PLoS ONE: Gefitinib Analog V1801 fremkalder apoptose af T790M EGFR-huser Lung Cancer Cells ved opregulering af BH-3 Kun Protein Noxa

Abstrakt

Behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) med lægemidler rettet mod den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR), f.eks gefitinib og erlotinib, vil i sidste ende mislykkes på grund af udviklingen af ​​sekundære mutationer såsom T790M i EGFR. Strategier til at overvinde denne modstand er derfor et presserende behov. I denne undersøgelse syntetiserede vi et dusin af hidtil ukendte gefitinib analoger og vurderet deres virkninger på L858R /T790M-EGFR huser NSCLC-celler, og rapporterede, at en af ​​disse gefitinib mimetika, N- (2-brom-5- (trifluormethyl) phenyl) – 6-methoxy-7- (3- (piperidin-1-yl) propoxy) quinazolin-4-amin (i det følgende, V1801), udløste apoptose af NSCLC-celler og overvandt gefitinib-resistens i mus inokuleret med NCI-H1975-celler. Selvom V1801 kun moderat inhiberet EGFR-kinaseaktivitet, det markant inducerede ekspressionen af ​​BH3-only protein Noxa, og Noxa silencing signifikant reduceret V1801-induceret apoptose af NCI-H1975-celler. Det viste, at V1801 forstyrret ekspression af transkriptionsfaktoren c-Myc og det ekstracellulære signal reguleret kinase (Erk) pathway. V1801 i kombination med proteasominhibitoren bortezomib udøvet øget cytotoksicitet i NCI-H1975 celler muligvis på grund af forstærket induktion af Noxa udtryk. Disse data indikerer, at gefinitib analoger med svag EGFR-inhiberende aktivitet kan overvinde lægemiddelresistens via aktivering af BH-3 kun pro-apoptotiske proteiner, og V1801 kan have terapeutiske potentialer for NSCLC

Henvisning:. Zhang B, Jiao J , Liu Y, Guo LX, Zhou B, Li GQ, et al. (2012) Gefitinib Analog V1801 fremkalder apoptose af T790M EGFR-huser Lung Cancer Cells ved opregulering af BH-3 Kun Protein Noxa. PLoS ONE 7 (11): e48748. doi: 10,1371 /journal.pone.0048748

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: Februar 27, 2012; Accepteret: 1 oktober 2012; Udgivet: November 21, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Key Program for Basic Research (2012CB910800, 2010CB833200, 2010CB529201), National Natural Science Foundation (nr 81.071.930, 81.171.925, 20.972.160 og 21.172.220), den Særlige Fond præsident og Key Project of Knowledge Innovation Program for Chinese Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), og National store videnskabelige og teknologiske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de hyppigste neoplasme verdensplan, bestående 17% af de samlede sager nye kræft og 23% af de samlede kræftdødsfald hos mænd [1]. Behandling af lungekræft er bestemt af den histologiske type og stadium ved diagnose, og hovedsagelig omfatter kirurgi, platin dublet terapi, strålebehandling og målrettet terapi, med en kun 15% af fem år samlede overlevelsesrate for alle faser kombineres [2]. Den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) -targeting midler, herunder EGFR-specifikke antistoffer og tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) såsom gefitinib og erlotinib, gavne en del af patienterne især dem aldrig-røg og af asiatisk oprindelse [3] – [5] . Dog vil behandling med gefitinib og erlotinib vinder mislykkes på grund af udviklingen af ​​erhvervet lægemiddelresistens er resultatet af amplifikation af MET proto-onkogen eller threonin-til-methionin aminosyresubstitution i position 790 (T790M) af EGFR, hvilket er påvist i 50% af klinisk resistente patienter [6], [7]. Den T790M mutation i EGFR påvirker gatekeeper resten i det katalytiske domæne af kinasen, der svækker interaktionen af ​​inhibitorerne med målet [6]. Nylige undersøgelser viser, at T790M mutation er en “generisk” resistensmutation som vil reducere styrken af ​​enhver ATP-kompetitiv kinaseinhibitor [8]. I T790M EGFR-huser celler, hæmning af EGFR ved i øjeblikket tilgængelig andengenerations EGFR-TKI’er er ikke tilstrækkeligt til fysiologisk forhindre fremkomsten af ​​celler, der stadig er afhængige af EGFR signalering [9]. Derfor strategier for at overvinde EGFR TKI modstand forbliver praktiske behov for at forlænge overlevelsestiden for patienter med lungekræft.

