PLoS ONE: FK-16 Afledt af Anticancer peptid LL-37 inducerer Caspase-Uafhængig Apoptose og Autophagic celledød i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Host immune peptider, herunder cathelicidiner, er blevet rapporteret at besidde anticancer egenskaber. Vi har tidligere rapporteret, at LL-37, den eneste cathelicidin hos mennesker, undertrykker udviklingen af ​​tyktarmskræft. I denne undersøgelse den potentielle anticancer effekt af FK-16, et fragment af LL-37 svarende til resterne 17 til 32, på dyrkede colon cancerceller blev evalueret. FK-16 inducerede et unikt mønster af celledød, præget af samtidig aktivering af caspase-uafhængig apoptose og autofagi. Førstnævnte blev medieret af nukleare translokation af AIF og EndoG mens sidstnævnte var præget af øget ekspression af LC3-I /II, Atg5 og Atg7 og øget dannelse af LC3-positive autophagosomes. Knockdown af Atg5 eller Atg7 svækket cytotoksiciteten af ​​FK-16, hvilket indikerer FK-16-induceret autophagy var pro-død i naturen. Mekanistisk til FK-16 aktiverede nuklear p53 opregulerer Bax og nedregulerer Bcl-2. Knockdown af p53, genetisk ablation af Bax, eller overekspression af Bcl-2 omvendt FK-16-induceret apoptose og autofagi. Vigtigere, afskaffelse af AIF /EndoG-afhængig apoptose forbedret FK-16-induceret autophagy mens afskaffelse af autofagi augmented FK-16-induceret AIF- /EndoG-afhængig apoptose. Kollektivt, FK-16 inducerer caspase-uafhængig apoptose og autophagy gennem den fælles p53-Bd-2 /Bax kaskade i tyktarmen kræftceller. Vores undersøgelse også afsløret hidtil ukendte gensidig regulering mellem disse to celledød veje

Henvisning:. Ren SX, Shen J, Cheng ASL, Lu L, Chan RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 Afledt af Anticancer peptid LL-37 inducerer caspase-Uafhængig Apoptose og Autophagic celledød i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10,1371 /journal.pone.0063641

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: November 21, 2012; Accepteret: April 4, 2013; Udgivet: May 20, 2013 |

Copyright: © 2013 Ren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Antimikrobielle peptider (ampere), også kendt som vært. forsvar peptider, findes i eukaryote celler som en konserveret komponent i det medfødte immunsystem. AMP’er udføre første linje forsvar mod infektion ved at fungere som “naturlige antibiotika” ved direkte drab af patogene mikrober [1], [2]. Selektiviteten af ​​sluttrin til bakterieceller er afhængig af deres kationiske strukturer, der er afgørende for interaktion med negativt ladede bakterielle membraner [3], [4]. Ny dokumentation tyder på, at Amps kan også selektivt binder til kræftceller, utransformerede celler på grund af den forøgede overflade eksponering af negativt ladet phosphatidylserin i cancer [5]. Øgede niveauer af O-glykosyleret muciner, negativ membran potentiale og øget membran flydende og celle-overfladeareal i kræftceller, kan også bidrage til denne selektivitet [6]. Talrige AMP’er af human (f.eks β-definsin, LL-37) og ikke-humane (f.eks BMAP-28, lactoferricin B, magainin II, melittin, tachyplesin I) oprindelser er blevet demonstreret at udøve cytotoksicitet på cancerceller gennem diverse mekanismer [6 ]. For eksempel bovin lactoferricin B induceret mitokondriel pathway af apoptose i humane leukæmi- og carcinoma cellelinier, men ikke ikke-transformerede celler gennem generering af reaktive oxygenarter [7]. Magainin II også celledød i blære cancerceller, men ikke normale fibroblaster gennem poredannelse på cellemembranen og efterfølgende cellelysis [8]. Humant β-definsin-1, som udviste kræftspecifikke tab af ekspression i renal clear cell carcinoma, induceret caspase-3-medieret apoptose i den renale cancercellelinie SW156 [9]. Ifølge AMP database (https://aps.unmc.edu/AP/main.php), er over 130 sådanne peptider vides at have anticancer egenskaber [10]. Salg

