PLoS ONE: Quantum Dots for Multiplexed Detection og Karakterisering af prostatacancerceller Brug en Scanning Near-Field Optical Microscope

Abstrakt

I denne undersøgelse scanning nær-felt optisk mikroskopi (SNOM) er blevet anvendt i forbindelse med kvantepunkt mærkning for at afhøre den biomolekylære sammensætningen af ​​cellemembraner. Teknikken overvinder grænserne for optisk diffraktion findes i standard fluorescens mikroskopi og giver også afgørende topografiske oplysninger. Teknikken er blevet anvendt til at undersøge celle-celle adhæsion i humane epitelceller. Dette er blevet realiseret gennem immunfluorescens mærkning af celle-celle-adhæsion protein E-cadherin. Desuden har en dobbelt protokol mærkning blevet optimeret for at lette en sammenlignende undersøgelse af de vedhæftning mekanismer og effekten af ​​afvigende vedhæftning proteinekspression i både raske og kræft epitelceller. Denne undersøgelse rapporterer tydelige forskelle i morfologi og fænotype af sunde og kræftceller. Hos raske prostata epitelceller (PNT2), blev E-cadherin overvejende placeret rundt omkring i cellen periferien og inden filopodial udvidelser. Tilstedeværelsen af ​​E-cadherin syntes at være forbedret, når celle-celle-kontakt blev etableret. I modsætning hertil undersøgelse af metastatiske prostataadenokarcinomceller (PC-3) viste ingen E-cadherin mærkning omkring periferien af ​​cellerne. Denne mangel på funktionel E-cadherin i PC-3 celler faldt sammen med en markant forskellig morfologi og PC-3-celler blev ikke fundet at danne tætte celle-celle foreninger med deres naboer. Vi har vist, at med en fuldt optimeret prøveforberedelse metode, multiplex kvantepunkt mærkning i forbindelse med SNOM billeddannelse med held kan anvendes til at afhøre biomolekylært lokalisering inden sarte cellemembraner

Henvisning:. Walker K-AD, Morgan C, Doak SH, Dunstan PR (2012) Quantum Dots for Multiplexed Detection og Karakterisering af prostatacancerceller Brug en Scanning Near-Field Optical Microscope. PLoS ONE 7 (2): e31592. doi: 10,1371 /journal.pone.0031592

Redaktør: Joel M. Schnur, George Mason University, USA

Modtaget: August 1, 2011; Accepteret: 11 januar 2012; Publiceret: 9 feb 2012

Copyright: © 2012 Walker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. HEFCW er anerkendt for udstyr investeringer (www.hefcw.ac.uk). EPSRC er anerkendt for at levere ph.d.-studerende finansiering (www.EPSRC.ac.uk). Takket være St Davids Medical Foundation Prostata UK (tilskud nummer: G2009 /27) til støtte aspekter af dette arbejde (www.prostateaction.org.uk). SH Doak understøttes af en RCUK Academic Fellowship (www.rcuk.ac.uk). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cellular vedhæftning spiller en vigtig rolle i at bevare arkitekturen i væv og organer, og er afgørende for deres korrekte funktion. Unormal celle-celle-adhæsion har virkninger på udviklingen af ​​mange sygdomme og sygdomme. En samordnet indsats er blevet gjort af mange forskere til at bestemme forholdet mellem cellulær vedhæftning og den metastatiske kapacitet mange kræftformer [1], [2].

E-cadherin er en af ​​de vigtigste mediatorer af celle-celle vedhæftning i epitelvæv og er blevet grundigt undersøgt for at bestemme sin rolle i cancer progression og metastase. Det er blevet påvist, at tabet af E-cadherin ekspression eller funktion er forbundet med forøget invasiv potentiale [3], metastatisk potentiale [4] og fattigere patient prognose [5], [6]. Denne sammenhæng er særlig relevant for prostatacancer, der har en tilbøjelighed til at metastasere og danner sekundære tumorer (primært skelet), hvilket resulterer i en dårlig patient prognose [7], [8]. Selv om der er gjort en stor indsats for at forstå betydningen af ​​E-cadherin i udviklingen af ​​prostatakræft, har forskerne ikke nået til enighed [9], [10]. En mere detaljeret forståelse af vedhæftning mekanismer kan føre til udvikling af nye kræftbehandlinger som angivet med de indledende undersøgelser, som Zhou

et al.

