PLoS ONE: kemoattraktant signalering mellem tumorceller og makrofager Regulerer Cancer Cell Migration, Metastase og Neovascularization

abstrakt

Tumor-associerede makrofager er kendt for at påvirke udviklingen af ​​kræft ved modulering af immunfunktion, angiogenese og celle metastase, dog kun lidt om de kemokinsignalering netværk der regulerer denne proces. Ved hjælp CT26 tyktarmskræft celler og RAW 264.7 makrofager som en model mobilsystem, vi viser, at behandling af CT26 celler med RAW 264,7 konditioneret medium inducerer celle migration, invasion og metastase. Inflammatorisk gen microarray analyse viste CT26-stimulerede RAW 264.7 makrofager opregulere SDF-1α og VEGF, og at disse cytokiner bidrager til CT26 migration

in vitro

. RAW 264.7 makrofager viste også en robust kemotaktiske respons dybt CT26-afledte kemokiner. Navnlig microarray analyse og funktionel test afslørede CSF-1 som den vigtigste kemoattraktant for RAW 264.7 makrofager. Interessant i chick CAM model af cancer progression, RAW 264.7 makrofager lokaliseret specifikt til tumoren periferi, hvor de viste en større CT26 tumorvækst, mikrovaskulær densitet, vaskulær forstyrrelse, og lunge metastase, hvilket tyder disse celler hjem til aktivt invaderende områder af tumor, men ikke den hypoxiske kerne af tumormassen. Til støtte for disse resultater, hypoxiske betingelser ned reguleret CSF-1 produktion i flere tumorcellelinier og nedsat RAW 264,7 makrofag migration

in vitro

. Sammen vore fund antyder en model, hvor normoksiske tumorceller frigivelse CSF-1 at rekruttere makrofager til tumoren periferi, hvor de udskiller motilitet og angiogene faktorer, der fremmer tumorcelleinvasion og metastase

Henvisning:. Green CE, Liu T, Montel V, Hsiao G, Lester RD, Subramaniam S, et al. (2009) kemoattraktant signalering mellem tumorceller og makrofager Regulerer Cancer Cell Migration, Metastaser og Neovaskularisering. PLoS ONE 4 (8): e6713. doi: 10,1371 /journal.pone.0006713

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA

Modtaget: May 22, 2009; Accepteret: 9 juli 2009; Udgivet: 21 August, 2009

Copyright: © 2009 Green et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. CEG, TL og R.L.K understøttes af NIH tilskud R01CA097022 og R01GM068487. V.M., R.D.L og S.L.G. understøttes af NIH tilskud R01CA94900. G.H. og S. S. understøttes af NIH tilskud R01GM078005. www.nih.gov. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tilbøjelighed til tumorer til fremskridt og metastaserer afspejler ikke blot de onkogene mutationer i kræftcellerne, men også dynamiske interaktioner, der involverer ikke-maligne celler i tumor celle mikromiljø. Ikke-maligne celler, der infiltrerer en cancer udvikler indbefatter fibroblaster, adipocytter, endotelceller perivaskulære celler og immunceller, som alle kan bidrage til kræft progression [1]. Blandt de immunceller, har makrofager vist sig at spille en støttende rolle, fremme tumorcelleoverlevelse, proliferation og metastase [2]. Tumorassocierede makrofager (TAM’er) er afledt af cirkulerende perifere blodmonocytter, der er tiltrukket af tumorvaskulaturen hvor de ekstravasere ind i interstitium og differentiere [3]. Skønt målsøgning af makrofag mod tumorer er dårligt forstået, er tumorceller vides at frigive makrofag kemoattraktanter herunder CCL2, CCL5, CCL7, CCL8, CXCL12, VEGF og CSF-1 [4]. Sammenlignet med klassisk aktiverede makrofager (M1), der fungerer som primære effektorceller i det medfødte immunsystem, M2 TAM’er support tumor overlevelse ved at fremme lokal angiogenese og vævsremodellering, mens undertrykke immunresponset [5]. TAM’er lokalisere til de invasive områder af tumoren, hvor de udskiller en række cytokiner og proteaser involveret i tumorcelleinvasion og metastase [6], [7]. I denne rolle, TAMer bidrage aktivt til tumor progression og overgang til malignitet, der ofte korrelerer med dårlig klinisk resultat. Men dechifrere de tumor-celle chemokin netværk der regulerer cancer progression

in vivo

stadig en stor udfordring.

