PLoS ONE: Resveratrol Forhindrer kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Karakteristika i menneskelig og KrasG12D transgene mus ved at hæmme pluripotensbestemmende Vedligeholdelse Faktorer og Epithelial-Mesenchymale Transition

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSCS) kan formere sig og forny sig selv i udstrakt grad på grund af deres evne til at udtrykke anti-apoptotiske og lægemiddelresistente proteiner, således opretholde tumorvækst. Derfor kunne den strategi at udrydde CSCS har væsentlige kliniske implikationer. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, som resveratrol hæmmer stamceller karakteristika af pancreas CSCS afledt af humane primære tumorer og Kras

G12D transgene mus.

Metode /vigtigste resultater

Humane pankreatiske CSCS (CD133

+ CD44

+ CD24

+ ESA

+) er yderst tumorigene og danner subkutane tumorer i NOD /SCID-mus. Humane pancreas CSCS udtrykker høje niveauer af CD133, CD24, CD44, ESA, og aldehyd dehydrogenase udtrykker også betydeligt mere Nanog, Oct-4, Notch1, MDR1 og ABCG2 end normale pancreas væv og primære bugspytkirtelkræftceller. Tilsvarende CSCS fra Kras

G12D mus udtrykker signifikant højere niveauer af Nanog og Oct-4 end pancreas væv fra PDX-Cre mus. Resveratrol hæmmer væksten (størrelse og vægt) og udvikling (Panin læsioner) af bugspytkirtelkræft i Kras

G12D mus. Resveratrol hæmmer selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS afledt af humane primære tumorer og Kras

G12D mus. Resveratrol inducerer apoptose ved aktivering Capase-3/7 og inhibere ekspressionen af ​​Bcl-2 og XIAP i humane CSCS. Resveratrol hæmmer pluripotens opretholde faktorer (Nanog, Sox-2, c-myc og Oct-4) og resistens gen ABCG2 i CSCS. Hæmning af Nanog af shRNA øger hæmmende effekter af resveratrol på selvfornyelse kapacitet CSCS. Endelig resveratrol hæmmer CSCs migration og invasion og markører for epitelial-mesenkymale overgang (Zeb-1, Slug og Snail).

Konklusioner /Betydning

Disse data tyder på, at resveratrol hæmmer kræft i bugspytkirtlen stamceller karakteristika i menneskelig og Kras

G12D transgene mus ved at hæmme pluripotens opretholde faktorer og epitelial-mesenkymale overgang. Som konklusion kan resveratrol der anvendes til forvaltning af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Shankar S, Nall D, Tang S-N, Meeker D, Passarini J, Sharma J, et al. (2011) Resveratrol Forhindrer kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Karakteristika i menneskelige og Kras

G12D transgene mus ved at hæmme pluripotensbestemmende Vedligeholdelse Faktorer og Epithelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 6 (1): e16530. doi: 10,1371 /journal.pone.0016530

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: November 22, 2010; Accepteret: December 21, 2010; Udgivet: 31 Jan 2011