[11] og Mao

et al.

[ ,,,0],12].

Selvom rutinemæssigt anvendes på tværs biovidenskab, konventionel fluorescens mikroskopi teknikker er begrænset af den optiske diffraktion grænse. Adgang information udover diffraktionsgrænsen fra en lang række prøvetyper er muliggjort efter fremkomsten af ​​scanning probe mikroskopi (SPM) teknikker. SPM muliggør undersøgelse af en stikprøve s metrologi nanoskala og scanning nær-felt optisk mikroskopi (SNOM) er et sådant eksempel, som er særlig velegnet til afhøre samspillet og funktioner biologisk materiale [13] – [15]. SNOM har kapacitet til samtidig sonde topografiske og undersøge optiske egenskaber på skalaer, der normalt ikke kan opnås under anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi ved at udnytte egenskaberne af flygtige bølger. En typisk SNOM eksperimentelle opstilling er illustreret i figur 1. Mens der har været hurtige fremskridt (se anmeldelsen af ​​Galbraith og Galbraith [16]) inden for super-opløsning optisk mikroskopi med udvikling af teknikker såsom stimuleret emission udtømning (STED), foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM) og fluorescens billeddannelse med en-nanometer præcision (FIONA) [17], brug af optiske nær-felter til overfladevand eller membran undersøgelser der anvender total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM) har også blive mere almindeligt [18], [19]. I sagens natur, TIRFM begrænser oplyste Z-range og dermed giver bedre opløsning end konfokal mikroskopi. SNOM har fordelene ved TIRFM men derudover frembringer en optisk nær-området, som også rumligt begrænset til nanometer dimensioner i x og y. Desuden sin sonde er kombineret med en topografisk feedback-mekanisme, der gør det muligt at samtidigt afsløre de strukturelle ændringer af prøven sideløbende med sin optiske respons.

Dette papir rapporterer brug af en optimeret protokol dobbelt mærkning til at lede en sammenlignende undersøgelse af vedhæftning mekanismer i både raske og kræft epitelceller. Fokus i undersøgelsen har været en høj opløsning undersøgelse under anvendelse SNOM på funktionen af ​​E-cadherin-protein i to cellelinier. Samt E-cadherin blev tight junction protein ZO-1 valgt som et egnet billeddannende kontrol, som det er udtrykt i plasmamembranen ved celle-celle-grænsen. Således antistoffer mod de adhæsionsproteiner E-cadherin og ZO-1 blev anvendt til indirekte at mærke normal prostata epitelceller PNT2 og prostataadenokarcinomceller PC-3. SNOM teknik undersøger den differentielle sub-cellulære lokalisering af celle-celleadhæsionsmolekyler med høj opløsning og er udført parallelt med genekspressionsstudier at give generelle angivelser på både funktion og ekspression.

Materialer og metoder

Cell Culture

prostata epitelceller, PNT2 og prostataadenokarcinomceller, PC-3, blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). Cellerne blev opretholdt i RPMI 1640 (Gibco, Paisley, UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% L-glutamin, 60 enheder /ml penicillin og 60 ug /ml streptomycin ved 37 ° C /5% CO

2. Cellerne blev sub-dyrket, da de nåede ca. 80% sammenflydning.

For imaging blev celler dyrket på sterile 25 mm cirkulære dækglas. Cellerne blev fikseret ved stuetemperatur under anvendelse 3,7-4% ultra-ren methanol-frit formaldehyd (Park Scientific Ltd., Northampton, UK) i PBS i 15 minutter, efterfulgt af tre 5 minutters vask i PBS /100 mM glycin og dehydreret gennem en ethanol-serien. Prøver blev opbevaret ved 4 ° C, indtil de skal fluorescensmærkning.