unddrage apoptose er et af kendetegnene for kræft, og målrette apoptose er blevet en kræft terapeutisk strategi [10 ]. De kritiske apoptose regulatorer, B-celle CLL /lymfom-2 (BCL-2) og dets familie-proteiner, kan opdeles i pro- og anti-apoptotiske medlemmer, og de pro-apoptotiske proteiner kan opdeles i proapoptotiske proteiner og BH3-only underfamilier baseret på deres strukturelle lighed af forskellige Bcl-2-homologi (BH) domæner [11], [12]. Noxa er et BH3-only protein, er impliceret i apoptose forbundet med DNA-ødelæggelse, hypoxi eller udsættelse for proteasominhibitorer [13] – [15]. Ekspression af Noxa i Hela-celler fremmer stærkt celle apoptose, mens den blokerer den endogene Noxa undertrykker programmeret celledød [16]. Akkumulering af Noxa sensibiliserer apoptose ved at binde til og neutralisere antiapoptotisk protein Mcl-1, hvilket fører til frigivelse og efterfølgende aktivering af Bax (BCL2-associeret X protein) eller BAK (BCL2-antagonist /killer) fra Bax /Bak-Mcl-1-kompleks [13], [17], [18]. Ud over sin rolle i apoptose, Noxa også regulerer forskellige cellulære funktioner autophagic celledød og metabolisme [19], [20]. Apoptose-associeret Noxa aktivering primært opnås gennem transkriptionel opregulering af p53, E2F1, HIF1α, c-myc, ATF3, og ekstracellulært signal reguleret kinase (Erk) vej [14] – [16], [21] – [23]. Men identiteten af ​​de kritiske BH3-kun proteiner, og mekanismen for deres indsats efter behandling af forskellige apoptotiske stimuli tilbage, at være fuldt løst.

For at screene for agenterne at overvinde gefitinib-modstand, vi her syntetiseret en antallet af nye gefitinib strukturelle analoger og testet deres hæmmende på EGFR-aktivitet og spredning af NCI-H1975 celler [24], som havnen L858R /T790M-EGFR [6], [7], [25] og vildtype MET uden genomisk amplifikation [26], der er resistente over for gefitinib og erlotinib. Vi fandt en gefitinib mimetisk, N- (2-brom-5- (trifluormethyl) phenyl) -6-methoxy-7- (3- (piperidin-1-yl) propoxy) quinazolin-4-amin (i det følgende, V1801), moderat inhiberet EGFR-kinaseaktivitet men undertrykte signifikant celleproliferation og apoptose i T790M EGFR-huser ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler in vitro og in vivo. Vi viste desuden, at opregulering af Noxa underlain V1801 aktivitet på NSCLC celler.

Materialer og metoder

Agenter

De gefitinib analoger (tabel 1), blev syntetiseret af vores kemi gruppe, og

N

– (3-chlor-4-fluor-phenyl) -7-methoxy-6- (3-morpholin-4-vlpropoxv) quinazolin-4-amin (gefitinib) blev købt fra J K Chemical Ltd. Alle forbindelserne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) for at gøre lager koncentration på 10 mM og opbevares ved -20 ° C. 3- (4,5-dimethylthiahiazozy1) -3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) blev købt fra Sigma. Bortezomib blev opnået fra Millennium Pharmaceuticals Inc. Annexin V /propidiumiodid (PI) Apoptose Detection Kit blev opnået fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

Antistoffer

antistofferne anvendt i denne undersøgelse var som følger: anti-β-Actin (Sigma); anti-Casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12), anti-Casp-3 (3G2), anti-PARP, anti-phospho-p44 /42 MAPK, anti-EGFR (L858R), anti-STAT3 , anti-phospho-STAT3 (Cell signalering); anti-c-myc, anti-Noxa, anti-phospho-EGFR (Y1173), anti-Pakt og AKT (Santa Cruz Biotechnology); anti-ERK2 (Abcam); anti-kanin eller anti-muse HRP-konjugeret sekundært antistof (Pierce). Detektion blev udført ved anvendelse af et kemiluminescerende Western detektion kit (Cell Signaling).

