PLoS ONE: Koordineret forordning af ATF2 af miR-26b i γ-bestrålede Lung Cancer Cells

Abstrakt

MicroRNA regulerer cellulære responser for ioniserende stråling (IR) gennem translationel kontrol af target gener. Vi analyserede tidsserier ændringer i microRNA udtryk følgende γ-stråling i H1299 lungekræft celler ved hjælp microarray analyse. Markant ændret IR-responsive microRNA blev udvalgt på grundlag af en analyse af variansanalyse, og forudsagde target mRNA blev beriget i mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalering. Samtidig analyse af tidsserier mRNA og microRNA profiler afsløret, at ekspressionen af ​​miR-26b ned blev reguleret, og dets mål aktiverende transkriptionsfaktor 2 (ATF2) mRNA blev op reguleret i y-bestrålede H1299 celler. IR i MIR-26b overudtrykt H1299 celler kunne ikke inducere ekspression af ATF2. Når c-Jun N-terminal kinase aktivitet blev inhiberet under anvendelse SP600125, ekspression af MIR-26b blev induceret efter γ-bestråling i H1299-celler. Ud fra disse resultater konkluderede vi, at IR-induceret opregulering af ATF2 blev koordineret forøget ved suppression af MIR-26b i lungecancerceller, hvilket kan øge virkningen af ​​IR i MAPK signalvejen

Henvisning.: Arora H, Qureshi R, Park AK, Park WY (2011) Koordineret forordning af ATF2 af miR-26b i γ-bestrålede Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10,1371 /journal.pone.0023802

Redaktør: Sangdun Choi, Ajou University, Korea

Modtaget: Juni 16, 2011; Accepteret: 26 Juli 2011; Udgivet: 25 August, 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette papir understøttes af en Korea Science and Engineering Foundation (KOSEF) tilskud (M20706000020-07M0600-02010), og af programmet Basic Research Laboratory (BRL) gennem Grundforskningsfonden Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2009 -0087452) og af Korea Healthcare Technology R D Project, Ministeriet for sundhed, velfærd og Familie Anliggender (A084022). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er transskriberes med RNA-polymerase II og binder til 3′-utranslaterede region (UTR) for at undertrykke translation af mål-mRNA’er [1]. På posttranskriptionel plan er microRNA involveret i mange biologiske processer, herunder udvikling [2], proliferation, celledød [3], og tumorigenese [4]. Mange undersøgelser har analyseret den transkriptionelle regulering af mRNA og microRNA i y-bestrålede celler til at forstå cellulære reaktioner på ioniserende stråling (IR) [5], [6], [7].

mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer, såsom apoptose, proliferation, differentiering, WNT signalering, og p53 signalering. MAPK signalering er ofte dereguleret i humane cancere, hvilket fører til ukontrolleret celleproliferation og overlevelse [8]. IR kan inducere aktivering af MAPK pathways at kontrollere celleoverlevelse i en celletype-afhængig måde [9]. IR responsive aktivering af MAPK signalveje er relateret til celleproliferation [10].

De fleste cellulære signalveje kan reguleres ved transkriptionel og posttranslationel kontrol af gener. Den microRNA MIR-7, MIR-4, MIR-79, MIR-2, og MIR-11 er involveret i Notch signalveje ved at målrette de regulerende sekvensmotiver i 3’UTR af målgener [11]. MIR-15 og MIR-16 er involveret i Nodal signalvej [12]. Nuklear faktor kappa let polypeptid genenhancer i B-celler 1, et DNA beskadigelse-signalering mediator, reguleres af MIR-9 og lad-7 g som respons på IR i lungekræft cellelinier [7]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi tidsserie udtryk profil microRNA i y-bestrålet lunge cancer cellelinjer. Vi forsøgte at identificere IR-responsive microRNA som regulerer ekspressionen af ​​MAPK signalering gener gennem sideløbende analyse af microRNA og mRNA-profiler. Vi viste en koordineret regulering af aktivering transkriptionsfaktor 2 (ATF2), der er kodet af en MAPK signalering gen ved miR-26b som svar på IR.