RNA-ekstraktion og Real-time polymerasekædereaktion (PCR)

Celler blev dyrket til konfluens i 75 cm

3 kolber . Totalt cellulært RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy ekstraktion kittet (Qiagen, Crawley, UK) og resterende DNA blev fjernet ved behandling med DNA-fri ™ (Ambion, Cambridgeshire, UK) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug RNA ved anvendelse vilkårlige primere og højkapacitets cDNA syntese revers transkription kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Real-time PCR reaktioner blev udført i iCycler iQ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) under anvendelse detektionsmetoder SYBR Green. Primersæt blev designet til at være exon-exon spanning for at minimere muligheden for, at nogen kontaminerende genomisk DNA ville blive amplificeret. De anvendte primersæt blev også testet for at sikre, at de alle demonstrerede lige amplifikationseffektiviteter. Alle reaktioner blev udført tre gange med 2 pi cDNA, 12,5 pi iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) og 0,2 uM forward og reverse primere, i et endeligt reaktionsvolumen på 25 pi. PCR-amplifikation betingelser var 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. Fold udtryk blev normaliseret til PNT2. E-cadherin og ZO-1 blev amplificeret ved anvendelse af primerne vist i tabel 1. Også vist er primersekvenserne for β-actin og HPRT, der blev anvendt som endogene kontroller.

Western blotting

Samlet protein blev ekstraheret under anvendelse af RIPA puffer (Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Tredive mikrogram protein blev kørt på en 7,5% Tris-glycin PAGE geler (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK). Proteiner blev overført til nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i Tween /TBS (alle Sigma-Aldrich, Dorset, UK) for at inhibere ikke-specifik binding og inkuberet natten over ved 4 ° C under anvendelse af muse-anti-ZO-1-antistof (Invitrogen, Paisley, UK ) ved 1:250 og kanin anti-E-cadherin antistof (New England Biolabs, Hertfordshire, UK) ved 1:1000. β-actin (1:1000) blev anvendt som en kontrol for protein loading. Membraner blev vasket fri for primært antistof og inkuberet med peberrodsperoxidase konjugeret sekundært anti-mus /anti-kanin-antistoffer (1:1000) i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved hjælp af Immun-Star WesternC chemiluminescene afsløring kit (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) og kvantificeres ved hjælp af densitometri og Mængde One software (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, UK).

Immunofluorescens

Alle faser blev udført under omgivende betingelser, medmindre andet er angivet. Immunomærkning blev generelt udført inden for 24 timer fiksering. Alle trin af immunofluorescens mærkning protokoller blev optimeret fra de grundlæggende procedurer, der er beskrevet af producenterne; herunder permeabilisering betingelser, blokering trin, koncentration af reagenser, inkuberingsbetingelser og vasketrin. Optimeringen blev afsluttet for hver cellelinje anvendes under denne undersøgelse. Negative kontrolforsøg blev udført sideløbende fluorescens mærkning for at sikre selektiviteten af ​​de fluorescerende mærker. Negative kontroller viste sig ikke at have nogen særskilt mønster mærkning eller at have nogen væsentlig fluorescens udbytte. Til dual label PNT2 celler mod E-cadherin og ZO-1 blev dækglassene skyllet med PBS, permeabiliseres med 0,1% Triton-X i 10 minutter og inkuberes med Image-iT FX signal forstærker (Invitrogen, Paisley, UK) i 30 minutter . Dækglassene blev derefter skyllet og efterfølgende inkuberet med 31 pg /ml muse-anti-ZO-1-antistof (Invitrogen, Paisley, UK) i 2 timer ved 37 ° C. At mærke ZO-1 med quantum dots, blev dækglassene inkuberet med 30 nM Qdot 525 gede-anti-muse-IgG-konjugat (Invitrogen, Paisley, UK) i 1 time. Kanin anti-E-cadherin primære antistof (Abcam, Cambridge, UK) blev derefter påført til cellerne ved en koncentration på 18 ug /ml og dækglas blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. At mærke E-cadherin med quantum dots, blev Qdot 605 gede-anti-kanin påført i en koncentration på 20 nM og henstår i 1 time (Invitrogen, Paisley, UK). Før billeddannelse, blev dækglassene skyllet i PBS for at fjerne overskydende ubundne quantum dots. For at lette SNOM billeddannelse blev prøver yderligere skyllet i vand, dehydreret gennem en ethanolserie og lufttørret. Til dual mærkning af PC-3-celler en lidt anden protokol var påkrævet. For at reducere baggrunden farvning blev dækglas blokeret med PBS /100 mM glycin før anvendelsen af ​​antistoffer og rækkefølgen af ​​ansøgningen var E-cadherin primært antistof, Qdot 605 gede-anti-kanin-antistof, ZO-1 primært antistof og Qdot 525 gede-anti -mouse sekundært antistof (20 nM-koncentration blev anvendt til Qdot 525, alle andre koncentrationer og inkubationstider var som for PNT2 celler). Prøver blev observeret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi før SNOM billeddannelse at kontrollere, at mærkningen var blevet antaget. Prøver blev afbildet inden for 48 timers forberedelse.