Cellekultur

lungekræft cellelinier NCI-H1975, A549 og HCC827 blev opnået fra American Tissue Culture Collection. A549-celler blev dyrket i Dulbecco modificeret Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin. NCI-H1975 og HCC827 celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin.

RNA-fremstilling og RT-PCR

total RNA af cellerne blev isoleret ved anvendelse af TRIZOL Reagent (Invitrogen) og phenol-chloroform-ekstraktion fremgangsmåde ifølge producentens anvisninger. Totalt RNA (2 ug) blev annealet med tilfældige primere ved 65 ° C i 5 minutter. CDNA’et blev syntetiseret ved anvendelse af en 1st-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Til PCR-amplifikation, primere er som følger: Actin, fremadrettet primer: 5′-CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC’-3 ‘, revers primer: 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACATC’-3′; Puma, forward primer: 5′-GTCCTCAGCCCTCGCTCT-3 ‘; reverse primer: 5’-CTAATTGGGCTCCATCTCG-3 ‘; Bim, forward primer: 5’-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3 ‘; reverse primer: 5’-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3 ‘; Bd-XL, forward primer: 5’-GGTGGGAGGGTAGAGTGGATGGT-3 ‘; reverse primer: 5’-GGAAAGCGTAGACAAGGAGATGC-3 ‘; MCL-1, forward primer: 5’-CACGAGACGGTCTTCCAAGGCATGCT-3 ‘; reverse primer: 5’-CTAGGTTGCTAGGGTGCAACTCTAGGA-3 ‘; Noxa, forward primer: 5’-AAGAAGGCGCGCAAGAAC-3 ‘; reverse primer:. 5’-CGTGCACCTCCTGAGAAAAC-3 ‘

Western blot assay

Celler blev suspenderet i lysebuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, komplet proteaseinhibitorcocktail) og klares ved centrifugering til opnåelse engros- cellelysater. Lige store mængder prøver blev separeret ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og immunblottet med antistof angivet [27].

Fremstilling af cytoplasmatiske fraktioner

Til påvisning af cytochrom c frigivet fra mitokondrier, cytoplasmatiske fraktioner blev opsamlet fra NCI-H1975-celler efter inkubering med 0,1 mg /ml digitonin i 3 min ved 37 ° C i Cytosol Lysis Buffer (0,01% digitonin, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, proteaseinhibitorer cocktails i 1 × PBS ved pH 7,4). Efter centrifugering blev portioner af supernatanten (cytoplasmatiske fraktion), og pelleten indeholdende mitokondrier analyseret ved Western blotting.

Vurdering af celleproliferation og apoptose

Celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib indikationsgodkendelse koncentrationer og tidspunkter. Celleproliferation blev bestemt under anvendelse MTT assay. Cellelevedygtighed blev beregnet ved trypanblåt-udelukkelse [27]. Eksternalisering af phosphatidylserin blev testet under anvendelse af et Annexin V /PI Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter farvning med Hoechst 33258 ved 10 ug /ml for 10 min blev celledød vurderet af et fluorescensmikroskop (Leica).

In vitro EGFR kinaseassays

In vitro kinase-inhiberende evne blev bestemt ved hjælp af ADP-Glo ​​™ kinase Assay Kit og EGFR-kinase-enzym System (Promega) efter producentens instruktioner.

siRNA assays

Brug HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen, Crawley, UK) ifølge fabrikantens protokol blev celler transficeret med 100 nM dobbeltstrengede siRNA oligonukleotider. SiRNA-sekvenser var 5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3 ‘(Noxa siRNA1), 5′-AACUUCCGGCAGAAACUUC-3′ (Noxa siRNA2), og 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(negativ kontrol (NC) siRNA), 5’-CAGAAATGTCCTGAGCAAT- 3 ‘(c-Myc siRNA1), 5′-AAGGTCAGAGTCTGGATCACC-3’ (c-Myc siRNA2). Salg

klongenicitetsassayet Salg

Efter inkubering med V1801 (3 uM) eller gefitinib (3 uM ) i 12 timer blev en blød-agar koloniassay udføres. Til dette formål blev trypsinbehandlet celler suspenderes i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS og lav-smeltepunkt 0,3% agarose (Amresco, Solon, OH) og efterfølgende lagt oven på et størknet lag af RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS og 0,6% agarose i 35 mm plade (5.000 celler /plade) i tre eksemplarer. Efter 2 uger blev kolonierne fikseret i 90% ethanol og farvet med 0,005% krystalviolet (Sigma). Den kolonidannende enheder med mere end 100 celler blev talt under anvendelse af et lysmikroskop [28].