Angiogenese, som er afgørende for udviklingen af ​​kræft, styres af en række faktorer, der vides at stimulere blodkarvækst og /eller modning, herunder VEGF, TGF-β, EGF, bFGF og TNF-α. TAM’er repræsenterer en primær kilde til mange af disse angiogene proteiner i tumoren microenvironement [8], [9], [10]. Især er VEGF frigivet af TAM’er og er en potent stimulus for væksten af ​​nye blodkar, øget mikrovaskulær densitet, vaskulær forstyrrelse, og lække [11]. Blodkar, der er under omformning er porøse og skrøbelige og dermed mere modtagelige for tumorcelle intravasation [12]. Derfor blev det på den invasive front kan TAM’er fremme tumormetastase ved at stimulere dannelsen af ​​tætte mikrovaskulære netværk af utætte fartøjer, der er tilladt at tumorcelle intravasation, mens samtidig at aktivere kræft cellemigration og invasion ved at frigive en række kemokiner, mitogener og proteaser.

Udover den invasive front kan TAM’er også lokalisere til den avaskulære hypoksisk kerne af tumoren [13], [14]. VEGF er udgivet af TAM’er i tumorkernen som respons på hypoxi og stabilisering af HIF1α og HIF2α [15], [16]. VEGF kan også være involveret i rekruttering TAM’er til tumoren kerne, ud over andre dårligt definerede faktorer i cellulære rester følge af tumornekrose [13]. Når lokaliseret til kernen, kan ikke kun klart cellerester men også regulerer neovaskularisering og tumor overlevelse TAM’er. Der er således delmængder af TAMs der er differentielt fordelt i tumormikromiljøet, der kan tjene specialiserede roller under cancer progression [2]. Vi hypotesen, at tumor iltning er en vigtig faktor for makrofag aktivitet i kræft. For eksempel i den hypoksiske tumorkernen kan TAM’er primært være angiogent og fagocyterende, mens under normoxiske betingelser ved tumoren periferi, kan TAM’er bidrage til tumormetastase ved at øge vævsombygning og vaskulær densitet. I sidstnævnte tilfælde kan VEGF frigivelse af TAM’er reguleres uafhængigt af hypoxi gennem interaktioner med invasive tumorceller eller stromale celler.

Forståelse rolle TAM’er i cancer progression

in vivo

kompliceres af den i evnen til at dechifrere de mange faktorer i mikromiljøet af tumoren. Derfor modelsystemer der rekapitule-

in vivo

tumorceller-TAM interaktioner

in vitro

er nødvendige for at hjælpe med at opklare de komplekse tumorprogression og metastase under definerede betingelser. I den foreliggende undersøgelse, vi udviklet en model-system til direkte at undersøge cytokin signalering mellem CT26 tyktarmskræft celler og RAW 264,7 makrofager. Brug af denne unikke modelsystem, viser vi, at RAW 264.7 makrofager og CT26 tumorceller gensidigt er tiltrukket af hinanden, og at makrofager inducere et stærkt vandrende og protrusive fænotype i tumorcellerne. Inflammatorisk gen array analyse og funktionel test viste, at tumorcelle-afledt CSF-1 er den vigtigste kemoattraktant for RAW 264.7 makrofager henviser makrofag afledt SDF-1α og VEGF bidrager til CT26 cancercelleinvasion. Yderligere, i alt 270 gener i RAW 264.7 makrofager og 85 gener i CT26 tumorceller var op- eller nedreguleret under inkubation i konditionerede medier, hvilket antyder, at yderligere veje end dem testet sandsynligvis aktiveres under tovejs signalering. I chick CAM’er blev inokuleret med tumorceller, RAW 264.7 makrofager lokalisere til tumoren periferi, hvor de lette vaskulær remodellering og forstærke tumorcellemetastase til chick lungerne. Disse resultater understøtter en model hvor parakrin signalering mellem tumorceller og makrofager regulerer lokalisering af makrofager i tumoren og tilbøjeligheden af ​​tumorcellerne til at metastasere.