SNOM imaging

De SNOM billeder blev opnået ved hjælp af en Aurora 3 (Veeco Instruments, Cambridge, UK), ved hjælp af aluminium belagt fiberoptiske sonder med resonansfrekvens 80-110 kHz og blænde på ca. 50-100 nm, som angivet af fabrikanterne (Veeco Instruments, Cambridge, UK). En 488 nm Ar

+ laser blev brugt til excitation og transmission signaler blev opsamlet med en 40 ×, 0,65 NA kollektion mål. Signalerne blev ført gennem en 488 nm Raman kant (high pass) optisk filter til at fjerne lys fra laseren. Til billedet af placeringen af ​​ZO-1 proteiner (mærket med grønne udsender quantum dots), blev den resterende lys ledes gennem et 525 nm optisk båndpasfilter, at fjerne røde fluorescens, og fokuseret på en lavine fotodiode (APD). Til billedet af placeringen af ​​E-cadherin proteiner (mærket med røde udsender quantum dots), blev en 609 nm optisk båndpasfilter udnyttet. I denne artikel de APD signaler, som opstår på grund af fluorescens præsenteres og typiske APD integration tider var 20 ms /pixel, med billedopløsning på 300 x 300 pixels.

Statistisk analyse

For at teste antagelse, at data normalt blev uddelt, var normale plots udført for hver gruppe. En prøve Kolmogorov-Smirnov statistik resulterede i p-værdier 0,05 indikerer data normalfordelt. Analyse blev derfor udført ved hjælp af parametrisk ANOVA test. Dunnett post hoc-analyse blev udført for at sammenligne cancercellelinier med ikke-kræft cellelinie kontrol og Tukey post-hoc-analyse blev udført for multiple gruppesammenligninger. En

s

-værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Expression Analysis

Genekspression data blev opnået gennem real-time polymerasekædereaktion (PCR) og for E-cadherin, afslørede et statistisk signifikant fald (-7,25 gange) i udtryk i PC-3 (

s

= 0,001) i forhold til PNT2. For ZO-1, selvom ekspression blev nedreguleret i PC3 i forhold til PNT2 (-1,20 gange) dette blev ikke anset for signifikant (figur 2).

Expression niveauer er blevet normaliseret mod to husholdning gener og ændre i ekspression i forhold til PNT2 illustreret. * Angiver signifikant forskel (P 0,05). Sammenlignet med PNT2

Western blot-analyse afslørede, at nedregulering af E-cadherin var også tydelig på proteinniveauet. Densitometri afslørede en 2,6 fold nedregulering af E-cadherin i PC-3 cellelinie forhold til PNT2. Protein- niveauerne for ZO-1 blev også nedregulerede (-1,05 gange) i forhold til PNT2, der understøtter genekspression data (figur 3).