Resultater

For at forstå posttranskriptionel kontrol cellulære reaktioner på IR efter microRNA blev hele genomet ekspressionsprofil af microRNA undersøgt i H1299 humane lungecancerceller ved 0, 4, 8, 12, og 24 timer efter behandling med 2Gy af γ-stråling. Den microRNA ekspression profil blev analyseret ved envejs variansanalyse (ANOVA) for at vælge IR-responsive microRNA. Blandt 328 humane microRNA på mikroarrayet, ekspressionen af ​​56 (17,1%: 30 opreguleret og 26 nedreguleres) blev ændret betydeligt i H1299-celler (p 0,05; figur 1 og tabel S1). Fremtrædende ændringer blev observeret ved 8 timer efter y-bestråling i de fleste af IR-responsive microRNA.

Reverse transskriberet små RNA fra hvert tidspunkt blev mærket med Cy5. Farven koden repræsenterer den relative ekspression af angivne microRNA for hvert tidspunkt. En liste over alle microRNA’er er tilgængelig i tabel S1.

For at udforske den fysiologiske betydning IR-responsiv microRNA, vi anført forudsagt mål mRNA af IR-responsive microRNA og berigede signalveje blev udvalgt på grundlag af berigelse og statistisk analyse af forudsagt target mRNA af DIANA-microT-3.0. Blandt de anførte signalveje, vi fokuserede på de øverste 10 veje baseret på den statistiske signifikans (tabel 1). Vi valgte især MAPK-signalvejen til yderligere analyse, fordi denne signalvej er essentiel for overlevelse som respons på DNA-skade [13].

For at validere regulering af MAPK-signalvejen ved IR-responsive microRNA’er, vi meta-analyseret mRNA-ekspression profiler af de samme y-bestrålede H1299 celler fra vores offentliggjorte datasæt [14]. I samtidige analyse af target mRNA og IR-responsive microRNA, vi anvendt to kriterier: 1) statistisk signifikante ændringer (p 0,05) i mRNA-ekspression ved γ-bestråling af ANOVA-analyse og 2) den høje omvendt korrelation værdi (r -0,4 ) mellem mRNA og microRNA ekspression. Som opsummeret i figur 2 og tabel S2, vi identificeret 35 par IR-responsive microRNA og målrette mRNA, herunder 19 microRNA og 23 ikke-overlappende mRNA for MAPK signalvej gener i H1299 celler.

Vi valideret udtrykket mønstre af IR-responsive microRNA og målrette mRNA for MAPK signalvejen. Blandt 35 parvis valgte vi og analyseret fire (MIR-26b: ATF2, MIR-7: FOS, MIR-20a: MAP3K5, og MIR-128: PPARG) parvis ved revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR; Figur 3A , B, C og D). Som påvist i microarray datasæt (figur 2), fandt vi, at ATF2, FOS, og MAP3K5 op blev reguleret og PPARG blev nedreguleret ved IR eksponering. MikroRNA’er såsom miR-26b, miR-7, og miR-20a blev nedreguleret, og miR-128 blev op reguleret ved IR eksponering. Ved real-time RT-PCR, vi viste, at udtrykket mønstre af udvalgte IR-responsive microRNA og målrette mRNA var godt matchet med de af microarray udtryk data.

udtryk for fire par microRNA og målrette mRNA såsom (A) mIR-26b: ATF2, (B) mIR-7: FOS, (C) mIR-20a: MAP3K5, og (D) mIR-128: PPARG) blev kvantificeret under anvendelse af real-time revers transkription-polymerasekædereaktion reaktion (RT-PCR) på det angivne tidspunkt. Værdierne blev normaliseret med glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) mRNA for target mRNA og U6B lille RNA for microRNA. Alle værdier er vist som middelværdi ± standardafvigelse (SD) fra tredobbelte eksperimenter.