Copyright: © 2011 Shankar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft død. i USA. Det forventes, at ca. 32.000 amerikanere vil dø af kræft i bugspytkirtlen i år. Med en samlet 5-års overlevelse på 3% [1], bugspytkirtelkræft har en af ​​de fattigste prognoser blandt alle kræftformer [2]. Bortset fra dens tavse natur og tendens til sen opdagelse, pancreascancer viser også usædvanligt resistens mod kemoterapi og strålebehandling. Kun 20% af patienter med pancreascancer er berettiget til kirurgisk resektion [3]. Operationerne er meget komplekse, og medmindre udføres af kirurger specialuddannede og erfarne i denne procedure, kan de være forbundet med meget høje operative sygelighed og dødelighed. Desværre er der mange pancreascancer ikke resektabel på tidspunktet for diagnosen. Desuden er der begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed for patienter med kræft i bugspytkirtlen, fordi kemo- og radio-behandlinger er stort set ineffektive, og metastatisk sygdom ofte redevelops selv efter operationen. Derfor er der et presserende behov for at opdage nye og effektive metoder til forebyggelse og /eller behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Det er nu ved at blive realiseret, at tumorer indeholder et lille antal tumor-dannende og selvfornyende kræft stamceller (CSCS) inden for en population af nontumor-dannende cancerceller [4]. Vi og andre har identificeret CSCS i flere typer af humane kræftformer, herunder kræft i bugspytkirtlen [5], [6], [7], [8], [9]. Cancerstamceller hypotese antyder, at konventionelle kemoterapier dræbe differentierede eller differentierende celler, og disse celler udgør størstedelen af ​​tumoren, men kan ikke generere nye celler. Tumor tilbagefald kan forekomme, fordi CSCS forblive uberørt, er meget afgørende for en effektiv kræftbehandling tyder fjernelsen af ​​CSCS. Modsætning til de fleste celler i tumoren, CSCS, herunder pancreas CSCS, er resistente over for kemoterapi og kan bidrage til tumormetastase og tumor tilbagefald efter behandling. Derfor lægemidler, der selektivt målrettet CSCS tilbyder en mere lovende for kræft terapi og /eller forebyggelse.

Epidemiologiske og kost interventionsstudier i dyr og mennesker har antydet, at kost-afledte fenoler, især flavonoider, kan spille en gavnlig rolle ved inhibering, ændring eller forsinke tumorigenese i mange cancertyper, herunder pancreascancer [10]. Den polyphenolisk Forbindelse resveratrol er et naturligt forekommende fytokemiske og findes i mange plantearter, herunder druer, jordnødder og forskellige urter [10]. Resveratrol er blevet vist at have anti-inflammatorisk, antioxidant, antitumor, neuroprotektive og immunmodulerende aktiviteter [10], [11], [12], [13], [14]. Det har også aktivitet i reguleringen af ​​flere cellulære begivenheder forbundet med carcinogenese [10], [11], [12], [13], [14]. Dens anticancer effekter i bugspytkirtelkræft omfatter dens evne til at hæmme celledeling og angiogenese, og inducere apoptose i prækliniske undersøgelser [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Resveratrol kan forbedre antitumoraktiviteten af ​​gemcitabin

in vitro

i ortotopisk musemodel af human pancreascancer [19]. Vi og andre har vist, at resveratrol forbedrer det terapeutiske potentiale af lægemidler mod cancer og sensibiliserer kræftceller til kemoterapi og strålebehandling [10], [19], [21], [22], [23]. Selv om disse studier har undersøgt effekten af ​​resveratrol på kræft i bugspytkirtlen, er der ingen undersøgelser der undersøger, hvordan resveratrol regulerer bugspytkirtelkræft stamceller egenskaber.

Epitelceller undergår fibroblastoid morfologiske ændringer forbundet med øget motilitet eller invasiv grund af nedsat celle- celleadhæsion (11-14). Fibroblastoid morfologiske ændringer af epitelceller er kendt som epitel-til-mesenchymal overgang (EMT). EMT induktion i cancer celler resulterer i erhvervelse af invasive og metastatiske egenskaber [24], [25], [26], [27], [28]. Nylige rapporter viser, at fremkomsten af ​​CSCS sker dels som et resultat af EMT, for eksempel gennem stikord fra tumor stromale komponenter. CSCS og EMT-type celler, som deler molekylære karakteristika med CSCS, er blevet menes at spille kritiske roller i lægemiddelresistens og tidlig cancermetastase som påvist i adskillige humane maligniteter, herunder pancreascancer [27], [29], [30]. Således er opdagelsen af ​​molekylær viden om resistens over for lægemidler og metastaser i forhold til CSCS og EMT i bugspytkirtelkræft blive et vigtigt forskningsområde, og denne viden vil sandsynligvis være nyttigt i opdagelsen af ​​nyere lægemidler samt designe nye terapeutiske strategier til behandling og /eller forebyggelse af kræft i bugspytkirtlen med bedre resultat.