cathelicidiner er en familie af evolutionært konserverede forstærkere. hCAP-18 er det eneste cathelicidin hos mennesker. Denne 18-kDa præproprotein består af en N-terminal signalsekvens, en cathelin-lignende domæne og et C-terminalt AMP domæne. Proteolytisk spaltning af hCAP-18 frigiver et 37-rest, amfipatisk, spiralformet peptid kendt som LL-37. Dette peptid udskilles af knoglemarvsceller, cirkulerende leukocytter og mange typer af epitelvæv, såsom hud og gastrointestinale slimhinder. LL-37 ikke blot udviser en board spektrum af antimikrobielle aktiviteter (fx bakterier, svampe og vira), men også har evnen til at neutralisere bakterielle lipopolysaccharider. Vigtigere, LL-37 kunne mediere medfødte immunitet gennem regulering kemotaxi af leukocytter (f.eks neutrofiler, monocytter, T-celler, eosinofiler og mastceller) og produktion af cytokiner på steder med infektion og inflammation samt fremme re-epitelisering i løbet sårheling [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Kumulativ beviser fra tumor biologiske undersøgelser viser, at LL-37 spiller en fremtrædende rolle i carcinogenese [15]. For eksempel, LL-37 udøver anticancer effekter på mavekræft og T leukæmiceller [16], [17]. Den C-terminale fragment af LL-37 udviser også cytotoksicitet over for både resistente og lægemiddel-sensitive orale epitheloid carcinoma celler [18]. Vores tidligere undersøgelse viste også, at ekspressionen af ​​LL-37 bemærkelsesværdigt blev nedreguleret i humane coloncancer væv, hvorimod exogen LL-37 induceret apoptotisk celledød i dyrkede colon cancerceller. Vigtigere, udviste cathelicidin-defekte mus øget modtagelighed for azoxymethan-induceret colon carcinogenese [19]. Disse resultater tyder på, at LL-37 er et endogent tumor-undertrykke peptid.

I betragtning af dets betydning i immunologi og kræftforskning, er blevet sat indsats frem for at studere de strukturelle og biofysiske egenskaber af LL-37. Moon

et al.

Først beskrevet anvendelsen af ​​glutathion S-transferase fusion system til ekspression og oprensning af isotop-mærket LL-37 i

Escherichia coil

[20]. Strukturel analyse ved NMR-spektroskopi viste, at LL-37 er kendetegnet ved en lang amfipatisk helix spænder over resterne 2-31 med hele molekylet buede et tog af hydrofobe sidekæder [21]. Ramamoorthy

et al.

Viste, at LL-37 Orients nær overfladen af ​​phospholipid-dobbeltlag og danner oligomere strukturer [22]. Til dette formål LL-37 besidder evnen til at forstyrre cellemembranen [23], [24], [25].

Omkostningerne forbundet med kemisk syntese er en af ​​de begrænsende faktorer, der hæmmer anvendelsen af ​​peptider som terapeutiske midler. Det er derfor vigtigt at identificere den funktionelle region i LL-37, således at kortere fragmenter, som bibeholder den biologiske aktivitet af fuldlængde-peptidet kan fremstilles med lavere omkostninger. Tidligere struktur-funktions-analyse af forskellige LL-37-fragmenter har vist, at LL7-27, en 21-rest peptid afledt fra rester 7-27 af LL-37, udviser potent aktivitet mod mikrober (især grampositive bakterier) gennem afbrydelse af lipiddobbeltlag struktur [26]. En anden undersøgelse viste, at det N-terminale fragment LL-12 svarende til resterne 1-12 af LL-37 er inaktivt mod bakterier eller cancerceller hvorimod FK-16 svarende til resterne 17-32 bevarer antibakterielle og antitumor virkninger [27]. Dette fragment har endda en bedre aktivitet mod prokaryoter og celler med kerne end fuld længde peptid på [28], hvilket tyder på, at FK-16 kan være en lovende kandidat til yderligere karakterisering som en ny anticancer peptid. I den foreliggende undersøgelse,

in vitro

anticancer effekt af FK-16 blev undersøgt.

