (figur 2A-B). Real-time PCR-analyse af operativt fjernede tumorer afslørede, at GDC-0449 behandling frigivet de inhiberende virkninger af Hh-signalering på PPARa, medfører en væsentlig forøgelse i genekspression (figur 2C). Behandling med GDC-0449 forårsagede også et signifikant fald i ekspression af Gli1, anden Hh målgen (figur 2D).

A. Lever sektioner farvet for Gli2 fra repræsentative DMSO og GDC-0449- behandlede mus (40 ×). Kvantitative Gli2 immunhistokemi data i ikke-tumor lever fra mus behandlet med DMSO eller GDC-0449 (n = 9-10 /gruppe) tegnes som gennemsnit ± SEM (

** p. 0,01

Antallet af kanalsystem celler med Gli2 positiv farvning blev talt i hver portal tarmkanalen /afsnit under 40 × forstørrelse. B. Tumor sektioner fra de samme mus blev også farves for at demonstrere Gli2. Resultater fra repræsentative DMSO og GDC-0449-behandlede mus vises. Kvantitativ Gli2 immunhistokemi data blev genereret ved at tælle nukleare Gli2 positiv kanalsystem og hepatocytic celler i tumor sektioner under 40 × forstørrelse Resultaterne er afbildet som gennemsnit ± SEM Gli2-positive celler /40 × høj effekt felt (** p 0,01). C-D Kvantitativ omvendt transskription-PCR (QRT-PCR) analyse af hele leveren RNA fra DMSO (åben bar) og GDC-0449 (sort bjælke) behandlede mus. C. PPAR-γ, et gen, der normalt undertrykkes af Hh-signalering. D. Gli1 ., et gen, der er fremkaldt af Hh signalering Middelværdi ± SEM tegnes (** p 0,01)

Hedgehog signalering hæmning med GDC-0449 reducerer leverfibrose

Mdr2

– /- mus demonstrerede progressive aldersrelaterede stigninger i hepatisk ekspression af alfa-glatmuskelactin (α-SMA), en markør for myofibroblastisk hepatiske stjerneformige celler (figur 3A, top panel). Dette blev ledsaget af forøget ekspression af pro-fibrogene faktorer, såsom transformerende vækstfaktor TGF-β og blodpladeafledt vækstfaktor PDGF-β (figur S3A-B), og progressiv fibrose, som det fremgår af Sirius red-farvning (figur 3A, bottom panel) og kvantificering af den hepatiske hydroxyprolinindholdet (figur 3B). Behandling med GDC-0449 faldt a-SMA-udtrykkende myofibroblastisk celler, hepatisk udtryk af TGF-β og PDGF-β, Sirius rød farvning, og hydroxyprolinindholdet, viser, at Hh pathway hæmning nedsat lever- fibrose (figur 3C-D og Tal S3C- D).

A. Immunohistokemisk farvning for α-SMA (øverste panel) og Sirius red (nederste felt) i sektioner af ikke-tumor liver fra repræsentative alders-matchede Mdr2

– /- og vildtypemus (10 ×). B. Pooled Hepatisk hydroxyprolinindholdet af 2-

52 uger gamle

vildtype (WT) og alder-matchede Mdr2

– /- mus (n = 3-5 /gruppe). Resultater i Mdr2

– /- mus blev normaliseret til den for alderskategori WT mus og plottes som fold forandring. Data er vist som middelværdi +/- SD (* p 0,05) C. Ikke-tumor leversnit farvet for α-SMA (øverste panel, 20 ×) og Sirius red (bundpanel, 10 ×) i repræsentative DMSO og GDC – behandlet Mdr2

– /- mus. D. Heptic hydroxyprolinindholdet af DMSO og GDC- behandlede mus (n = 9 /gruppe). Resultater i GDC-0449-behandlede mus blev normaliseret med den for DMSO-vehikel-behandlede mus og plottes som gange ændring. Data er vist som Mean +/- SEM (* p 0,05)

Hedgehog signalering hæmning med GDC-0449 nedsætter ophobning af leveren stamceller

Som svar til skade, stamfader. populationer i leveren formere. Derfor immunhistokemisk analyse for progenitor markører, såsom cytokeratin-19 (CK-19) og α-fetoprotein (AFP), viste aldersrelaterede stigninger i Mdr2

– /- mus (figur 4A). Co-farvning for CK19 og Gli2 bekræftede, at progenitorpopulationen var Hh responsiv (figur 4B). Ved behandling med GDC-0449, progenitor markører faldt (figur 4C), hvilket indikerer, at Hh-signalering nødvendig for at opretholde progenitorpopulationer under tumorigenese, og at Hh inhibering var tilstrækkelig til at indsnævre størrelsen af ​​progenitorpopulationer selv i mus med fremskreden HCC.