nedreguleret IR-responsive microRNA kan forstærke funktionen af ​​mål-mRNA’er. For at teste sammenhængen mellem ned-regulerede IR-responsive microRNA og målrette mRNA, valgte vi at par af ATF2 og miR-26b blandt 35 par til at demonstrere koordineret regulering mellem microRNA og mål mRNA upon IR eksponering. Et forudsagt mål blev identificeret for MIR-26b i position 112-118 af ATF2 3’UTR, som vist i figur 3A. Overekspression af MIR-26b i H1299-celler kunne undertrykke ekspressionsniveauet af ATF2 mRNA. Desuden blev proteinet niveau af ATF2 faldt i MIR-26b-overudtrykte celler (figur 4A). I luciferaseassays MIR-26b undertrykt oversættelsen af ​​luciferase i konstruktioner med 3’UTR af ATF2, men ikke dem uden 3’UTR (figur 4B). Den undertrykkende virkning af MIR-26b på ATF2 blev også observeret i y-bestrålede H1299 celler (figur 4C), som blev opretholdt indtil 12 timer efter IR eksponering.

(A) I MIR-26b transficerede H1299-celler, udtryk for microRNA blev bekræftet ved real-time RT-PCR. Ekspressionen af ​​ATF2 mRNA i MIR-26b transficerede celler blev målt ved real-time RT-PCR. De relative ATF2 ekspressionsniveauer blev normaliseret mod GAPDH og præsenteres som gennemsnit ± SD fra tredobbelte eksperimenter. Proteinet niveau for ATF2 blev også undersøgt ved Western blot i microRNA-transficerede celler. (B) Celler blev transficeret med den tomme renilla luciferasereportergenet (psiCHECK2) eller reportergenet fusioneret til ATF2 3’UTR. Desuden blev cellerne co-transficeret med MIR-26b eller uden MIR-26b; Resultater udtrykkes som relative lysenheder (RLU) og blev normaliseret med luciferaseaktiviteten udtrykt konstitutivt af psiCHECK2 vektoren. (C) Den relative udtryk for ATF2 i miR-26b transficeret og IR udsatte celler ved 4 (hvid), 8 (grå) og 12 (sort) timer hhv.

Dernæst ønskede vi at bekræfte virkningen af ​​MAPK signalering på nedregulering af mIR-26b i y-bestrålede celler. Vi inhiberede MAPK-signalvejen ved hjælp SP600125, en c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor, i y-bestrålede H1299 celler. Behandling med SP600125 ændrede ikke den basale udtryk niveau ATF2; dog induktion af ATF2 upon γ-bestråling blev markant blokeret i SP600125-behandlede H1299 celler indtil 12 timer efter IR eksponering (figur 5A). Ekspression af ATF2 kræver aktivering af MAPK signalering, som blev inhiberet ved JNK ved kemisk inhibitor. Omvendt ekspression af MIR-26b blev induceret ved behandling med SP600125 i H1299 lungecancerceller (figur 5B). Virkningerne af SP600125 på ekspressionen af ​​ATF2 mRNA og MIR-26b blev også bekræftet i A549 lungecancer-cellelinie (figur 5).

H1299 og A549-celler blev behandlet med 10 pM SP600125 i 30 minutter, og derefter udsat for IR. De relative udtryk for ATF2 mRNA (A) og MIR-26b (B) blev normaliseret til ekspressionen kontrolniveau ved 0 timer i både kontrol- og SP600125-behandlede celler ved 4 (hvid), 8 (grå) og 12 (sort ) timer. (C) Ioniserende stråling fremkaldt udtryk for ATF2, som ned-reguleret ekspression af miR-26b i y-bestrålede lunge kræftceller.

Diskussion

cellulære reaktioner på eksogen stimulering kan overvåges ved ændringer i genekspression, herunder ekspression af microRNA. IR kan inducere progressive ændringer i celle overlevelse, vækst og proliferation ved at påvirke genekspression. Tidligere rapporter har antydet, at stråling kan ændre ekspressionsmønsteret af gener [15], [16]. Vi analyserede microRNA profiler til at forstå den mekanisme af microRNA-medieret cellulære reaktioner på IR, og identificere regulering af MAPK signalvejen med IR-responsive microRNA. I den foreliggende undersøgelse har vi belyst JNK transkriptionel suppression af MIR-26b i y-bestrålede celler, for hvilke microRNA kan undertrykke translation af mål-ATF2 mRNA, et medlem af MAPK-signalvejen. Fra disse resultater, foreslår vi, at den cellulære respons på IR koordineret reguleres af samspillet mellem MAPK signalvejen og microRNA.