Resultater

FK-16 versus LL-37 ved induktion af celledød i Colon cancer Cells

de cytotoksiciteter af FK-16 og i fuld længde LL-37 blev oprindeligt undersøgt i to humane colon cancer cellelinjer (LoVo og HCT116) ved MTT-analysen. Som vist i fig. 1A, både FK-16 og LL-37 reducerede signifikant levedygtighed LoVo og HCT116-celler på en dosis-afhængig måde. Mærkbart, FK-16 udviste en bedre aktivitet mod tyktarmskræft celler end LL-37. Desuden FK-16 havde en minimal effekt på levedygtigheden af ​​humane normale kolon slimhinde epitelceller NCM460 celler. En kontrol-peptid med scrambled sekvens af FK-16 havde også ubetydelige virkninger på LoVo og HCT116, hvilket indikerer FK-16 medieret selektivt drab af cancerceller. Som HCT116 var mere følsom end LoVo til FK-16, blev HCT116 udvalgt til efterfølgende mekanistisk forsøg og behandlet med enten 20 uM eller 40 uM FK-16, ved hvilket -20% og -50% af cytotoksicitet indtraf.

(A) Virkninger af LL-37, FK-16, og krypterede FK-16 (48 h) på levedygtigheden af ​​colon cancerceller (HCT116, LoVo) blev bestemt ved MTT-assayet. Den cytotoksiske effekt af FK-16 blev også analyseret i humane normale kolon slimhinde epitelceller NCM460 celler. (B) phosphotidylserin eksternalisering i HCT116-celler behandlet med eller uden FK-16 blev bestemt ved flowcytometri af PI /Annexin V-farvede celler. (C) Virkninger af FK-16 om PARP spaltning og caspaseaktivering i HCT116 celler blev bestemt ved Western blot. Cisplatin blev anvendt som en positiv kontrol for caspaseaktivering. (D) at forbehandle HCT116 celler med den pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk i 1 time forhindrede ikke FK-16-induceret tab af cellelevedygtighed som bestemt ved MTT-assayet (24 h). (E) Nuklear ekspression af AIF og EndoG i HCT116-celler blev analyseret ved Western blot-analyse af fraktionerede proteiner. GAPDH og Lamin A /C blev anvendt som interne kontroller for cytosolisk (Cy) og nukleare (NU) proteiner, hhv. (F) Virkninger af FK-16 (6 timer) på subcellulære lokalisering af AIF (grøn) og EndoG (rød) i HCT116 blev bestemt ved konfokal immunofluorescens (400 ×). (G) Knockdown AIF og EndoG delvist vendt phosphotidylserin eksternalisering induceret af FK-16 (40 uM, 24 h) i HCT116. Celler blev provokeret med FK-16 ved 48 h efter transfektion af AIF- og EndoG-siRNA’er. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre separate forsøg. *,

s

0,05; **,

s

. 0,01, signifikant forskellig fra den respektive kontrolgruppe

Induktion af AIF /EndoG-afhængige Apoptose af FK-16

Vi har tidligere vist, at LL-37 kunne inducere caspase-uafhængig apoptose i colon cancerceller [19]. At afgøre, om apoptose medieret cytotoksiciteten af ​​FK-16, blev tabet af phosphatidylserin asymmetri, som er kendetegnende for apoptose, kvantificeres ved cytometri af propidiumiodid /Annexin V double-farvede celler. Som vist i fig. 1B, FK-16 induceret phosphatidylserin eksternalisering der er dækket af propidiumiodid

+ -celler, indikerer, at FK-16 induceret apoptose men ikke nekrotisk celledød. Ved begge 24 timer og 48 timer tidspunkter, har FK-16 behandling ikke øge PARP kløvning eller aktivere caspase-3 og 7 (fig. 1C). Samstemmende, den pan-caspaseinhibitoren z-VAD-FMK undladt at vende tabet af cellelevedygtigheden forårsaget af FK-16 (fig. 1D). Disse resultater antydede, at FK-16 inducerede apoptose i en caspase-uafhængig måde. AIF og EndoG, oprindeligt lokaliseret i mitochondrierne og translokeres til kernen ved aktivering, er kendte mediatorer af caspase-uafhængig apoptose [29]. Immunoblotting under anvendelse af fraktionerede proteinlysater viste, at FK-16 steg de nukleare niveauer af AIF og EndoG (fig. 1E). Immunofluorescens bekræftede, at AIF og EndoG omfordeles fra cytosolen til cellekernen i FK-16-behandlede HCT116 celler (fig. 1F). Den funktionelle inddragelse af AIF og EndoG i FK-16-induceret apoptose blev yderligere bekræftet af RNA-interferens eksperimenter, hvor knockdown af AIF eller EndoG svækket phosphatidylserin eksternalisering induceret af FK-16 (fig. 1G). Disse resultater viste, at, svarende til LL-37, FK-16 inducerede AIF /EndoG-afhængige, men caspase-uafhængig apoptose i tyktarmskræft celler.