A. Immunhistokemisk farvning af leveren sektioner fra repræsentative, alder-matchede Mdr2

– /- og vildtype mus til progenitor markører, cytokeratin-19 (CK-19) (top paneler) og a-fetoprotein (AFP) (nederste paneler) (20 ×). B. repræsentant mikrograf af en portal triade i leveren af ​​en Mdr2

– /- mus, hvilket viser co-lokalisering af CK-19 (blå) og Gli2 (brun) i kanalsystem rum (40 ×). C. Kvantitativ Gli2 og CK19 immunhistokemi i DMSO og GDC-0449-behandlede Mdr2

– /- mus (n = 9-10 /gruppe). Antallet af Gli2 og CK19 dobbelt-positive kanalsystem forekommende celler blev talt i tumorer under 20 × forstørrelse. Middelværdi ± SEM dobbeltsenge (+) celler t pr høj effekt felt (HPF) tegnes (* p 0,05) D. QRT-PCR-analyse af AFP i tumor RNA fra mus behandlet med DMSO (åben bar) eller GDC-0449 (lukket bar) resulterer i GDC-0449-behandlede mus blev normaliseret til den for mus behandlet med DMSO køretøj og tegnede som gennemsnit ± SEM (* p. 0,05)

Faldende Hedgehog signalering reducerer ekspressionen af osteopontin og forhindrer akkumulering af osteopontin-responsive (CD44-positive) celler

Stem /progenitor cellepopulationer for mange typer cancer, herunder HCC, menes at være beriget med celler, der udtrykker CD44, en receptor for stilken cellevækstfaktor, osteopontin [35], [36]. Osteopontin udtryk er reguleret af Hh signalering [37]. Derfor har vi undersøgt virkningerne af GDC-0449 på osteopontin og dets receptor, CD44. Immunhistokemi og kvantitativ morfometri viste, at hæmning af Hh vej med GDC-0449 faldt betydeligt osteopontin farvning inden primære levertumorer (figur 5A). Lignende behandlingsrelaterede fald i CD44 + tumorceller blev også noteret (figur 5B). Genekspression analyse viste, at ekspressionen af ​​både osteopontin og CD44 mRNA også tendens til at falde i GDC-0449-behandlede mus (figur 5C). Sammen disse resultater tyder på, at Hh signalering kan regulere formodede leverkræft stamceller /stamceller ved modulerende tilgængeligheden af ​​osteopontin.

A. Tumor sektioner fra repræsentative DMSO og GDC-0449 behandlede Mdr2

– /- mus blev farvet for at demonstrere osteopontin (OPN) Repræsentative sektioner vises (

Right panel

). OPN farvning blev kvantificeret ved morfometrisk analyse af mindst 5 HPF pr tumor sektion med 20 × forstørrelse (n = 5 mus /gruppe). Resultater i GDC-0449-behandlede gruppe blev normaliseret til den for gruppen behandlet med DMSO køretøj og plottes som fold forandring. Data er vist som gennemsnit ± SEM (** p 0,01). B. immunhistokemisk farvning for osteopontin receptoren, CD44, i peri-tumorvæv repræsentative DMSO og GDC-0449- behandlede Mdr2

– /- mus. (

Right panel

) CD44 farvning blev kvantificeret ved morfometrisk analyse som beskrevet i A. Resultater i GDC-0449-behandlede mus blev normaliseret til de af vehikelbehandlede kontroller og plottes som gennemsnit ± SEM (** p 0,01). C. QRT-PCR-analyse af lever tumor RNA fra DMSO (åben bar) og GDC-0449- (lukket bar) behandlet Mdr2

– /- mus for OPN (til venstre) og CD44 (højre). Efter normalisering til resultater i DMSO-behandlede gruppe, Middelværdi ± SEM blev tegnet (* p 0,05)