ATF2 er en cAMP-respons element-bindende (CREB) protein med en grundlæggende leucin zipper (bzip) domæne, hvorigennem ATF2 interagerer med andre bzip proteiner såsom jun, FOS, CREB, og ATF1 [17], [18]. DNA-skader og proinflammatoriske cytokiner kan inducere aktivering af ATF2 transkriptionsaktivitet af JNK [19]. Rolle forskelligartede signalering i aktivering af ATF2 fremgår også af heterodimere partnere ATF2, der også aktiveres i en stimulus-specifik måde. Således kan en bestemt stimulus føre til forskellige ATF2 komplekser og derved aktivere eller undertrykke forskellige sub-sæt af målgener [20].

MIR-26b er en intron microRNA bosiddende i intron IV CTDSP1, C-terminal domæne lille phosphatase 1. transkriptionel kontrol af værten CTDSP1 mRNA er ikke fuldt forstået, men der findes mange formodede bindingssteder for transkriptionsfaktorer såsom CREB i INDKODNING transskriptionsfaktorbindende Analysis [21]. ATF2 kunne undertrykke transskription af målgener gennem dimerisering med andre bzip transkriptionsfaktorer. Overekspression af bzip proteiner, såsom ATF2 og CREB ændret genekspression i humane myometriske celler [22]. Meta-analyse på dette microarray datasæt i GEO (GSE1059) afslørede nedregulering af CTDSP1 i ATF2-overudtrykt celler. Vi har brug for yderligere undersøgelse vedrørende transkriptionel kontrol af MIR-26b ved ATF2 i lungecancerceller; dog JNK aktivitet og ekspression af ATF2 undertrykt ekspression af MIR-26b udføres i den aktuelle undersøgelse.

Deregulering af MAPK-signalvejen kan induceres ved IR-induceret DNA-beskadigelse [23]. I den foreliggende undersøgelse blev det fundet, at MAPK signalering induceres i y-bestrålede H1299 celler, som kan mediere overlevelse H1299 lungecancerceller ved IR eksponering. Endvidere aktivering af MAPK signalering førte til nedregulering af MIR-26b, som støttede opretholdelsen af ​​ATF2 aktivitet efter tur. Ud fra disse resultater kunne vi påvise, at eksponeringen af ​​H1299 lungecancerceller IR induceret MAPK signalering efterfulgt af suppression af MIR-26b-ekspression, hvilket førte til udslip af ATF2 mRNA fra posttranslationel undertrykkelse af MIR-26b. Vi foreslår, at miR-26b medierer koordinere reguleringen af ​​ATF2 og MAPK signalvejen som reaktion på IR.

Materialer og metoder

Cell kultur

H1299 humane lunge kræftceller var opretholdt i RPMI 1640 og A549-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin [begge cellelinier blev indkøbt fra ATCC]. De dyrkede celler blev enten udsat for 2 Gy stråling ved anvendelse af en 4-MV lineær accelerator (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA, USA) eller venstre ubestrålet som en negativ kontrol. Den specifikke JNK inhibitor SP600125 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). H1299-celler blev inkuberet med 10 pM SP600125 i 30 minutter, og derefter udsat for IR (2 Gy) efterfulgt af total RNA-isolering ved angivne tidspunkter.