En signifikant nedregulering af E-cadherin observeres mens forskelle i ZO-1-proteinekspression mellem cellelinierne er mindre signifikant. Bemærk, β-actin blev brugt til en lastning kontrol.

Dual mærkede PNT2 celler

For at opnå filter adskillelse af fluorescens signaler produceret af de dobbelte mærkede prøver, det var vigtigt at udnytte kvantepunkter som udsender på tydeligt adskilte bølgelængder, hvorfor valget af kvantepunkter med emissionsbølgelængder på 605 nm og 525 nm. PNT2 prøver blev undersøgt under anvendelse af SNOM og billederne vist i figur 4 blev frembragt. Topografi oplysninger kan ses i figur 4A, som blev erhvervet for at demonstrere, at den omfattende protokol dobbelte mærkning ikke resulterede i ændringer i strukturen af ​​prøven. Som det kan ses i figur 4A, forblev cellestrukturen velbevaret og funktioner kan tydeligt skelnes.

Images afslører topografi (A og E) og fluorescens (B, C og D) respons. Billeder (B) og (C) blev opnået med forskellige filtre til spektralt skelne mellem rød og grøn fluorescens, identificere ZO-1 og E-cadherin steder hhv. Den indrammede region i (A) blev scannet ved højere opløsning til generering af detaljerede E-cadherin fluorescens billede (D) og den ledsagende topografi er vist i (E). Kredsede regioner i (C) og pilen /pilespids i (D) highlight E-cadherin klynger.

Tilsvarende optiske billeder blev erhvervet for topografi billedet vist i figur 4A at afsløre placeringen af ​​ZO- 1 og E-cadherin (vist i figur 4B og 4C henholdsvis). Genekspression analyse afslørede ZO-1 udtrykkes i begge cellelinier og således med henblik på denne undersøgelse blev det anvendt som en positiv kontrol. Trods en forholdsvis lav signal-baggrundsstøj-forhold på ~5.6, figur 4B viser, at ZO-1-proteiner er hensigtsmæssigt placeret ved cellens periferi i PNT2 celler.

Ved behandlingen E-cadherin (figur 4C), betydeligt forbedrede signal-til-støj-niveauer på over ~33 nås. Den fineste kvalitet af de opnåede billeder skyldes sandsynligvis den lysere arten af ​​de røde kvantepunkter forhold til grøn. Figur 4C afslører E-cadherin findes primært langs PNT2 celle grænser med særligt høje niveauer af fluorescens koncentreret i bestemte regioner (kredsede i figur 4C).

For at undersøge regioner med høj fluorescerende aktivitet i mere detaljeret, den indrammede område i figur 4A blev efterfølgende scannet ved højere opløsning. Den resulterende topografi billede (Figur 4E) afslører et netværk af filopodia fra nabolandet celler, der har etableret kontakt. Den samtidigt erhvervede fluorescens billede er vist i figur 4D. En række af fluorescens svarende til E-cadherin placering kan ses løber parallelt med kanten af ​​en celle (se pil på figur 4D). Yderligere rækker af fluorescens er også til stede langs længden af ​​det store filopodium i midten af ​​billedet (identificeret ved pilespids). Disse resultater bekræfter, at lokaliseringen af ​​E-cadherin held kan undersøges i prøver, der har været dobbelt farves.

Strukturel Analyse af PC-3 celler

For at sammenligne morfologi sunde og kræftceller blev lyse felt mikroskopi billeder oprindeligt opnået. Konfluente PNT2 celler er vist i figur 5A, mens PC-3-celler er vist i figur 5B. PC-3 celler vise en markant anderledes udseende: nogle PC-3 celler vise en sfærisk morfologi, mens andre synes mere langstrakt og fibroblast-lignende, ofte besidder langstrakt lamellipodia