Induktion af Autophagic celledød ved FK-16, men ikke LL-37

for at bestemme virkningen af ​​FK-16 på en anden caspase-uafhængig celledød pathway, nemlig autophagic celledød [30], analyserede vi ekspressionen af ​​LC3 protein (især LC3-II, som vides at korrelere med omfanget af autofagi) og to andre autophagy-relaterede proteiner, dvs. Atg5 og Atg7. Resultaterne viste, at FK-16 steg LC3-I og LC3-II samt Atg5 og Atg7 proteinekspression (fig 2A . 2B). FK-16 inducerede også dannelsen af ​​LC3

+ autophagic vakuoler i HCT116 (fig. 2C). Både induktionen af ​​LC3-I /II-ekspression og dannelse af LC3

+ autophagic vakuoler af FK-16 kunne blokeres af 3-methyladenin, en klasse III phosphoinositid 3-kinase-inhibitor. Derimod fuldlængde LL-37-peptidet havde minimal virkning på LC3-I /II-ekspression (data ikke vist). Ultrastrukturelle analyse ved elektronmikroskopi viste, at en 48 h-eksponering for FK-16 inducerede massiv vakuolisering i HCT116-celler, hvor der blev observeret lamellare og myelin-lignende strukturer ligner sene autophagic vakuoler (fig. 2D). Dannelse af sure vesikulære organeller, som er et vigtigt kendetegn for autophagy, blev også forbedret af FK-16 som bestemt ved vital farvning af HCT116 celler med acridinorange, et farvestof, der udsender lys rød fluorescens i sure vesikler men fluorescerer grønt i cytoplasmaet og kernen (fig. 2E). Dannelsen af ​​autolysosomes blev også forøget i FK-16-behandlede celler som visualiseret ved monodansylcadaverin farvning (data ikke vist). Stigningen i autophagic flux forårsaget af FK-16 blev bekræftet ved behandling HCT116 celler med FK-16 og bafilomycin A

1 (a lysosomotropiske middel), alene eller i kombination. Inhibering af lysosomal funktion ved bafilomycin A

1 øgede niveauer af både LC3-I og -II induceret af FK-16 (fig. 2F), hvilket antyder, at FK-16 steg autophagic flux. Afhængig af cellulær kontekst, kan autofagi tjene som en pro-dødsfald eller pro-overlevelse mekanisme. For at bestemme den funktionelle rolle af autofagi induceret af FK-16, blev en RNA-interferens fremgangsmåde, der anvendes til at ophæve autofagi ved at målrette Atg5 og Atg7, som begge er nødvendige for dannelsen af ​​autophagosomes i den tidlige fase. Knockdown af Atg5 eller Atg7 reducerede signifikant den cytotoksiske virkning af FK-16 (fig. 2G), hvilket antyder, at FK-16 induceret autophagic celledød i colon cancerceller. Salg

(A) HCT116 celler udviste forøget protein ekspression af LC3-i /II efter behandling med FK-16 i 24 timer og 48 timer. LC3 udtryk fremkaldt af FK-16 blev afskaffet ved autophagy inhibitor 3-MA (5 mM, 1 time før behandling). (B) FK-16 inducerede også Atg5 og Atg7 proteinekspression. (C) behandling HCT116 med FK-16 i 24 timer eller 48 timer tydeligt forbedret dannelsen af ​​autophagic vakuoler som bestemt ved immunfluorescensfarvning for LC3 (400 ×). Dannelsen af ​​LC3

+ autophagosomes induceret af FK-16 blev blokeret af 3-MA. (D) Ultrastrukturel analyse ved elektronmikroskopi afslørede dannelsen af ​​autophagosome eller sekundære lysosomer med det tilbageværende fordøjede materiale i FK-16-behandlede HCT116 celler (40 pM; 48 h). (E) Ophobning af sure vesikulære organeller, der udsendes lys rød fluorescens, induceret af FK-16 (40 pM) blev visualiseret ved acridinorange-farvning (400 ×). (F) Øget autophagic flux blev bekræftet ved co-behandling HCT116 celler med FK-16 og bafilomycin A