MicroRNA microarray

microRNA fra hver cellelinie var ekstraheret under anvendelse af Mirvana microRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. Rensede microRNA blev mærket ved hjælp af Mirvana microRNA Array Mærkning Kit og koblet til Cy5 Post-Mærkning Reactive Dye (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA). De mærkede prøver blev vasket og hybridiseret i to eksemplarer til Mirvana microRNA Bioarrays (Ambion) ved hjælp af Mirvana microRNA Bioarray Essentials Kit. Fluorescensintensiteter blev bearbejdet og måles efter den GeneChip scanner 3000 7G (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Niveauerne af microRNA hybridisering blev bestemt ved hjælp GenePix Pro 6.0 software som anbefalet af producenten. Baggrunden-korrigeret intensitet for hver microRNA blev udsat for en global stabilisering varians normaliseringsproceduren [24]. Alle data er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (GEO) (tiltrædelse nummer – GSE30075).

Statistisk og bioinformatik analyse

For at identificere microRNA for hvilket udtryk niveauer ændret sig væsentligt i hele tidsforløbet, brugte vi envejs ANOVA-analyse. I betragtning af sammenhængen struktur inden array replikater [25] i Mirvana microRNA Bioarrays, vi udførte envejs ANOVA analyse på 328 menneskelige microRNA. DIANA (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), som integrerer mennesker og mus microRNA i veje til at forudsige microRNA mål [26], blev udført i første omgang at identificere veje.

RNA forberedelse og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af TRIzol måde, hvorefter revers transkriberet til komplementært DNA under anvendelse af Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oligo- (dT) 12-18 primere ifølge fabrikantens protokol. Den kvantitative RT-PCR for angivne gener blev udført i en reaktionsblanding indeholdende SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Kvantificering af microRNA blev udført ved anvendelse TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge fabrikantens protokol. Prøver blev analyseret under anvendelse af ABI PRISM 7000 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems). Alle PCR’er blev udført tre gange, og specificiteten af ​​reaktionen blev bestemt ved smeltekurveanalyse ved dissociation stadium. Syntetiserede vi specifikke primere for ATF2 (fremadrettet: 5′-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 ‘; revers: 5’ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3′), FOS1 (fremadrettet: 5’-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3 ‘; revers: 5′-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3′), MAP3K5 (fremadrettet: 5’-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 ‘; revers: 5′-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3′) og PPARG (fremadrettet: 5’-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 ‘; revers: 5′-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3’). Den relative kvantitative metode blev anvendt til den kvantitative analyse. Kalibratoren blev den midlede ACt fra de ubehandlede celler. Den endogene kontrol var glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) for gener og U6B for microRNA.

Western blotting

Celler blev høstet og lyseret i NP-40-puffer indeholdende phenylmethylsulfonylfluorid og Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteinekstrakter blev derefter adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese, og derefter overført til polyvinylidenfluorid membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraner blev inkuberet med et ATF2 antistof (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) i Tris-bufret saltopløsning Tween 20 puffer med fedtfri tørmælk, og derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (fortynding 1:5000; Bio -Rad). Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af West-Q-Kemiluminescens Substrat Kit Plus (BIOTANG, Waltham, MA, USA).

Konstruktioner, transfektion, og luciferaseanalyse

forløber for miR-26b blev klonet i pcDNA3 (Invitrogen) ved genomisk DNA PCR med primere (fremadrettede: 5′-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 ‘; revers: 5′-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3’). De 3 ‘UTR’er af ATF2 blev klonet nedstrøms for Renilla luciferase genet i psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, USA). Konstruktionen blev transficeret under anvendelse FuGENE HD-reagens (Roche, Basel, Schweiz) for real-time RT-PCR, Western blotting, og luciferaseassays. Luciferase assays blev udført ved anvendelse af Dual-Luciferase assay kit (Promega). Normalisering af Renilla udtryk blev udført ved hjælp af ildflueluciferase stede i psiCHECK2 vektor.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Liste over udvalgte microRNA fra H1299 celler.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s001

(XLSX)

tabel S2.

Valgt mRNA: microRNA par af MAPK signalvej baseret på berigelse analyse.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s002

(XLSX)

Tak

Forfatterne takker medlemmer af Park laboratorium til diskussion samt H.-S . Shin og H.-J. Jeon for microRNA microarrays.