Inden immunomærkning af PC. -3 celler, deres morfologi blev yderligere undersøgt ved hjælp af høj opløsning SNOM topografi opkøb. De i figur 6 billeder direkte bekræfte observationerne af figur 5. Nogle celler vises kugleformede som vist i figur 6A, mens andre udviser en mere fibroblastlignende morfologi med langt, forgrening cytoplasmiske fremspring (som angivet ved pile i fig 6C og 6D) . Disse fremspring er betydeligt længere end den filopodia typisk observeret på raske celler og blev ofte fundet at omfatte længder større end 25-30 um, dvs. ud over størrelsesinterval topografien scanninger. Derudover målinger viser deres diameter til at være meget større end den finere filopodia, hvoraf nogle kan skelnes rager ud fra lamellipodia som angivet ved pile i figurerne 6C og 6D. Disse større fremspring tendens til at nedtrappe deres længde øges dog på deres bredeste sted, de blev anset for at måle op til 2,1 m og at nå højder på op til ca. 300 nm. Målinger på de finere fremspring observeret i disse billeder afslørede bredder på mellem 120-340 nm. Cellernes kerner (angivet ved N) kan tydeligt skelnes i figur 6A og 6B. De indrammede områder i figur 6A og 6B repræsenterer områder, der efterfølgende blev zoomet ind. Dette gjorde det muligt overlegen kontrast mellem træk af samme højde og eksponeret meget mere detaljeret.

Image (A) er et typisk eksempel på en ikke-sammenflydende PC-3 prøve. Den stiplede firkant angiver en region, der er blevet undersøgt nærmere, hvilket kan ses i billedet (C). I disse billeder PC-3 celler udviser cytoplasmatiske fremspring, der er angivet med pilen i billedet (C). Billeder (B) og (D) viser en mere sammenflydende fordeling af PC-3-celler. En zoomet region er skitseret på billedet (B) og billede (D) er den resulterende zoom. Den højere opløsning tydeligt afslører løs celle-celle foreninger langs grænsen mellem cellerne; denne grænse er angivet med etiket M. I billedet (D) de cytoplasmatiske fremspring igen mærket med en pil. Andre mærker, der anvendes i figurerne omfatter pilespidser at angive filopodia steder og etiketten N fremhæve cellekernen.

I modsætning til konfluerende PNT2 celler, PC-3-celler synes ikke at danne meget tæt foreninger med naboceller. Dette fremgår af de viste billeder i figur 6B og 6D. Huller på op til 2,1 um omkring periferien af ​​cellerne er observeret og ingen tætning langs grænsen mellem hosliggende celler er blevet etableret (den celle-celle-grænsen er angivet med etiket M på figuren). Talrige fine filopodial extensions kan ses at rage over disse huller; dog få synes at interagere med dem fra modstående celler. Dette er bemærkelsesværdigt anderledes PNT2 celler, hvor filopodia fra tilstødende celler blev observeret at interdigitate tværs af intercellulære region. Når PNT2 celler opnået høj sammenflydning blev cellerne fuldt forseglet sammen, og ingen huller kunne skelnes.

Dual-mærket PC-3 celler

For at vurdere sub-cellulære lokalisering af E- cadherin protein i PC-3 celler, blev dobbelt mærkning igen foretaget. Typiske SNOM erhvervelser af dobbelt mærkede PC-3-celler er vist i figur 7. topografisk billede er vist i figur 7A og viser en enkelt celle, hvis kerne (mærket ved N) klart adskiller. Målinger viser, at den maksimale højde for denne celle er nået over den nukleare region, som svarer til ca. 890 nm. Den lamellipodium (mærket ved L) kan ses og viste sig at spænde over et areal på omkring 90 um

2. En stor cellulære fremspring er synlig på cellen og er identificeret ved en etiket P på billedet. Målinger viser, en bredde på 6,2 ± 0,1 um på sit udgangspunkt.

Billeder afslører celle topografi (A) og fluorescens (B, C, D og E). Kernen identificeres ved N, lamellipodium ved L og fremspring af P. ZO-1 lokalisering er vist i billederne (B og D), mens E-cadherin mærkning er vist i (C og E). De indrammede områder i (B og C) svarer til de detaljerede zoom regioner vises i (D og E) henholdsvis. Pilen i (D) fremhæver overlegne periferi mærkning af ZO-1.