Formålet med vores undersøgelse var at undersøge de molekylære mekanismer, som resveratrol hæmmer pancreas CSC karakteristika i menneskelig og Kras

G12D transgen musemodel, og undersøge, om hæmning af Nanog forbedrer evnen af ​​resveratrol til at hæmme selvfornyelse kapacitet af humane pancreas CSCS.

Resultater

Isolering og karakterisering af humane pancreas CSCS isoleret fra humane primære pancreas tumorer

tumorer indeholder et lille antal tumor-dannende og selvfornyende CSCS i en population af nontumor-dannende cancerceller [4]. Terapeutisk fiasko /tilbagefald skyldes ineffektiv målretning af CSC befolkning. Den CD44

+ CD24

+ ESA

+ bugspytkirtelkræftceller er meget tumorgene og besidde stamcelle-lignende egenskaber af selv-fornyelse og evnen til at producere differentieret afkom [31]. Fra et terapeutisk synspunkt, har CSCS i flere tumortyper vist modstand mod standardbehandlinger og kan spille en rolle i behandlingssvigt eller sygdom tilbagefald. Identifikation af pancreas CSCS og yderligere belysning af de signalveje, der regulerer deres vækst og overlevelse kan tilvejebringe nye terapeutiske og forebyggende tilgange til forvaltning af kræft i bugspytkirtlen. Vi først kendetegnet CSCS isoleret fra humane pankreatiske tumorer (fig. 1A-H). Pancreas CSCS udtrykker stamceller markører CD44, ESA, CD133, og CD24, og pluripotens opretholde faktor Oct-4. Pancreas CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCS udtrykte også ALDH (aldehyd dehydrogenase), en anden markør for CSCS.

(A-H), bugspytkirtelkræftceller blev isoleret fra primære tumorer og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af antistof mod CD44, CD24, ESA, CD133, Oct4, og ALDH. (I), Ekspression af stamcellemarkører. RNA blev isoleret fra normale pancreas væv, primær kræft i bugspytkirtlen og pancreas CSCS og udtryk for CD24, CD133, CD44, ESA, Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 blev målt ved q-RT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, ** @ = Signifikant forskellig fra kontrol, P . 0,05

Vi næste undersøgte udtryk for stamcelle markører (CD133

+ CD44

+ CD24

+ ESA

+), pluripotens opretholde faktorer (NANOG), signalering molekyle (Notch-1) og lægemiddelresistente gener (MDR1 og ABCG2) i humane normale bugspytkirtlen, primære bugspytkirtelkræftceller og CSCS af q-RT-PCR (fig. 1I). Normale pancreas væv udtrykker meget lave niveauer af CD133, CD24, CD44, ESA, Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 sammenlignet med kræft i bugspytkirtlen og CSCS. Humane pancreas tumorer udtrykte ca. 3-6% CSCS. Til sammenligning ekspression af disse gener i bugspytkirtelkræftceller var signifikant lavere end CSCS. Interessant, CD133

+ CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSC udtrykker højere niveauer af Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 gener.

Tumorgenetisk potentiale CD133

+ CD44

+ CD24

-ESA

+ pancreas CSCS i NOD /SCID-mus

Vi næste sammenlignede tumorigent potentiale af CD133

-CD44

-CD24

– ESA

– pancreas CSCS med den af ​​CD133

+ CD44

+ CD24

-ESA

+ pancreas CSCS isoleret fra humane primære tumorer i NOD /SCID-mus (fig. 2). Nøgne mus blev injiceret med 50 CD44

-CD44

-CD24

-ESA

– CSCS og CD133

+ CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSCS i venstre og højre flanker henholdsvis. Dataene viste, at CD133

+ CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSCS dannet tumorer i 20 dage i NOD /SCID-mus, hvorimod CD133