MR og histologiske tegn på liver tumor involution efter GDC-0449 behandling

for at vurdere de potentielle virkninger af ændringer i matrix og stamceller på HCC, blev før og efter behandling tumorvolumener analyseres ved hjælp af magnetisk resonans (figur 6A-B). En analyse af tumorer i mus uden åbenlyse metastaser viste, at tumorvolumener faldt i mus, der modtog en 9 dages forløb med GDC-0449-behandling, mens vehikelbehandlede dyr dokumenteret vedvarende tumorvækst (figur 6C; -6.7% + /- 11,7% vs 22,7% +/- 9,1%, p = 0,03). Disse data korrelerede med obduktionsfund: Kun 56% af GDC-0449-behandlede mus havde synlige liver tumorknuder, sammenlignet med 80% af DMSO mus (tabel 1). Desuden både MR og obduktioner viste en nedsat antal metastaser i GDC-0449-behandlede mus sammenlignet med bærerbehandlede kontroller (tabel 1). Histologisk analyse af H Figur 6D, øverste panel), microvesicular steatose (40% vs. 0%, figur 6D, midterste panel), acidofil nekrose og degenerative cytoplasmatisk ændringer (70% vs 40%, figur 6D, bundpanel) i sammenligning med tumorer fra bærerbehandlede dyr. Således resultater om MRI, obduktion, og lever histologi var konsekvent og viste, at Hh pathway hæmning forårsaget betydelig regression af primær og metastatisk HCC.

A. Repræsentant tværsnit billede af intrahepatisk tumor som identificeret ved kontrast-forstærket MRI efter GDC-0449 behandling. B. repræsentant MRI-billeder af sagittale, koronale, og skrå perspektiver anvendt til volumetrisk analyse. C. Ændring i tumorvolumen blev kvantificeret ved edb genereret volumetriske målinger og plottes som gennemsnit ± SD (* p 0,05). D. mikrografier af repræsentative histologiske forandringer som følge af, GDC-0449, behandling. Topplade viser tumornekrose; midterste panel viser fedtdegeneration; nederste panel viser vakuoliserede tumorceller med pyknotiske kerner

Diskussion

Vi studerede Mdr2

-. /- mus til at afgøre, hvorvidt aktivering af HH pathway bidrager at hepatocarcinogenese under kronisk fibroserende leverskade. Mdr2-mangel mus mangler en phospholipid flippase der er nødvendig for normal galde dannelse, og dermed udviser leverskade og kanalsystem spredning fra en ung alder. Alle ramte mus i sidste ende udvikle betydelig leverfibrose og metastatisk HCC. Vores resultater viser, at denne patologi er ledsaget af progressiv aktivering af Hh-vejen. Indførelse af en specifik hæmmer af nøglen Hh signalering mellemliggende, Smoothened, reduceret pathway aktivitet og bevist, at vedvarende Hh signalering var forpligtet til at opretholde de udvidede bestande af leveren myofibroblaster og forfædre, der havde akkumuleret i de beskadigede lever. Desuden behandler alderen Mdr2-deficiente mus (som allerede havde fremskreden leverfibrose og HCC) med Hh inhibitor signifikant reduceret leverfibrose og tumorbelastning, hvilket demonstrerer for første gang, at inhibering Hh-signalering har klinisk relevant, terapeutisk værdi for både leveren fibrose og HCC. Endnu mere spændende er bevis for, at prohibitive virkning på hepatisk tumorvækst

in vivo

vedrører både intra-hepatisk HCC og fjernmetastaser.

Desuden vores resultater giver indsigt i nogle af de underliggende mekanismer involveret. Hepatisk produktion af Hh ligander blev forøget hos mus, der udviklede progressiv leverfibrose og invasiv HCC. Disse mus viste også konsekvent højere serum aminotransferaseniveauer i overensstemmelse med andre beviser, at Mdr2 mangel provokerer kronisk hepatocyt skade [38], [39]. Forskellige stressfaktorer, der reducerer hepatocyt levedygtighed har vist sig at inducere produktion og frigivelse af Hh ligander af sårede hepatocytter [40], [41]. Således hepatocyt skaden sandsynligvis en af ​​de faktorer, der øger Hh ligand generation i mdr2-mangel lever. Myofibroblastisk celler og kanalsystem-type stamfædre, der gradvist ophobes i kronisk skadede lever producerer også Hh ligander, samt andre faktorer, såsom PDGF-β, der stimulerer autokrin-parakrin syntese af Hh ligander [20], [42].