Materialer og metoder Salg

Cellelinier, reagenser og antistoffer

CT26 muse tyktarmskræft linje, blev RAW 264.7 muse makrofag linje og MDA-MB-468 breast cancer linje opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). CL16, en metastatisk variant af MDA-MB-435, blev afledt som beskrevet tidligere [17]. CT26-celler blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad CA) og 1% glutamin. RAW 264.7, MDA-MB-468 og CL16 celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad CA) suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% Glutamax (Invitrogen, CA). RAW 264.7 udtrykker GFP blev foretaget ved at inficere celler med Lenti-Grøn supernatant (BioGenova, Rockville, MD). De højest 0,1% udtrykkende celler blev derefter sorteret ved FACS. CT26 celler, der udtrykker DsRed blev frembragt ved at inficere celler med lentivirus, pEF1-DsRed-pur, efterfulgt af selektion i puromycin (1 ug /ml). Hvor det er angivet, blev celler behandlet med blokerende anti-CSF-1R mAb (AFS98, eBioscience, San Diego, CA), blokering anti-EGF-R (Millipore, Billerica, MA), rekombinant muse-CSF-1 (R Corning, Lowell, MA) indeholdende polycarbonatmembraner med 8 um porer blev coatet på begge sider med fibronectin (10 pg /ml, Sigma-Aldrich) i 2 timer ved 37 ° C, skyllet en gang med PBS, og derefter anbragt i det nedre kammer indeholdende 500 pi migration adhæsion puffer (MAB; DMEM med 0,1% fraktion RIA-grade V BSA (Sigma-Aldrich), 1% penicillin-streptomycin og 1% glutamin), komplette medier (DMEM suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% glutamin), konditionerede medier eller migrering puffer indeholdende SDF-1α (100 ng /ml), VEGF165 (10 ng /ml), EGF (100 ng /ml) eller CSF-1 (40 ng /ml), som indikeret. Konditionerede medier blev indsamlet fra CT26 eller RAW 264,7 kulturer efter 48 timers inkubation ved 37 ° C. Fortyndinger af konditionerede medier blev fremstillet i passende base kulturmedier. Hvor det er angivet, anti-CSF-1R (20 ug /ml) og anti-EGF-R (20 ug /ml) var til stede i både øverste og nederste brønde i hele assayet. Serum-udsultet RAW 264.7 eller CT26-celler blev fjernet fra dyrkningsskåle med Hanks balancerede saltopløsning indeholdende 5 mM EDTA og 25 mM Hepes, pH 7,2, og 0,01% trypsin, vasket to gange med migration puffer og resuspenderes derefter i migration buffer ved 10