kombinationsindeks

Samspillet mellem forbindelser blev kvantificeret ved bestemmelse af kombinationen index (CI) beregnet af Chou-Talalay ligning [29], [30]. Den generelle ligning for den klassiske isobologram er givet ved: CI = (D) 1 /(Dx) 1+ (D) 2 /(Dx) 2. Hvor Dx angiver dosis af en forbindelse alene kræves for at producere en effekt, (D) 1 og (D) 2 er doserne af forbindelser 1 og 2 henholdsvis er nødvendige for at producere den samme virkning i kombination. Fra denne analyse, kan de kombinerede effekter af de to forbindelser sammenfattes således: CI 1 angiver synergisme; CI = 1 angiver additive virkning; og CI 1 angiver antagonisme

murine modeller

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af Animal Ethics Committee for Institut for Zoologi, kinesiske videnskabsakademi, med godkendelse id. af AEC2011030205. Alle anvendte mus i denne undersøgelse blev avlet og opretholdt i et specifikt patogen-frit miljø. NCI-H1975-celler (2,5 x 10

6) blev injiceret subkutant i den højre flanke hos nøgne mus. Når tumor nåede en håndgribelig størrelse, blev dyrene randomiseret i 3 grupper (n = 11 for hver gruppe) og behandlet med V1801 (30 mg /kg /dag), gefitinib (30 mg /kg /dag) eller vehikelkontrol i 3 uger. Dyr blev aflivet, når tumorerne nåede 2 cm eller hvis musene optrådte døende at undgå unødig morbiditet til musene. På tidspunktet for dyrenes død blev tumorer udskåret; celler blev adskilt, og lyseret for Western blotting under anvendelse af anti-Noxa-antistof og anti-actin-antistoffer. Noxa ekspression blev derefter kvantificeret ved densitometri analyse og normaliseret mod actin ekspression.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD med mindre andet er angivet.

P

værdier mindre end 0,05 indikerer statistisk signifikans.

Resultater

Virkninger af gefitinib mimetika på lungekræft celler og EGFR-kinase aktivitet

I dette arbejde, fjorten gefitinib analoger blev syntetiseret ved at udveksle positioner C5 og C6 substituenter og variation af C4-amino funktionalitet af quinazolin kerne af gefitinib, og deres virkninger på NCI-H1975-celler blev vurderet ved anvendelse gefitinib som kontrol (tabel 1). Blandt disse forbindelser blev V1801, V1802 og V1807 sig at udvise meget kraftigere cytotoksicitet mod NCI-H1975 celler end gefitinib, og V1801 er den mest potente én, hvis IC50-værdi på 3 pM er mere end tre folder lavere end for gefitinib ( tabel 1). Almindeligvis indføres en trifluormethylanilin del til C4-stillingen af ​​quinazolin kerne er en effektiv måde at forbedre cytotoksicitet. En brom substituent i C2 ‘position viste sig at være en egnet modifikation for højere aktivitet (V1801 vs. V1802, V1805 og V1808). Desuden piperidindelen ved terminalen af ​​C6-substituent af disse forbindelser er også overlegen i forhold til den tilsvarende morpholin, cyclohexan, azido, triazol og tetrazol funktionaliteter.

Under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol -2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, viste vi, at V1801 viste signifikante inhibitoriske virkninger mod spredning af NCI-H1975 (fig. 1a) og vildtype EGFR A549 (fig. 1b) celler på en dosis-afhængig måde. Ved trypan blå-udelukkelse analyse fandt vi, at V1801 reduceres hurtigt levedygtig NCI-H1975 (fig. 1c) og A549 (fig. 1d) celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Vi vurderede V1801 virkninger på kolonidannelse aktivitet af cellerne, og rapporterede, at sammenlignet med gefitinib eller vehikelkontrol, V1801 drastisk inhiberede klonogene aktivitet af NCI-H1975-celler (fig. 1e og 1f).