-CD44

-CD24

-ESA

– CSCS ikke danne tumorer (fig 2A.). H . E, Statifin og S100P

Resveratrol hæmmer dannelsen af ​​primære og sekundære sfæroider og levedygtighed celle humane pancreas CSCS

CSCS blev dyrket i bugspytkirtelkræft stamcelle defineret medium i suspension, og behandlet med resveratrol i 7 dage. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev sfæroider i hver brønd fotograferet. Resveratrol inhiberede væksten af ​​sfæroider i suspension i en dosisafhængig måde (fig. 3A). Sfæroiderne fra hver behandlingsgruppe blev opsamlet og resuspenderet til tælling af cellelevedygtighed. Resveratrol inhiberede pancreas CSC levedygtighed på en dosis-afhængig måde (Fig. 3B).

(A), human pancreas CSCS blev dyrket i seks-brønds ultralav montagepladerne (Corning Inc., Corning, NY) ved en densitet på 1.000 celler /ml i Celprogen pancreatisk CSC-medium ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 7 dage for at frembringe primære sfæroider. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev sfæroider opsamlet, reseeded og behandlet med resveratrol i en anden uge for at opnå sekundære sfæroider. (B) Cellelevedygtighed i sfæroider blev målt ved trypan blue assay ved udgangen af ​​7 og 14 dage fra ovennævnte eksperiment. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, , #,% og @ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), blev pancreas CSCS udsået i blød agar og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 21 dage. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev antal kolonier talt. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *,% Og = Signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Da resveratrol hæmmede væksten af ​​tumor klumpformet og levedygtighed celle i CSCS, vi næste forsøgt at undersøge effekten af ​​resveratrol på kolonidannelse. Pancreas CSCS blev dyrket i agar, og behandlet med forskellige doser af resveratrol i 3 uger. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev kolonier talt. Resveratrol inhiberede væksten af ​​kolonier på en dosis-afhængig måde (Fig. 3C). Disse data tyder på, at resveratrol kan være effektive til inhibering af selvfornyelse kapacitet af humane pancreas CSCS.

Resveratrol aktiverer caspase-3 /-7, inducerer apoptose og inhiberer ekspressionen af ​​XIAP, Bcl-2 og cyclin D1 i pancreas CSCS

Vi næste undersøgt virkningerne af resveratrol på caspase-3 /-7 aktivitet, apoptose, og udtryk for apoptosis- og cellecyklus-relaterede proteiner (fig. 4). Resveratrol inducerer caspase-3 /-7 aktivitet og apoptose (fig. 4A og B). Da IAP, Bcl-2 familiemedlemmer og cyklin D1 spiller vigtige roller i reguleringen af ​​apoptose og cellecyklus, vi undersøgt virkningerne af resveratrol på ekspressionen af ​​XIAP, Bcl-2, caspase-3 og cyklin D1. Resveratrol inhiberede ekspressionen af ​​XIAP, Bcl-2 og cyclin D1, og også spaltet caspase-3 (fig. 4C og D). Disse data tyder på, at resveratrol forårsager vækststandsning og inducerer apoptose i pancreas CSCS ved inhibering af cyclin D1 og apoptose-relaterede proteiner (XIAP og Bcl-2), henholdsvis.

(A og B), Aktivering af caspase- 3 /-7 og induktion af apoptose. Pancreas CSCS blev behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 48 timer, og caspase-3 /-7 aktivitet og apoptose blev målt ved kolorimetrisk og TUNEL-assay, hhv. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, og # = markant forskellige fra kontrol, P 0,05. (C og D), blev pancreas CSCS behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer, og western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​XIAP, Bcl-2, caspase-3 og cyclin D1. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

Resveratrol hæmmer ekspressionen af ​​Nanog, Sox-2, cMyc, Oct-4 og ABCG2 i humane pancreas CSCS