6 celler /ml. 10

5 celler i 100 pi migration buffer blev derefter tilsat til toppen af ​​hver migration kammer og får lov til at vandre til undersiden af ​​den porøse membran i forskellige tidsrum i tre eksemplarer. RAW 264,7 migreret til 24 timer i alle forhold og CT26 migreret i 3 timer i alle forhold. De nonmigratory celler på den øvre membranoverflade blev fjernet med en vatpind, og de migrerende celler fastgjort til den nederste overflade af membranen farvet med 0,1% krystalviolet i 0,1 M borat, pH 9,0, og 2% ethanol i 20 minutter ved stue temperatur. Antallet af chemotaxing celler pr membran blev talt under anvendelse af et inverteret fasekontrastmikroskop ved 40X. For RAW 264.7 kemotaksi under hypoxiske betingelser, blev det nedre kammer suppleret med komplet DMEM indeholdende 10% FBS for at skabe en kemotaktisk gradient. RAW 264.7 fik derefter lov til at migrere i 24 timer under normoxiske (21% oxygen) eller hypoxiske (1% oxygen) betingelser under anvendelse af en IsoTemp inkubator (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Migrerende celler blev fikseret med 100% methanol i 5 minutter og farvet med 0,1% krystalviolet i 0,1 M borat, pH 9,0, 2% ethanol i 20 min. Membraner blev skåret fra Transwell og anbringes i 200 ml 10% syre eddikesyre til eluering pletten derefter absorbansen blev aflæst ved 570 nm.

For at undersøge makrofag invasion i collagen, CT26-DsRed eller rødt fluorescerende (580 nm excitation /605 nm emission) polystyrenmikrosfærer (10 um; Molecular Probes, Carlsbad, CA) blev indlejret i sterilfiltreret type 1 collagen gel (PureCol; Nutacon, Leimuiden, Holland) indeholdende 1X RPMI (Sigma-Aldrich), 25 mM natrium bicarbonat og indstillet til pH 7,4 ved anvendelse af 0,1 M natriumhydroxid, som beskrevet tidligere [19]. Kollagenopløsningen indeholdende CT26-DsRed (10

7 celler /ml) eller kugler (10

7 perler /ml) blev tilladt at gelere i 10 pi alikvoter på fibronectin (10 pg /ml, Sigma-Aldrich) overtrukket Lab-Tek chamber slides (Nunc, Rochester, NY) i 30 minutter før tilsætning af RAW 264.7-GFP (10

5 celler /ml). Indledende migration af RAW 264.7-GFP ved grænsefladen med collagen dråbe blev afbildet ved 20X (NA = 0,75) i 12 timer ved 4 frames /time under anvendelse af et Nikon C1-Si inverteret konfokalt mikroskop (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) udstyret med PMT detektorer og lasere passende for GFP (488 nm) og DsRed (561 nm). Descanned billeder blev erhvervet ved hjælp af Nikon EZ-C1 software, kan gengives for celle tracking bruge Imaris (Bitplane, Saint Paul, MN). Placering koordinaterne for centroids for individuel RAW 264,7-GFP blev registreret ved hver ramme over tidsforløbet af migration. Disse koordinater blev derefter anvendt til at beregne forskydningen og samlede afstand migrerede for celler inden og uden 100 um af kollagen drop grænsen. Objektglas blev inkuberet i yderligere 7 dage derefter afbildes under anvendelse af konfokal mikroskopi (10X; NA = 0,45). Ved 1 um intervaller gennem hele Z-aksen af ​​kollagen drop

Chicken CAM assay

hønseembryo metastase assay blev udført som tidligere beskrevet [20], [21]. Kort fortalt, CT26-DsRed (2 × 10

6 celler) alene eller kombineret med RAW 264.7-GFP (2 × 10

5 celler) celler blev suspenderet på is i Matrigel (BD Bioscience), derefter podet på kyllingechorioallantoinmembranen membran (CAM) på udviklingsmæssige dag 9. efter 11 dage, på udviklingsmæssige dag 20 blev embryoner ofret og primære tumorer blev fjernet, afbildet på 0.63X og 2X ved stereomikroskopi, vejet og målt for diameter. Hjertet og lungerne blev isoleret, og formidling celle blev kvantificeret ved tælling af celleklynger ved hjælp af konfokal mikroskopi på 10X (NA = 0,45) med et trin afstand på 1 um. Tumorer blev efterfølgende snit og anbragt direkte på et dækglas til billeddannelse ved konfokal mikroskopi (10X; NA = 0,45). Tumorer blev afbildet 0 til 0,5 cm fra periferien eller kant (tumor periferi), 0,5 cm til 1 cm fra periferien (tumor væg) og 1,0 cm til 3 cm fra tumoren periferi (tumor kerne). Kvantificering af RAW 264.7-GFP fordeling i de CT26-dsRed tumorer blev bestemt ved at tage gennemsnittet GFP pixel bit maps over et synsfelt for at frembringe en gennemsnitlig fluorescensintensitet for hver region af tumoren under anvendelse af Image Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics, Bethesda , MD). Lysstyrke og kontrast justeringer blev foretaget på samme måde for alle kanaler og ikke ændre de relative forskelle mellem GFP pixel intensitet i forskellige regioner af tumoren.