(a , b) cellerne blev behandlet med gefitinib eller V1801 i 48 timer og analyseret ved MTT-assayet. (C, d) Cellerne blev behandlet med gefitinib eller V1801 for angivne tidspunkter og vurderet ved trypan-blå-udelukkelse analyse. (E) Soft-kolonidannelse assay for NCI-H1975-celler behandlet med eller uden V1801 eller gefitinib. (F) Kvantificering af foci tælling. Middelværdien + SD af tre uafhængige forsøg er vist. (G, h) NCI-H1975 (g) og HCC827 (h) celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib i 12 timer, lyseret, og Western blot-assay blev udført under anvendelse viste antistoffer.

Vi testede virkningerne af disse gefitinib analoger på EGFR og viste, at V1801, V1802 og V1805 udøvede moderat inhibitorisk aktivitet på EGFR-kinaseaktivitet (tabel 1). V1801 havde en IC

50 på EGFR meget højere end for gefitinib (701,9 nM vs. 11,2 nM, tabel 1), hvilket indikerer, at de nye ændringer foretaget i analog V1801 er brugbare, men mindre overlegen til at hæmme EGFR-aktivitet. Ved Western blot-analyse i NCI-H1975-celler, både gefitinib og V1801 undladt at nedregulere phosphoryleret EGFR (p-EGFR) (fig. 1 g), mens der i gefitinib-sensitive HCC827 celler, gefitinib men ikke V1801 induceret de-phosphorylering af p -EGFR (fig. 1h). Disse resultater indikerer V1801 kan fremkalde celle apoptose via en mekanisme uafhængig af EGFR signalvejen hæmning.

V1801 inducerer apoptose af NSCLC celler i en caspase-afhængig måde

Vi næste testet, om V1801 eller ikke inducerer apoptose af cellerne. Ved Hoechst 33258 farvning, blev det viste i NCI-H1975 celler V1801 forårsagede kromatin kondensering og fragmentering, som er typiske apoptotiske nukleare morfologiske ændringer (fig. 2a). En annexin V /propidiumiodid (PI) -staining og flowcytometri assays bekræftede, at behandling med V1801 i 24 timer inducerede apoptose i NCI-H1975 og A549-celler (fig. 2b). Ved Western blot analyse blev V1801 behandling sig at resultere i en markant stigning i den aktive form af caspase-9, caspase-8 og caspase-3 og spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) i NCI-H1975-celler i en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2c) og i A549-celler (fig. 2d). Når NCI-H1975-celler blev forbehandlet med en pan-caspaseinhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp fluoromethylketone (z-VAD.fmk; 20 pM) i 1 time efterfulgt af behandling med V1801 ved 3 uM i 12 timer, V1801- induceret apoptose blev undertrykt (fig. 2e), hvilket indikerer, at aktivering af caspasekaskaden er afgørende for V1801-induceret apoptose i gefitinib-resistens celler.

(a) NCI-H1975-celler blev behandlet med gefitinib eller V1801 for 24 timer, og evalueres af Heochst33258 assay. (B) Cellerne blev behandlet med gefitinib eller V1801 i 24 timer, og apoptotisk celledød blev analyseret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. (C) NCI-H1975-celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib (3 uM), lyseret, og Western blot-assay blev udført under anvendelse viste antistoffer. (D) A549-celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib (3 uM) i 24 timer, lyseret, og Western blot-assay blev udført under anvendelse viste antistoffer. (E) NCI-H1975-celler blev forbehandlet med z-VAD-fmk (20 pM) i 1 time efterfulgt af behandling med V1801 ved 3 uM i 12 timer, og de apoptotiske celler blev bestemt ved Annexin V /PI-farvning og flow cytometrianalyse. Middelværdien + SD af tre uafhængige forsøg er vist. **,