1. Behandling med bafilomycin A

1 (10 nmol /l) forhindrede ikke opregulering af LC3-I /II i celler inkuberet med FK-16 (40 uM). (G) Knockdown af Atg5 eller Atg7 svækkede den cytotoksiske virkning af 48-h behandling af FK-16 (40 pM) i HCT116. Data er præsenteret som middelværdi ± S.D. af tre separate forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01 signifikant forskellig fra den respektive kontrolgruppe.

†,

s

0,05;

††,

s

. 0,01 signifikant forskellig fra kontrol siRNA-transficerede celler behandlet med FK-16

Krav om p53 for FK-16-induceret apoptose og Autophagic celledød

tumorsuppressorprotein p53 er kendt for at tage del i både caspase-afhængig og -uafhængig celledød, herunder AIF /Endo-afhængig apoptose og autofagi [31], [32]. Her har vi vist, at FK-16 aktiveres direkte p53 at mediere begge celledødsveje. Som vist i fig. 3A, FK-16 forøgede den nukleare niveau af p53 og opreguleres ekspressionen af ​​PUMA og Bax. Konsekvent, FK-16 reducerede ekspressionen af ​​Bcl-2. For at belyse den funktionelle inddragelse af p53 i AIF /Endo-afhængig apoptose og autophagic celledød udløst af FK-16, p53 blev slået ned af siRNA. Knockdown af p53 ikke kun gendannes udtryk for Bax og Bcl-2, men også bemærkelsesværdigt reduceret FK-16-induceret LC3-I /II, Atg5 og Atg7 udtryk samt nuklear udtryk for AIF og EndoG, tyder på, at p53 var et fælles aktivator af både celledødsveje (fig. 3B). Følgelig knockdown af p53 reduceret phosphatidylserin eksternalisering (fig. 3C), dannelsen af ​​LC3

+ autophagic vacuole (fig. 3D) og tabet af cellelevedygtighed (fig. 3E) induceret af FK-16.

(A) HCT116 celler blev inkuberet med FK-16 i 24 timer eller 48 timer. Cytosoliske og nukleare p53 og total ekspression af Bcl-2 medlemmer (PUMA, Bcl-2, Bax og Bak) blev bestemt ved Western blot. GAPDH og Lamin A /C blev anvendt som interne kontroller til cytosol og nukleare proteiner, hhv. (B) Knockdown af p53 vendt opregulering af pro-autophagic faktorer (Atg5 og Atg7) og pro-apoptotiske faktorer (Bax, Bak, nuklear AIF og nuklear EndoG) samt nedregulering af Bcl-2 ved FK-16. (C) FK-16 ikke induceret phosphotidylserin eksternalisering i p53-udtømte HCT116 celler. Efter transfektion med kontrol- eller p53-siRNA i 48 timer blev celler behandlet med eller uden FK-16 (40 pM) i yderligere 24 timer efterfulgt af propidiumiodid /annexin V-dobbelt farvning. (D) Knockdown af 53 markant reduceret antallet af LC3

+ autophagic vakuoler i FK-16-behandlede celler (40 pM; 48 h) som bestemt ved konfokal immunofluorescens (400 ×). Kerner (blå) blev farvet med DAPI. (E) Knockdown af p53 delvis ændrede den inhiberende virkning af FK-16 på cellelevedygtigheden i HCT116 som bestemt ved MTT-assayet. Data er præsenteret som middelværdi ± S.D. af tre separate forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01 signifikant forskellig fra den respektive kontrolgruppe.