qPCR

CT26, MDA-MB-468 eller CL16 tumorceller blev inkuberet ved 37 ° C i den passende komplet medium i 24 timer under hypoxiske (1,0% oxygen) eller normoxisk (21% oxygen) betingelser. Totalt RNA blev derefter ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), ifølge producentens anbefalinger. cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA ved anvendelse af iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). qPCR blev udført under anvendelse af et System 7300 instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) og en et-trins program: 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 30 ×, 60 ° C, 1 min i 40 cykler. CSF-1 og GAPDH mRNA-niveauer blev målt i tre eksemplarer og normaliseret mod HPRT-1 mRNA.

microarray analyse

For at undersøge inflammatoriske genekspression blev betingede buffere indsamlet fra CT26 eller RAW 264,7 kulturer efter 48 timers inkubation ved 37 ° C og anvendt til kulturer af den modstående celletype i 24 timer. mRNA blev derefter isoleret under anvendelse af RNeasy kittet (Quiagen, Valencia, CA), revers transkriberet under anvendelse af iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og analyseret i tre eksemplarer ved hybridisering til Codelink Mammalian Inflammation Bioarray indeholdende enkeltstrenget 30 -mer oligonucleotidprober (GE Healthcare, Piscataway, NJ), i henhold til producentens anbefalinger. Rå genekspression for replikater blev gennemsnit og normaliseret ved hjælp af CodeLink Gene Expression Analysis v5.0 Software (GE Healthcare, Piscataway, NJ). statistisk at bestemme signifikant opregulering eller nedregulering af gen udskrifter, vi anvendte Variance Modelleret Posterior inferens med Regional Exponentials (VAMPIRE) microarray analyse web suite til rå udskrift udtryk værdier, som tidligere beskrevet [22], [23]. Group-wise fejl i forbindelse med flere sammenligninger blev korrigeret ved hjælp af en konservativ Bonferroni korrigeret tærskel på 5% (alfa = 0,05). Hierarkisk klyngedannelse af standardiserede array-data blev udført under anvendelse dChip (afstand: korrelation, binding: centroid) baseret på gen-ontologi anmærkninger for angiogenese, celleproliferation og kemotaxi [24]. For Heatmap analyse blev intensitet scores beregnes på grundlag af betydningen af ​​genet op- eller nedregulering, som bestemt af VAMPIRE analyse. Disse gener blev derefter organiseret baseret på gen-ontologi anmærkninger for angiogenese, celle proliferation og kemotaksi hjælp dChip (afstand metriske: korrelation, sammenkædning metode: gennemsnit).

blev udført Statistisk analyse

Dataanalyse anvendelse af GraphPad Prism version 4.0 software (GraphPad software, San Diego, CA.). Alle data er rapporteret som gennemsnit ± SE. Nonparametric gruppe data blev analyseret ved variansanalyse (ANOVA) og Neuman-Keuls post-test. Gauss-fordelt middelværdier blev analyseret af Student

t

test. Gruppe sammenligninger betragtes som væsentlig i 2-tailed

P

værdier under 0,05.