Da transskription faktorer Nanog, Sox-2, cMyc og Oct-4 er højt udtrykt i CSCS og er nødvendige for at opretholde pluripotens, vi undersøgt virkningerne af resveratrol på ekspressionen af ​​Nanog, Sox-2, cMyc og Oct-4 i humane pancreas CSCS udtrykker CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ (fig. 5). Resveratrol inhiberede ekspressionen af ​​Nanog, Sox-2 og cMyc som målt ved QRT-PCR (fig. 5A). Tilsvarende resveratrol inhiberede ekspressionen af ​​Nanog, Oct-4 og Sox-2 i pancreas CSCS som målt ved Western blotting (fig. 5B). Resveratrol inhiberede også Nanog reporter aktivitet (fig. 5C). Disse data tyder på, at resveratrol hæmmer de faktorer, der er nødvendige for opretholdelse af pluripotens i pancreas CSCS.

(A), blev pancreas CSCS behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 24 timer. Ekspressionen af ​​Nanog, Sox-2 og cMyc blev målt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * Og @ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), blev pancreas CSCS behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 48 timer. Ekspressionen af ​​Nanog, Oct-4 og Sox-2 blev målt ved Western blot-analyse. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (C), Inhibering af Nanog transkription ved resveratrol. Pancreas CSCS blev transduceret med Nanog reporter konstrukt. Transducerede celler blev behandlet med resveratrol at undersøge Nanog transkriptionsaktivitet. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, #, @, og ** = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), blev pancreas CSCS behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 36 timer. Ekspressionen af ​​ABCG2 blev målt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * Og # = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Kræft stamceller har vist sig at udvise resistens over for lægemidler egenskaber ved at udtrykke multilægemiddelresistens gener, såsom ABCG2. Vi målte derfor ekspressionen af ​​ABCG2 i humane CSCS behandlet med resveratrol. Resveratrol inhiberede ekspressionen af ​​ABCG2 i pancreas CSCS som målt ved QRT-PCR (fig. 5D). Disse data antyder, at inhibering af ABCG2 af resveratrol kunne være gavnligt til at forøge de biologiske virkninger af resveratrol alene eller i kombination med andre lægemidler.

Nanog shRNA forøger de inhiberende virkninger af resveratrol på pancreas CSC levedygtighed i sfæroider

Da Nanog er stærkt udtrykt i pancreas CSCS, søgte vi at undersøge, om hæmning af Nanog forbedrer de biologiske effekter af resveratrol på levedygtighed stamcelle i sfæroider. Transduktion af Nanog shRNA i CSCS inhiberes Nanog ekspression som vist ved Western blot analyse (fig. 6A). Resveratrol inhiberede cellelevedygtighed i sfæroider (scrambled shRNA) i en dosis-afhængig måde (Fig. 6B). Transduktion af Nanog shRNA yderligere styrket de inhiberende virkninger af resveratrol på cellernes levedygtighed i sfæroider. Disse data antyder, at inhibering af Nanog kan forstærke kemoforebyggende virkninger af resveratrol.

(A), Ekspression af Nanog. Pancreas CSCS blev transduceret med røræg eller Nanog shRNA, og Western blot analyser blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​Nanog og GAPDH. (B), blev transduceret celler behandlet med resveratrol (0-30 uM) og sfærer i suspension blev dyrket i en uge. Spheres blev høstet, resuspenderes og levedygtighed celle blev bestemt ved trypanblåt assay.

Resveratrol hæmmer markører for epitelial-mesenkymale overgang, invasion og migration i humane pancreas CSCS