P

. 0,01

V1801 opregulerer Noxa i NSCLC celler

For at belyse virkningsmekanismen af ​​V1801, dens virkninger på ekspression af antiapoptotiske proteiner (Bcl-XL og MCL-1) og proapoptotiske proteiner (Noxa, Puma og Bim) af Bcl-2-familien blev testet i NSCLC-celler med RT-PCR-analyse. Interessant fandt vi, at V1801 stærkt forøget ekspression af Noxa i en tidsafhængig måde (fig. 3a). Vi derefter evalueret virkningen af ​​V1801 på protein niveau af Noxa, og fandt, at behandling med V1801 ved 3 og 4 uM i 24 timer markant opreguleret Noxa i NCI-H1975-celler (fig. 3b). I NCI-H1975-celler behandlet med V1801 på 3 uM i 3 til 6 timer blev Noxa drastisk forøget (fig. 3c). I A549, HCT116, BGC823 og SGC7901 celler, behandling med V1801 på 3 til 6 uM i 24 timer også opreguleret Noxa (Fig. 3d). Imidlertid gefitinib undladt at opregulere Noxa i disse cellelinier (fig. 3a til 3d), hvilket indikerer, at disse to forbindelser har helt forskellige mekanismer i inducere apoptose af lungecancerceller.

(a) RT-PCR analyse af ekspressionen af ​​

Noxa

,

Puma

,

Bim

,

Bcl-xl

, og

Mcl-1 dele på mRNA-niveauet i NCI-H1975-celler behandlet med gefitinib (3 uM) eller V1801 (3 uM) for angivne tidspunkter. (B) NCI-H1975-celler blev behandlet med V1801 ved angivne koncentration i 24 timer, lyseret og analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af et anti-Noxa antistof. (C) NCI-H1975-celler blev behandlet med V1801 ved 3 pM for angivne tidspunkter, lyseret og analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af et anti-Noxa antistof. (D) viste celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib i 24 timer, lyseret og analyseret ved Western blot-analyse. (E) NCI-H1975-celler transficeret med kontrol eller Noxa specifikke siRNA blev behandlet med eller uden V1801 (3 uM) i 24 timer, lyseret, og udførtes Western blot-analyse. (F) Celler blev transficeret med siRNA og behandlet med V1801 som beskrevet i (e), derefter analyseret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. (G) NCI-H1975-celler blev behandlet med gefitinib eller V1801, lyseret, og immunopræcipitation /Western blot-assays blev udført under anvendelse viste antistoffer. (H, i) NCI-H1975-celler blev behandlet med V1801 eller gefitinib i 24 timer, lyseret, cytosol og mitokondriske fraktioner blev isoleret ved centrifugering, og Western blotting blev udført under anvendelse viste antistoffer (h). Ekspressionen af ​​cytochrom C blev kvantificeret ved densitometri analyse og normaliseret mod GAPDH eller Hsp75 (i).

opregulering af Noxa er påkrævet for V1801-induceret apoptose af NSCLC-celler

at vurdere dens rolle i V1801-induceret apoptose, blev Noxa tavshed ved specifik siRNA (fig. 3e), og cellerne upon V1801 blev analyseret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. Vi fandt, at knockdown af Noxa betydeligt svækkede V1801-induceret apoptose af NCI-H1975-celler (fig. 3f), hvilket indikerer, at opregulering af Noxa er afgørende for V1801-induceret apoptose. Imidlertid kunne Noxa inaktivering ikke fuldstændigt ophævet V1801-induceret celle apoptose (fig. 3f), hvilket antyder, at andre faktorer kan være involveret i programmeret celledød udløst af denne gefitinib analog.

Noxa kan direkte binde Mcl-1 og kompetitivt frigive Bim eller Bak fra denne apoptose antagonist, hvilket fører til mitokondriel dysfunktion og initiering af programmeret celledød [18], [31]. Vi udførte co-immunpræcipitering og Western blot assays i V1801-behandlede NCI-H1975-celler, og fandt, at V1801 men ikke gefitinib forbedret Mcl-1-Noxa bindende affinitet (fig. 3g). Vi undersøgte derpå subcellulære lokalisering af cytochrom c ved Western blot, mens ekspressionen af ​​cytochrom C blev kvantificeret ved densitometri analyse og normaliseret mod GAPDH eller Hsp75. Vi fandt, at i NCI-H1975-celler behandlet med V1801 (3 uM), men ikke gefitinib (3 uM) i 24 timer blev cytochrom c delvist translokeres fra mitokondrier til cytosol (fig. 3h og i). Disse resultater illustrerer, at øget ekspression af Noxa medierer apoptose induceret af V1801 gennem mitokondrier pathway.