Resultater

Migration og Morfologisk analyse af CT26 Cancer Cells Co-kulturperler med RAW 264,7 makrofager

Vi først udført en kinematisk analyse af tumorcellemigration adfærd og bestemte celleform ændringer som reaktion på samdyrkning med makrofager. Til direkte undersøge, hvordan makrofager ændrer vandringsadfærd og persistens af colon cancerceller, blev CT26 muse colon cancerceller afbildet ved konfokal mikroskopi under co-dyrkning i 15 timer i nærvær eller fravær af RAW 264.7 musemakrofager (fig. 1

A

). CT26 celler alene udviste en samlet migration længde på 199 ± 78 um (gennemsnit ± SD) (fig. 1

B

). Denne værdi var til at skelne fra CT26 co-dyrket med RAW 264.7 celler, som udviste en migrering længde på 154 ± 46 um. Trods lignende længder migration, CT26, der blev co-dyrket med RAW 264.7-celler migreret langs en betydeligt mere lige vej, med rethed værdier på 0,34 for CT26 samdyrket med RAW 264.7-celler sammenlignet med 0,15 for CT26 alene (fig. 1

B

). Dette 2-fold stigning i rethed var ledsaget af en betydelig stigning i den samlede forskydning eller vedvarende migration af CT26 celler co-dyrket med RAW 264.7 celler. CT26 celler co-dyrket med makrofager udviste en gennemsnitlig forskydning af 49 ± 24 um mod 28 ± 20 um for CT26 celler alene (fig. 1

B

). Disse resultater tyder på, at RAW 264.7 makrofager fremmer migrationen af ​​CT26 celler

in vitro

. Vigtigere, CT26-celler dyrket med eller uden makrofager viste lignende levedygtighed. Faktisk analyse af tumorcellevækst over flere dage indikerede, at CT26-celler voksede hurtigere i nærvær af makrofager (resultater ikke vist). Co-dyrkning af RAW 264.7-celler med CT26-celler ændrede ikke RAW 264.7 celleadhæsion til ekstracellulære matrixproteiner. Desuden har evaluering af RAW 264.7-celle adfærd i dette assay ikke afsløre signifikante forskelle i migration afstand, forskydning, rethed, eller celle form, når cellerne blev co-dyrket med CT26-celler (resultater ikke vist), hvilket antyder fraværet af kemiske gradienter tilstrækkelige for makrofag kemotaksi. Tilsammen indikerer disse resultater, at RAW 264.7 makrofager inducerer vedvarende CT26 cancer cellemigrering på 2-D overflader.

A, B) CT26-DsRed (10

5 /ml) blev inkuberet på fibronectin med RAW 264.7 GFP (10

5 /ml), som indikeret, i 12 timer ved 37 ° C. I løbet af denne tid, rethed, samlede længde rejste og samlede kumulative forskydning af individuelle CT26 celle geometriske tyngdepunkter blev sporet (gule linjer) ved 4 frames /time i nærvær og fravær af RAW 264.7 makrofager under anvendelse af konfokal mikroskopi på 20X. Data præsenteres som individuel track kvantificering for 55-75 celler over 3 forsøg, med gennemsnit angivet med bar. Forstørrelse skala søjle repræsenterer 30 um. * Angiver signifikant forskel i migration sti rethed (p 0,0001). ** Angiver signifikant forskel i migration sti forskydning (p 0,0001).

evne kræftceller til at danne invadapodia og membran fremspring er blevet forbundet med øget migration og væv invasiv [25]. Derfor undersøgte vi CT26 cellemorfologi som reaktion på co-dyrkning med RAW 264,7 makrofager. Inden for 6 timer, co-dyrkning med RAW 264.7 makrofager fremmet en forbedret mesenkymale fænotype i CT26-celler, kendetegnet ved talrige lange membran fremspring, udstrålede udad fra cellelegemet (fig. 2

A

). Denne morfologi blev opretholdt i mere end 12 timer og var tydelig i alle CT26 celler i co-kultur, der var i kontakt med en eller flere makrofager (fig. 2