Epithelial at mesenkymale overgange (EMT) er transdifferentiering programmer, der kræves for vævsmorfogenese under fosterudviklingen [32]. EMT-processen kan reguleres ved en bred vifte af cytokiner og vækstfaktorer, såsom TGF, hvis aktiviteter dysreguleret under ondartet svulst progression [33]. Således EMT induktion i cancer celler resulterer i køb af invasive og metastatiske egenskaber. Nylige rapporter viser, at fremkomsten af ​​CSCS sker dels som et resultat af EMT, for eksempel gennem stikord fra tumor stromale komponenter. EMT spiller en afgørende rolle i tumorigenese, cancer progression og medikamentresistens [28], [32], [34]. Nylige undersøgelser viste, at der er en direkte forbindelse mellem EMT program og forstærkningen af ​​epiteliale stamcelle egenskaber [28], [32], [34], [35]. EMT er tilstrækkelig til at inducere en population med stamcelle egenskaber fra veldifferentierede epitelceller og cancerceller. Dernæst undersøgt virkningerne af resveratrol på ekspressionen af ​​EMT markører i pancreas CSCS (fig. 7). Resveratrol hæmmede ekspressionen af ​​Zeb-1, Sneglen og Slug. Resveratrol hæmmede også invasion og migration af pancreas CSCS (fig. 7D og E). Disse data tyder på, at resveratrol kan regulere EMT, invasion og migration ved at hæmme ekspression af Zeb-1, Sneglen og Slug i CSCS. Salg

Pancreas CSCS blev behandlet med resveratrol (0-0 uM) i 24 timer. Ekspressionen af ​​Zeb-1 (A), snail (B) og Slug (c) blev målt ved QRT-PCR. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. * Eller # = signifikant forskellig fra de respektive kontroller, P 0,05. (D), Invasion assay. Pancreas CSCS blev udpladet på Matrigel-coatede membran i øverste kammer i transwell og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 48 timer. Celler invaderet til den nedre kamre blev fikseret med methanol, farvet med krystalviolet og talt. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, eller # = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (E) Migration assay. Pancreas CSCS blev udpladet i det øverste kammer i transwell og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 24 timer. Celler migreret til den nedre kamre blev fikseret med methanol, farvet med krystalviolet og talt. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, eller # = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Resveratrol hæmmer væksten og udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen i Kras

G12D mus

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er karakteriseret ved mutationer i Kras og hyppige deregulering af afgørende embryonale signalveje. Den Kras

G12D

mus udvikler spontane tumorer i bugspytkirtlen, og det virkelig ligner væksten af ​​humane pancreascancer [36]. I

Pdx1-Cre; LSL-Kras

G12D Hotel (

Kras

G12D

) mus, fysiologiske niveauer af

Kras

G12D

fremkalde duktale læsioner at rekapitulere det fulde spektrum af humane PanINs, putative prækursorer til invasiv kræft i bugspytkirtlen. Vi har derfor undersøgt virkningerne af resveratrol på bugspytkirtlen carcinogenese i Kras

G12D mus (fig. 8). Resveratrol inhiberede væksten af ​​pancreas (vægt og størrelse) i Kras

G12D mus sammenlignet med den af ​​ubehandlede kontrol (fig. 8A og B). Gennemsnitsvægten af ​​pancreas fra Kras

G12D mus var ligner Pdx1-Cre mus.

(A), Inhibering af pankreatisk vækst kræft ved resveratrol. Kras

G12D transgene mus blev behandlet med resveratrol (40 mg /kg) med sonde én gang hver dag (mandag – fredag) i ca. 10 måneder (mus alder 12 måneder). Pancreas vægte fra kontrol- og resveratrol behandlede mus blev taget. Vægt af bugspytkirtlen fra PDX-Cre mus blev også taget. (B) Billede af bugspytkirtlen opnået fra kontrol og resveratrol behandlet Kras

G12D mus. (C), Kvantificering af Panin læsioner i pancreas fra kontrol- og resveratrol behandlede Kras

G12D mus. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± S.D. *, @,%, # = Signifikant forskellig fra de respektive kontroller, P . 0,05

kvantificering af Panin læsioner i bugspytkirtlen fra Kras

G12D mus behandlet med eller uden resveratrol i omkring 10 måneder ( alder omkring 12 måneder) er vist i fig. 8C. Ubehandlede (kontrol) Kras

G12D mus viste forskellige stadier af kræft udvikling lige fra Panin-1A til Panin-3 etaper. Til sammenligning behandling af Kras

G12D mus med resveratrol betydeligt hæmmet kræft i bugspytkirtlen udvikling som tydeligt ved reducerede antal af Panin-1A, Panin-1B og Panin-2 læsioner. Interessant resveratrol behandlede Kras

G12D mus viste ingen Panin 3 læsioner. Disse data tyder på, at resveratrol hæmmer vækst og udvikling af bugspytkirtelkræft i Kras

G12D transgene mus.