†,

s

0,05;

††,

s

0,01 signifikant forskellig fra kontrol siRNA-transficerede celler behandlet med FK-16

Ændret ekspression af Bcl-2 og Bax under FK-. 16-induceret apoptose og Autophagic Celledød

Da Bcl-2-familien er blevet beskrevet at regulere både caspase-uafhængig apoptose og autofagi i andre biologiske sammenhænge [30], [32], vi næste spørgsmålstegn hvis FK- 16-induceret coloncancer celledød blev medieret gennem Bcl-2 og Bax, som begge var nedstrøms for p53 (fig. 3B). Resultaterne viste, at restaurering af Bcl-2-ekspression ved transfektion med Bcl-2-kodende plasmid eller genetisk ablation af Bax ved hjælp Bax

– /- HCT116 celler afskaffet FK-16-induceret ekspression af LC3-I /II, Atg5 og Atg7 samt nukleare udtryk for AIF og EndoG (fig 4A . B), tyder på, at nedregulering af Bel-2 og opregulering af Bax var nødvendige for FK-16-induceret autophagic og apoptotisk signalering. I overensstemmelse med disse resultater, restaurering af Bcl-2-ekspression eller genetisk ablation af Bax reducerede dannelsen af ​​LC3

+ autophagic vacuole (fig. 4C) og tabet af cellelevedygtighed (fig. 4D) induceret af FK-16. Disse resultater viser, at FK-16 handlede gennem p53-Bcl-2 /Bax vej til samtidigt fremkalde AIF /EndoG-afhængig apoptose og autofagi-medieret celledød.

(A) Restaurering af Bel-2-ekspression af transfektion med Bcl-2-kodende plasmid vendt opregulering af pro-autophagic (Atg5, Atg7 og LC3-i /II) og pro-apoptotiske (nuklear AIF og nuklear EndoG) faktorer induceret af FK-16 (40 pM; 48 h) i HCT116. (B) Genetisk ablation af Bax (Bax KO) i HCT116 omvendt FK-16-inducerede apoptotiske og autophagic signaler. Bax

+/- HCT116 behandlet med eller uden FK-16 blev anvendt som kontrol. (C) Genoprettelse af Bcl-2-ekspression eller genetisk ablation af Bax i HCT116 afskaffet dannelsen af ​​LC3

+ autophagic vakuoler induceret af FK-16 (40 pM; 48 h) som bestemt ved konfokal immunofluorescens (400 ×). (D) Restaurering af Bel-2-ekspression eller genetisk ablation af Bax delvist vendt hæmmende effekt af FK-16 på cellelevedygtighed i HCT116, bestemt ved MTT-analysen. Data er præsenteret som middelværdi ± S.D. af tre separate forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01 signifikant forskellig fra den respektive kontrolgruppe.

††,

s

0,01 signifikant forskellig fra tom vektor-transficerede eller Bax

+/- celler behandlet med FK-16

Gensidig forordning imellem. Caspase-uafhængig apoptose og Autophagic Cell død

for at belyse den potentielle krydstale mellem autophagic celledød og AIF /EndoG-afhængig apoptose i virkningen af ​​FK-16, disse to cellulære processer blev afskaffet ved RNA-interferens. Knockdown effektiviteter af Atg5-, Atg7-, AIF- og EndoG-siRNA’er blev bekræftet ved Western blot (fig. 5A). Hæmning af autophagy af Atg5- eller Atg7-siRNA væsentligt forøget nukleare udtryk for AIF og EndoG induceret af FK-16 (fig. 5B). Samstemmende, knockdown af Atg5 eller Atg7 også forbedret FK-16-induceret phosphatidylserin eksternalisering (fig. 5C), hvilket antyder, at inhibering af autofagi intensiveret FK-16-induceret AIF /EndoG-afhængig apoptose. Omvendt afskaffelse af AIF /EndoG-afhængig apoptose af AIF- eller EndoG-siRNA forbedret Atg5 og Atg7 udtryk fremkaldt af FK-16 (fig. 5D), hvilket indikerer, at hæmning af AIF /EndoG-afhængig apoptose forstørret autophagic signal i FK- 16-behandlede colon cancerceller. Samstemmende, AIF- og EndoG-siRNA’er forøgede ekspression af LC3-I /II. Disse resultater viste, at eksistensen af ​​en urapporteret gensidig regulering mellem autophagic celledød og AIF /EndoG-afhængig apoptose.