B

). For at bestemme den minimale tid, der kræves for RAW 264.7 celler til at fremkalde CT26 morfologi ændringer, vi målte kinetikken af ​​formen ændring (fig. 2

C

). Begyndende med indledende adhæsion af celler til skålen, blev de større og mindre akser migrerende CT26-celler bestemmes hver 20 min i hele 12 timers kultur med eller uden RAW 264.7-celler ved anvendelse af et kammer objektglas og konfokal mikroskopi. Som forventet, CT26 celler alene eller i co-kultur var effektivt runde ved første vedhæftning til fadet med form indekser af ~ 1. CT26-celler inkuberet med RAW 264.7-celler undergik hurtig celleforlængelse, som storaksen langs de polariserede membran forlængelser var -4 gange længere end lilleaksen så tidligt som 4 timer efter initial celleadhæsion sammenlignet med celler dyrket i fravær af RAW 264.7 makrofager (fig. 2

C

). Formen Ændringen nåede et plateau ved -5,5 efter 8 timers co-kultur. Som forventet, CT26 celler, der blev dyrket alene også udviste en indledende stigning i form forlængelse, da de levet og spredning. Men i dette tilfælde, cellerne kun udvidet korte fremspring og undlod at forlænge betydeligt, som formen indeks kun nåede et maksimum på ca. 2 efter 6 timers dyrkning (fig. 2

C

). Tilsammen kvantitativ analyse af CT26 cellevandring og morfologi dynamik indikerer, at RAW 264.7 makrofager fremkalde en hurtig og vedvarende stigning i celle migration, der er forbundet med forøget dannelse af membran fremspring.

DsRed-CT26 (10

5 /ml) blev inkuberet på fibronectin med GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml), som indikeret, i 15 timer ved 37 ° C. Fluorescerende billeder blev erhvervet ved hjælp konfokalmikroskopi (20X) på 4 billeder /time. A) Tidsforløb for Ds-Red-CT26 dynamik over 12 timer, når de inkuberes alene eller med RAW 264,7-GFP makrofager. Billeder er repræsentative for CT26 bevægelse over 3 separate eksperimenter. Forstørrelse skala søjle repræsenterer 20 um. B) Akkumuleret CT26-DsRed distribution og fremspring efter 15 timers inkubation alene (højre) eller med RAW 264,7-GFP makrofager (venstre og center, med grønne kanal slukket). Billeder er repræsentative for 3 separate forsøg. Forstørrelse skala søjle repræsenterer 30 um. C) Formen indeks (hovedakse /lilleakse) af CT26-celler i nærvær eller fravær af RAW 264.7-celler blev sporet over 12 timer til migration. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for 10 celler over 3 separate eksperimenter.

RAW 264,7 makrofager og CT26 tumorceller Slip Opløselige kemotaktiske faktorer, der fremmer gensidig Kemotaxi

Vi næste undersøgt, om induktion af en invasiv fænotype i CT26 celler ved RAW 264.7-celler skyldtes en direkte interaktion med makrofagerne eller en respons på opløselige kemotaktiske faktorer frigivet af makrofager under anvendelse af en standard Boyden kammer assay [18]. CT26-celler viste en dosisafhængig og robust kemotaktiske respons mod en gradient af RAW 264.7-celle-konditionerede medier (CM), hvorimod eksponering til styring basalt medium alene inducerede ikke en vandrende respons (fig. 3

A

). Vigtigere, celle migration var overvejende retningsbestemt mod koncentrationsgradient, som tumorcellemigration blev reduceret med -60%, når RAW 264,7 celle CM blev sat ensartet på både øverste og nederste kamre (fig. 3

A

). Disse fund indikerer, at RAW 264.7 makrofager frigive opløselige faktorer, der fremmer retningsbestemt vandring af CT26 colon cancerceller.