Resveratrol hæmmer selvfornyelse kapacitet af pancreas CSCS

Vi næste undersøgt, om bugspytkirtlen af Kras

G12D transgene mus harbor cancer stamceller, og om resveratrol hæmmer pancreas CSCS i disse mus. Behandling af Kras

G12D mus med resveratrol helt udryddet pancreas CSCS i Kras

G12D mus ved 12 måneders alderen. Pancreas CSCS isoleret fra Kras

G12D mus udtrykker høje niveauer af stamceller markører (CD133, CD44, CD24 og ESA) og transkriptionsfaktorer (Nanog og Oct-4) (fig. 9A). Udtrykket af disse markører i ubehandlet Kras

G12D var betydeligt højere end PDX-Cre mus. Pancreastumorer udtrykte omkring 1,3-2,5% CSCS isoleret fra 12 måneder gamle Kras

G12D (kontrol /ubehandlede) mus. Da vi ikke har set nogen pancreas CSCS i resveratrol behandlede mus, søgte vi at undersøge, om CSCS fra kontrol /ubehandlede Kras

G12D mus er i stand til at selvfornyende og reagere på resveratrol

in vitro

(fig. 9B). Resveratrol inhiberede selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS som målt ved dannelse af primære og sekundære sfæroider i suspension, og cellelevedygtighed i disse sfæroider. Disse data tyder på, at resveratrol er effektiv til inhibering af selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS afledt af Kras

G12D mus.

(A), blev pancreas CSCS isoleret fra Kras

G12D mus (ca. 12 måneder gamle) ved hjælp af CD133, CD44, CD24, og ESA antistoffer. Ekspressionen af ​​disse markører og Nanog og Oct-4 blev bekræftet ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Væsentlig forskellig fra det samme gen af ​​PDX-Cre mus ved P 0,05. (B), blev CSCS dyrket i suspension og behandledes med resveratrol (0-30 uM) i 7 dage for at frembringe primære sfæroider. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev sfæroider opsamlet, resuspenderet og behandlet med resveratrol i en anden uge for at opnå sekundære sfæroider. Cellelevedygtighed i sfæroider blev målt ved trypan blue assay ved udgangen af ​​7 og 14 dage. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *,%, , ** og ## = signifikant forskellig fra de respektive kontroller, P . 0,05

Diskussion

Kræft stamceller (CSCS) er blevet identificeret i en voksende antal maligniteter og funktionelt defineret ved deres evne til at undergå selv- fornyelse og producere differentierede afkom [37], [38]. Disse egenskaber tillader CSCS at rekapitulere den oprindelige tumor når det injiceres i immunkompromitterede mus. CSCS inden for en epitel malignitet blev først beskrevet i brystkræft og fundet at vise specifikt celleoverfladeantigen ekspression (CD44 + CD24low /-) [39]. Siden da har CSCS blevet identificeret i et stigende antal andre menneskelige maligniteter bruger CD44 og CD24 samt en række andre overfladeantigener. Fysiologiske egenskaber, herunder aldehyd-dehydrogenase (ALDH) aktivitet, er også blevet anvendt til at isolere CSCS fra maligne væv [31], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Stamceller får den hvilende fænotype ved at regulere cellecyklusproteiner og pluripotente stemness faktorer. Kræft stamceller /stamceller kan udvise egenskaber svarende til normale stamceller. Således stamceller er attraktive kandidater til kræft-initierende celler, da deres levetid og selvfornyelse kapacitet kan resultere i ophobning af genetiske mutationer.