(A) De Knockdown effektiviteter af AIF-, EndoG-, Atg5- og Atg7-siRNA’er blev bekræftet af nedregulering af proteinniveauer af respektive mål i HCT116. (B) Knockdown af Atg5 eller Atg7 forbedret basal og FK-16-induceret (40 uM, 6 h) nuklear udtryk for AIF og EndoG. (C) Knockdown af Atg5 eller Atg7 forøget FK-16-induceret (40 uM; 48 h) phosphotidylserin eksternalisering som bestemt ved annexin V-farvning og flowcytometri. (D) Knockdown AIF eller EndoG forbedret basal og FK-16-induceret (40 uM, 48 h) Atg5 og Atg7 proteinekspression. (E) Knockdown af Atg5 eller Atg7 afskaffet mens Knockdown AIF eller EndoG forbedret FK-16-induceret (40 uM, 48 h) LC3-I /II udtryk i HCT116. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Induktion af apoptose i tumorceller har længe været anerkendt som en væsentlig metode til kræftbehandling [33]. Men den iboende modstand nogle tumorceller til apoptose og den hurtige genvækst af tumor efter første reaktion på kemoterapeutiske stoffer fortsat store kliniske gåder. Derfor er der en stigende interesse inden for det videnskabelige samfund i at studere hele viften af ​​caspase-uafhængig celledød og identificere midler, som virker primært gennem caspase-uafhængig mekanisme. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at behandling med anticancer-peptidet FK-16 stærkt reduceret levedygtighed colon cancerceller i fravær af caspaseaktivering eller membranpermeabilisering, hvilket antyder, at hverken den klassiske caspase-afhængig apoptose eller nekrose var ansvarlig for dens cytotoksicitet . Til dette formål FK-16-behandlede celler udviste biokemiske og morfologiske træk i overensstemmelse med AIF /EndoG-afhængig apoptose og autophagic celledød. Frem for alt, knockdown af gener er centrale for disse to cellulære processer svækkede cytotoksicitet af FK-16. Disse resultater antyder, at FK-16 er en dual-mode aktivator af caspase-uafhængig celledød. Det er imidlertid også værd at bemærke, at i nogle eksperimentelle indstillinger (Fig 1G . 3C), FK-16 let øget propidiumiodidfarvning. Denne observation kan forklares ved den øgede cellulære stress i forbindelse med siRNA transfektion, der kunne gøre cellerne mere modtagelige for membranen-forstyrre effekten af ​​FK-16.

En række cellulære spændinger, herunder DNA-skader og onkogen aktivering, er blevet vist at aktivere p53. Afhængig af den oprindelige stimulus og den cellulære sammenhæng kunne p53 aktivering udløse et repertoire af svarene, herunder cellecyklusstop, apoptose, cellulær aldring, differentiering og autofagi [34]. Da tabet af p53-ekspression er almindelig i humane cancere, genoprette p53 aktivitet er en attraktiv tilgang til cancerterapi. I denne henseende er blevet identificeret en række p53-genoprette eksperimentelle anticancer midler (fx CP-31398 og Nutlin) [35]. Her viser vi, at FK-16 er et hidtil ukendt aktivator af p53 signalering. FK-16 ikke blot forøget akkumulering nuklear p53, men inducerede også ekspressionen af ​​PUMA og Bax, som begge er kendte transkriptionelle mål af p53 [36], [37]. Knockdown af p53 omvendt også FK-16-induceret AIF /EndoG-afhængig apoptose og autophagic celledød. Desuden pro-apoptotiske og pro-autophagic effekt af FK-16 krævede p53-afhængig opregulering af Bax og nedregulering af Bcl-2. I linjer med disse resultater, er der rapporteret centrale roller p53-Bax /Bcl-2 kaskade i AIF /EndoG-afhængig apoptose og autofagi. For eksempel har en analog af DNA-ødelæggende lægemiddel cyclophosphamid og en større grøn te polyphenol blevet vist at aktivere p53 og Bax at udløse nukleare flytning af AIF og EndoG at mediere apoptose i tumorceller [32], [38]. p53 som en transskription faktor stimulerer også autophagy gennem fremkalde flere pro-autophagic gener, herunder

DRAM

,

SKP2

,

SESN2

, og

ULK1 /2

, foruden

PUMA

BAX

[30]. Desuden kunne p53 aktivering fremme dissociation af Bcl-2-Beclin-1-komplekset og derved disinhibiting Beclin-1-afhængige autofagi [39].