Undersøgelse mekanismerne bag V1801-induceret Noxa opregulering

Undersøgelser har vist, at p53, c-Myc og E2F1 kan transkriptionelt øge Noxa udtryk via direkte binding til Noxa promotor [32]. Vi testede ekspressionen af ​​disse transkriptionsfaktorer, og rapporterede, at kun c-Myc blev opreguleret i NCI-H1975-celler behandlet med V1801 ved 3 uM i 3 timer (Fig. 4a). For at bestemme dets rolle i V1801-induceret Noxa opregulering og NCI-H1975 celle apoptose, c-myc blev stille ved specifik siRNA (Fig. 4b). Vi fandt, at c-Myc silencing svagt undertrykt V1801-forårsaget Noxa ekspression (fig. 4c) og programmeret celledød i NCI-H1975-celler (fig. 4d). For at bekræfte disse resultater blev c-myc-inhibitor 5- (4-ethyl-benzyliden) -2-thioxothiazolidin-4-on (10058-F4) [33] anvendes til at inhibere c-Myc transkription funktion. Resultaterne viste, at 10058-F4 delvist undertrykt V1801-induceret Noxa opregulering (fig. 4e) og cytotoksicitet i NCI-H1975 celler (Fig 4f.).

(a) NCI-H1975-celler blev behandlet med gefitinib (3 uM) eller V1801 (3 uM) for angivne tidspunkter, lyseret, og Western blot-assay blev udført under anvendelse viste antistoffer. (B) Western blot-analyse under anvendelse af lysater af NCI-H1975-celler transficeret med kontrol eller c-Myc specifik siRNA og anti-c-myc-antistof. (c) NCI-H1975-celler transficeret med c-myc specifikke siRNA blev behandlet med eller uden V1801, lyseret, og Western blotting blev udført under anvendelse viste antistoffer. (D) NCI-H1975-celler transficeret med c-myc specifikke siRNA blev behandlet med eller uden V1801, og evalueret af Anexin V /PI-farvning og flowcytometri. (E) NCI-H1975-celler blev behandlet med angivne protokoller i 24 timer, lyseret, og udførtes Western blot-analyse. (F) NCI-H1975-celler blev behandlet med angivne protokoller i 24 timer, og vurderet ved MTT-assayet. *,

s

0,05; **,

s

. 0,01

Tidligere undersøgelser har vist, at cisplatin kan opregulere Noxa i Erk afhængig måde, og hæmning af Erk af siRNA eller lille sammensatte hæmmer U0126 markant svækket cisplatin-induceret celledød samt Noxa udtryk [15]. Vi testede virkningerne af V1801 på Erk, og fandt, at phospho-Erk (p-Erk) i NCI-H1975-celler behandlet med V1801 ved 3 uM i 12 timer blev forøget (fig. 5a). Behandlet med V1801 i 24 timer også nedreguleret phospho-signaltransducere og aktivatorer af transkription 3 (p-STAT3), men ikke phospho-Rac-serin /threonin-proteinkinase (p-Akt) (fig. 5a). Det blev vist, at U0126 kunne dæmpe V1801-induceret Noxa ekspression (fig. 5b) og lidt (p = 0,06) reducerede V1801-induceret apoptose af NCI-H1975-celler (fig. 5C).

(a) NCI -H1975 celler blev behandlet med gefitinib (3 uM) eller V1801 (3 uM) for angivne tidspunkter, lyseret, og udførtes Western blot-analyse. (B) NCI-H1975-celler blev behandlet med angivne protokoller i 12 eller 24 timer, lyseret, og udførtes Western blot-analyse. (C) NCI-H1975-celler blev behandlet med angivne protokoller i 24 timer, og apoptotisk celledød blev evalueret ved Annexin V /PI-farvning og flowcytometri. (D) NCI-H1975-celler blev behandlet i 24 timer med BOR og /eller V1801, og derefter vurderet ved MTT-assayet. (E) NCI-H1975-celler blev behandlet med V1801 (2 uM), gefitinib (2 uM), BOR (10 nM), eller deres kombinationer for angivne tidspunkter. Cellerne blev derefter lyseret og underkastet Western blotting under anvendelse viste antistoffer.