Vores undersøgelse viser for første gang, at kræft forebyggende middel resveratrol kan hæmme selvfornyelse kapacitet bugspytkirtelkræft stamceller fra humane primære tumorer og Kras

G12D mus in vitro. Vi kunne ikke observere nogen bugspytkirtelkræft stamceller i Kras

G12D mus behandlet med resveratrol. Men resveratrol hæmmede dannelsen af ​​primære og sekundære spheroids i bugspytkirtelkræft stamceller isoleret fra Kras

G12D mus

in vitro

. Resveratrol inducerer apoptose ved aktivering Capase-3/7 og inhibere ekspressionen af ​​Bcl-2, og XIAP i CSCS. Interessant resveratrol inhiberer også ekspressionen af ​​ABCG2, et multidrug-resistensgen, som er blevet påvist at overudtrykke i CSCS. Endvidere resveratrol inhiberer epitel-mesenkymale overgang ved at inhibere ekspressionen af ​​vimentin, slug og sneglen, og også forsinker CSCs migration og invasion. Disse data tyder på, at resveratrol kan anvendes til at forebygge kræft i bugspytkirtlen.

Vi har for nylig vist, at sulforaphane inhiberede selvfornyelse kapacitet af pancreascancer stamceller som målt ved sfæroid og kolonidannelse [7]. Sulforaphane inhiberede ekspressionen af ​​pluripotente transkriptionsfaktorer (NANOG, Oct-4 og Sox-2). Hæmning af Nanog ved lentiviral-medieret shRNA udtryk forbedret selvfornyelse kapacitet sulforafan. Sulforaphane induceret apoptose ved at inhibere ekspressionen af ​​Bcl-2 og XIAP, phosphorylering af FKFR, og aktivering caspase-3 [7]. Endvidere sulforaphane inhiberede ekspression af proteiner involveret i epitel-mesenkymale overgang (β-catenin, vimentin, twist-1, og ZEB1), hvilket antyder blokaden af ​​signalering involveret i tidlig metastase. Desuden kombination af quercetin med sulforaphane, havde synergistiske virkninger på selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS. Disse data antyder, at sulforaphane enten alene eller i kombination med quercetin kan eliminere cancer stamceller karakteristika. Ligeledes i nærværende undersøgelse, resveratrol hæmmede selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS.

CSCS deler principielle karakteristika med voksne stamceller nemlig selv-fornyelse, høj proliferativ potentiale, clonogenicity, og multipotency [45], [46] , [47]. Derudover har de evnen til på reproducerbar dannelse af den samme tumor fænotype som i patienten og til at undergå differentiering til ikke-tumorigene celler [48], [49], [50]. CSCS blev først isoleret fra patienter med hæmatologiske maligniteter, hvor nogle få celler kunne indlede en ny tumor [51]. I løbet af de sidste par år, blev CSCS også identificeret og isoleret fra faste tumorer, såsom bryst-, hjerne-, colon-, pankreas-, og prostatatumorer [29], [39], [44], [52], [53], [54 ], [55], [56]. I kræft i bugspytkirtlen, er CD44 + /CD133 + pancreas CSCS identificeret [57], [58]. På grund af den observerede heterogenitet i bugspytkirtelkræft, vil brugen af ​​single-celle markører for udvælgelse, karakterisering /identifikation og funktionel evaluering af stamceller /progenitor-lignende bugspytkirtelkræftceller ikke være hensigtsmæssigt. Deregulering af ALDH enzymaktivitet er impliceret i patofysiologien af ​​forskellige hæmatologiske og epiteliale cancere [40], [59], [60], [61], [62], [63], [64]. Indførelsen af ​​FACS-baserede levedygtige celler sortering for ALDH aktivitet (ALDEFLUOR analyser) i tumor biologi har yderligere underbygget en rolle ALDH

hi subpopulationer af kræftceller i carcinogenese [40], [54], [60], [65 ].