Tilsvarende SNOM fluorescens erhvervelser er vist i figurerne 7B og 7C og blev opnået under anvendelse af forskellige optiske båndpasfiltre til at skelne mellem ZO- 1 og henholdsvis E-cadherin. En efterfølgende zoomet område (fremhævet i figur 7B og 7C) blev genereret af softwaren til at aktivere cellens periferi, der skal løses i flere detaljer. Figurerne 7D og 7E viser den relative mærkning af ZO-1 og E-cadherin henholdsvis.

Som tidligere observeret med PNT2 celler, signal-til-støj-forhold opnået med de grønne quantum dots i figur 7B er mærkbart mindre i forhold til niveauet for røde quantum dots i figur 7C. Signal-støj-forhold på figur 7B er ~7.2. Korrelere ZO-1 fluorescens billede (figur 7B) med topografien (figur 7A) afslører fluorescens over området af den celle, der svarer til kernen. Men fluorescens kan også tydeligt identificeres langs periferien af ​​den cellulære fremspring og er identificeret med pile i billedet vist i figur 7D. Mens ZO-1 var primært et værktøj til styring, har denne omfordeling af fluorescens i det nukleære region (svarende til E-cadherin) set i tidligere undersøgelser [20], [21].

Figur 7C viser erhvervelsen SNOM opnået at undersøge lokaliseringen af ​​E-cadherin proteiner i PC-3-celler ved at registrere nærfelt fluorescens respons røde emitterende kvantepunktet mærkning. Selvom billedet viser en kraftig fluorescens respons fra prøven, er det signal-støj-niveau (~14.6) især reduceret i forhold til det observerede ved undersøgelsen E-cadherin i PNT2 celler. Desuden fluorescenssignaler er indlysende overvejende omkring omkredsen af ​​kernen og er også fundet at udvide nogle måde langs længden af ​​fremspringet. Dette kan ses mere tydeligt i figur 7E, der repræsenterer en zoom på den boxed region i figur 7C. Trods denne reaktion, synes der ikke at være nogen væsentlig E-cadherin mærkning mønster omkring periferien af ​​cellen i de regioner, der bibringer celle-celle-kontakt, som blev set med PNT2 cellelinie. Dette giver en klar indikation af en mangel på passende protein lokalisering i PC-3 celler.

Diskussion

Efter tidligere undersøgelser af vedhæftning mekanismer i raske epitelcelle linje PNT2 [22], en metodologi dobbelt mærkning er blevet udviklet for at lette undersøgelsen af ​​adhæsionsmolekyler i andre cellelinjer. Omfattende optimering af de protokoller, var nødvendig for at generere høj kvalitet fluorescerende prøver og sikre, at immunomærkning præcist afspejler fordelingen af ​​proteiner på cellemembranen. Mange forberedelse aspekter blev taget i betragtning under denne procedure med henblik på at opnå en effektiv mærkning med højt signal respons og lav mærkning baggrund, som beskrevet i Materialer og metoder.