i kappe-celle lymfom, er Noxa aktivering kræves til proteasominhibitor bortezomib apoptose [13]. Vi testede den kombinerede virkning af V1801 og bortezomib på NCI-H1975-celler og fundet, at bortezomib ved 10 til 15 nm signifikant forøget V1801 (2 uM)-forårsaget inhibering af celleproliferation (Fig. 5d). En analyse af kombinationen indeks (Cl) [29], [30] viste, at Cl-værdier var mindre end 1, hvilket indikerer, at disse to midler kan udøve synergistiske virkninger på NSCLC-celler. På molekylært niveau, viste vi, at behandling af NCI-H1975-celler med V1801 og bortezomib resulterede i forøget opregulering af Noxa og aktivering af Casp-3 og spaltning af PARP (Fig. 5e). Imidlertid blev opregulering af p-Erk induceret af V1801 svagt svækket ved bortezomib (fig. 5e).

In vivo

antitumoreffektivitet af V1801 på xenotransplantat musemodel

Vi testede

in vivo

anti-tumor effekt af V1801. For at gøre dette, blev nøgne mus subkutant indpodet i højre fløj med 2,5 × 10

6 NCI-H1975 celler i 0,1 ml PBS. Når tumorerne nåede en håndgribelig størrelse blev musene tilfældigt inddelt i 3 grupper (n = 11 for hver gruppe) og oral indgivelse med V1801 (30 mg /kg /dag), gefitinib (30 mg /kg /dag) eller vehikelkontrol for 3 uger. Interessant nok fandt vi, at V1801 signifikant inhiberede tumorvækst sammenlignet med vehikelkontrol eller gefitinib (P 0,05) (fig 6a til 6C.). Dyr blev aflivet, når de blev behandlet i 3 uger og tumorprøverne blev isoleret og afbildes (fig. 6c). Proteiner blev ekstraheret fra tumorprøver og Western blot-assay blev udført. Vi fandt, at i prøver fra mus behandlet med V1801, ekspressionen af ​​Noxa var opreguleret sammenlignet med den i prøver adskilt fra køretøjet eller gefitinib kontrolmus (fig. 6d og e). Disse resultater viser, at indgivelse af V1801 udviser enorme terapeutiske potentialer.

(a) Nøgne mus inokuleret subkutant med NCI-H1975-celler blev behandlet med gefitinib eller V1801 i 3 uger, og tykkelsesmålinger på de længste vinkelrette tumordiametre var udføres hver anden dag for at estimere tumorvolumen. (B) Billeder af mus to uger efter påbegyndelse af behandlingen. (c) Billeder af xenotransplantattumorer opnået fra mus. Otte repræsentative tumorer for hver behandlingsgruppe er vist. (D, e) Western blot-analyse af lysater af tumorprøver ved hjælp viste antistoffer (d). Noxa ekspression blev kvantificeret ved densitometri analyse og normaliseret mod actin udtryk (e).

Diskussion

EGFR er en celle-overflade receptor aktiveres i mere end halvdelen af ​​patienter med NSCLC, og denne aktivering kan være resultatet af protein over-ekspression, forøgede genkopiantal, eller genetiske mutationer [2]. Gefitinib anti-lung cancer effekter tilskrive dens binding til adenosintriphosphat bindingssted i tyrosinkinasedomænet af EGFR, hvorved EGFR-kinaseaktivitet inhiberer [3], [5], [34], [35]. Selv om mange patienter i begyndelsen reagere på gefitinib, modstand og tumor tilbagefald i sidste ende udvikle. For at overvinde denne modstand narkotika, blev der rapporteret nye mutant-selektive EGFR kinase inhibitorer mod EGFR T790M [36], og 4-pyrrylamino quinazoliner som nye gefitinib analoger blev syntetiseret [37]. I denne undersøgelse vi designe, syntetisere og evalueret en række hidtil ukendte quinazolinderivater ved at udveksle positioner C5 og C6 substituenter og variere C4-amino funktionalitet gefitinib, og rapporterer, at forbindelse V1801 har en trifluormethylgruppe på C5′- stilling og en brom ved C2′-stillingen af ​​anilindel substitueret ved C4-stillingen af ​​quinazolin kerne overvinder gefitinib modstand via opregulering af Noxa, hvilket antyder en hidtil ukendt strategi til bekæmpelse af NSCLC med EGFR T790M mutation.