A) CT26 (10

5 /ml) blev tilsat til den øvre af et Boyden kammer med RAW 264.7 konditionerede medier, kontrol buffer eller komplet DMEM tilsat til den nedre brønd. CT26 fik lov til at migrere i 3 timer ved 37 ° C før farvning og kvantificering af kemotaxi. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for 15-30 tilfældigt udvalgte felter end 3-6 separate forsøg. * Betegner betydning mellem 50% RAW CM og mediekontrol (p 0,001) og 50% RAW CM og 100% RAW CM top /bund (p 0,001). B) RAW 264.7 (10

5 /ml) blev tilsat til den øvre brønd i en Boyden kammer med CT26 konditionerede medier, styre buffer eller komplet DMEM tilsat til den nedre brønd. RAW 264.7 fik lov til at migrere i 24 timer ved 37 ° C før farvning og kvantificering af kemotaxi. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM for 15-30 tilfældigt udvalgte felter end 3-6 separate forsøg. ** Angiver signifikans mellem 25% CT26 CM og mediekontrol (p 0,001) og 25% CT26 CM og 100% CT26 CM top /bund (p 0,001). C) GFP-RAW 264.7 (10

5 /ml) blev inkuberet på fibronectin overtrukket kammerobjektglas med 10 pi kollagen dråber indeholdende Ds-Red-CT26 (10

7 /ml) eller 10 um røde fluorescerende kugler (10

7 /ml). Makrofag invasion i tumoren indlejret eller perle indlejret collagen dråbe blev afbildet efter 7 dage ved 10X ved konfokal mikroskopi. Side visning og ovenfra billeder er repræsentativ for den gennemsnitlige makrofag respons over 6 kollagen tumorer. Forstørrelse skala bar for top se billeder repræsenterer 200 um. D) Grænsefladen mellem makrofager og kollagen tumor dråbe blev filmede med konfokalmikroskopi (20X) i 12 timer ved 4 billeder /t efter tilsætning af RAW 264,7 til kammeret dias. Over denne periode blev dynamikken i makrofag migration kvantificeres ved at spore de enkelte celle centroids på 4 billeder /time. Makrofager indledning migration inden for 100 um af tumor grænse (stiplet hvid linje) udviser gule spor. Makrofager initierende migration over 100 um af tumor grænse udviser hvide spor. Billede er repræsentativ for den gennemsnitlige makrofag respons på 6 separate kollagen tumorer. Forstørrelse skala søjle repræsenterer 30 um. E) Track fordrivelse og total banelængde blev kvantificeret for makrofag migration inden for og uden for 100 um af kollagen tumor grænse. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for 15 makrofager inden for 100 um og 15 makrofager Beyond 100 um af kollagen tumor grænse. #denotes en betydelig forskel i migration sti forskydning (p 0,05). ## Betegner en signifikant forskel i total migration vejlængde (p 0,0001)

RAW 264.7 makrofager udviste en robust og dosisafhængig kemotaktisk reaktion på en gradient af CT26 celle CM (fig 3

B

). Faktisk omfanget af cellemigrering til ufortyndet CM var ~ 10 gange større end basale niveauer af migration observeret som respons på enten serumholdigt medium eller migration buffer indeholdende kun bovint albumin. RAW 264,7 celle migration var meget retningsbestemt og ikke på grund af tilfældige kemokinetisk bevægelse som at tilføje CT26 CM til både de øvre og nedre kamre fuldstændigt ophævet migration respons (fig. 3

B

). Interessant nok i modsætning til co-dyrkningssystem hvor RAW 264.7 ikke udviste en stigning i migration afstand eller forskydning, gradienten af ​​kemotaktiske faktorer i Boyden kammer var tilstrækkelig stejl til at fremkalde robust kemotaksi af RAW 264.7 makrofager.

for yderligere at undersøge makrofag kemotaxi i retning tumorceller, vi udviklet en ny 3D migration assay, hvori CT26-celler blev indlejret i kollagengel og sted dråbevis på et dækglas med RAW 264.7-celler jævnt fordelt langs periferien af ​​gelmatrixen. Som vist i fig.