Genekspression analyse viste en signifikant nedregulering i E- cadherin ekspression i PC-3-cellelinjen sammenlignet med kontrollen cellelinie PNT2. Dette blev valideret på proteinniveauet ved Western blotting og er indforstået med andre undersøgelser, der viser E-cadherin-protein udtryk, der skal nedreguleres i PC-3-celler [23]. ZO-1-proteinekspression i begge cellelinier viste sig at være kun lidt ændret og kunne således virke som et egnet styresignal. Derfor blev anset en dobbelt tilgang mærkning nødvendig for undersøgelser af E-cadherin lokalisering ved hjælp af SNOM som ZO-1 afsløring vil sikre optisk detektion i vores SNOM instrument var optimal, især i tilfælde af, at ikke kunne påvises E-cadherin signaler. For at løse de vanskeligheder under dobbelt mærkning af PC-3, blev E-cadherin proteiner immunolabelled med lysere (på grund af deres højere kvante udbytte) røde udsender quantum dots. Optimering af de protokoller, var forpligtet til at sikre, at en effektiv mærkning blev opnået med et præcist signal respons. Dette var sværere at opnå på PC-3-cellelinjen, som E-cadherin ekspression er reduceret, og en dårligt udviklet protokol mærkning kunne simpelthen være mærkning af E-cadherin dårligt. Dette ville igen præsentere sig som afspejler en ændring af udtryk. Fra denne omfattende optimering, var dobbelt mærkning succes opnået og dermed lettet studiet af lokaliseringen af ​​E-cadherin og ZO-1-proteiner i to prostata epiteliale cellelinjer under anvendelse af høj opløsning SNOM billeddannelse.

Analyse af dobbelt mærkede sunde epitel PNT2 celler afslørede, at E-cadherin er overvejende placeret langs cellens periferi og optrådte forbedret i områder, hvor celle-celle kontakt blev oprettet. Dette blev påvist ved de punktformig klynger af E-cadherin, som blev observeret, når filopodia etableret kontakt og indledte celle-celle-adhæsion, som blev vist i figur 4C. PNT2 celler viste sig at danne den typiske brosten udseende, der er karakteristisk ses i normale epithelvæv. Dette var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, hvor kun lokalisering af E-cadherin proteiner blev undersøgt [22]. Som forventet blev også fundet ZO-1-proteiner at være lokaliseret omkring periferien af ​​de PNT2 celler. Dette blev klart demonstreret i figur 4B trods kvaliteten af ​​ZO-1 fluorescensbilleder være ringere end dem, der opnås for E-cadherin, på grund af de kvanteudbytte forskelle kvantepunkterne anvendte.

Undersøgelsen blev udvidet til undersøge cancrøse PC-3-celler. Oprindeligt morfologi disse metastatiske celler blev analyseret gennem købet af SNOM topografi billeder. PC-3-celler blev fundet at være forskellige i struktur med raske epitelceller på mange måder. For det første blev deres samlede form fundet at være mere uregelmæssig med nogle celler under forudsætning af en fibroblast-lignende morfologi i forhold til den mere brosten udseende af sunde celler. For det andet, PC-3-celler var ofte vanskeligt at billedet på grund af deres pludselige funktioner. PC-3-celler almindeligvis besad lange cytoplasmatiske fremspring ud over den filopodia rutinemæssigt observeret på raske celler. Endelig undersøgelse af flere sammenflydende prøver viste, at PC-3 celler danner løse foreninger med naboceller med få modsatrettede filopodia interagere. Huller blev ofte observeret omkring periferien af ​​cellerne (som vist i figur 6D), i modsætning til de stramme sæler, der blev observeret under behandlingen af ​​PNT2 celler. Morfologi PC-3 celler observeret i denne undersøgelse med SNOM bekræfter tidligere observationer af Lang

et al.

[24] ved hjælp af fasekontrast mikroskopi og scanning elektronmikroskopi.

Når billeddannelse med SNOM , tegning kvantitative sammenligninger af ekspressionsniveauer baseret på antallet af tællinger optagne bliver vanskelig, når forskellige SNOM prober er blevet anvendt. Men anvendelse af signal-til-støj-forhold i stedet for de absolutte tællinger med til at kompensere for forskelle, der måtte opstå med en ændring af SNOM probe. Efterfølgende analyse af sub-cellulære lokalisering af E-cadherin og ZO-1 proteiner i PC-3 celler blev foretaget. Fluorescens SNOM erhvervelser afslørede tilstedeværelsen af ​​ZO-1 på periferien af ​​cellulære fremspring ud over at blive observeret i den nukleare region. Selvom det ikke er det primære fokus for denne undersøgelse, denne iagttagelse bekræfter resultaterne af andre rapporter, hvor udflytning af ZO-1 ses [21].