Et interessant fund på vej ud af dette arbejde er opdagelsen af ​​en gensidig reguleringsmekanisme mellem de to caspase-uafhængig celledødsveje. Vores data viser, at afskaffelsen af ​​AIF /EndoG-afhængig apoptose forbedrer autophagic celledød og omvendt, hvilket indikerer, at disse to veje mægle cytotoksicitet FK-16 i en kooperativ måde. Selvom FK-16-induceret autofagi viser sig at være pro-død i naturen, blokade af autofagi paradoksalt inducerer caspase-uafhængig apoptose i FK-16-behandlede celler. En forklaring på denne gåde er, at blokade af FK-16-induceret autofagi forhindrer celledød men stadig aktiverer caspase-uafhængig apoptose i en kompenserende måde og nettoresultatet er bevarelsen af ​​cellelevedygtighed sammenlignet med celler, hvor begge celledødsveje er aktiveret. Til dette formål har det direkte bidrag autophagy celledød været meget omtalt på trods af de seneste stridigheder selve eksistensen af ​​”autophagic celledød” [40], [41], [42], [43]. Mens co-aktivering af autofagi og caspase-uafhængig apoptose er blevet dokumenteret i forskellige biologiske sammenhænge [44], [45], [46], er der kun sporadiske studier i litteraturen, der har forsøgt at belyse forholdet mellem disse to processer. I overensstemmelse med vores resultater, Zheng

et al.

Og Eimer

et al.

Fandt, at autofagi kunne beskytte mod caspase-uafhængig apoptose i Hoechst 33342-behandlede HeLa celler og erlotinib-behandlede glioblastom celler, henholdsvis [47], [48]. Inhibering af autophagy med 3-methyladenin accelererer også rottlerin-induceret caspase-uafhængig apoptose i HT1080 human fibrosarcomceller [49].

Identifikation af anticancer-peptider fra den eksisterende AMP databasen er en effektiv metode til udvikling af hidtil ukendte cancer terapeutika. I denne undersøgelse FK-16, et fragment af LL-37, udviser en bedre anticanceraktivitet end fuldlængde-peptidet. FK-16 indgriber også en yderligere celledød pathway, nemlig autophagic celledød. Den forkortede længde fra FK-16 kan også reducere produktionsomkostningerne forbundet med peptidsyntese. Tilsammen anticancer peptid FK-16 inducerer AIF /EndoG-afhængig apoptose og autophagic celledød via den fælles p53-Bax /Bcl-2 kaskade i colon cancerceller (fig. 6). Vores data afslører også en roman gensidig regulering mellem disse to caspase-uafhængig celledød veje.

Materialer og metoder

Peptider

Den syntetiske LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) og scrambled FK-16 (DQVLRFRNFRIKLVKI) peptider med renhed . 95% blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)

Cell Kultur og Cell levedygtighed Assay

den humane coloncancer-cellelinjer HCT116 og LoVo blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bax

– /- og Bax

+/- HCT116 celler blev genereret ved gen-targeting [50] og leveret af Prof. Bert Vogelstein (Ludwig Center på Johns Hopkins). Den menneskelige hormal kolon slimhinde epitelial cellelinje NCM460 blev erhvervet fra Incell Corporation. Celler blev holdt i deres respektive anbefalede kulturmedier tilsat 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft . Cellelevedygtighed blev målt ved MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] assay. Kort fortalt blev 5000 celler udpladet pr brønd i 96-brønds plader. Efter behandling blev MTT-opløsning opløst i dyrkningsmediet ved en slutkoncentration på 0,5 mmol /l tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Dimethylsulfoxid blev derefter tilsat til solubilisere MTT tetrazolium krystal. Endelig blev den optiske densitet bestemmes ved 570 nm ved hjælp af en Benchmark Plus mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, USA).

Kvantificering af Phosphatidylserin Eksternalisering

Til måling af phosphatidylserin eksternalisering, behandlede celler blev resuspenderet i farvning puffer indeholdende propidiumiodid og annexin V-fluoresceinisothiocyanat (Invitrogen, USA). Efter inkubation i 15 min i mørke, dobbelt-mærkede celler blev analyseret af FACSCalibur System og CellQuest program.

Nuklear Protein Extraction og Western Blot

Isolering af nukleare og cytosol proteiner blev udført ved hjælp af NucBuster Protein Extraction Kit (EMD Biosciences, Darmstadt, Tyskland) ifølge producentens protokol. Til isolering af helcelle-protein blev celler høstet i radioimmunudfældning buffer indeholdende proteinase og phosphataseinhibitorer.