PLoS ONE: TREM-1 induceres i Tumor Associated makrofager af cyclooxygenase Pathway i Human Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Det er i stigende grad erkendt, at tumor mikromiljø spiller en afgørende rolle i indledningen og progression af lungekræft. Navnlig vekselvirkning af cancerceller, makrofager og inflammatorisk respons i tumormikromiljøet har vist sig at lette cancercelleinvasion og metastase. De specifikke molekylære veje i makrofager, der immunoedit tumorvækst er ikke veldefinerede. Udløsning receptor udtrykt på myeloide celler 1 (TREM-1) er et medlem af den super immunglobulin familien udtrykt på en udvalgt gruppe af myeloide celler hovedsageligt monocyt /makrofager. Nylige undersøgelser tyder på, at ekspressionen af ​​TREM-1 i tumorer kan forudsige kræft aggressivitet og sygdom resultater i lever og lungekræft men mekanismen for TREM-1-ekspression i fastsættelsen af ​​kræft er ikke defineret. I denne undersøgelse viser vi, at tumorvæv fra patienter med ikke-småcellet lungekræft viser en øget ekspression af TREM-1 og PGE

2. Immunhistokemi og immunofluorescens bekræftede, at ekspression af TREM-1 selektivt sås i CD68-positive makrofager. Ved anvendelse af en

in vitro

model bekræftede vi, at ekspression af TREM-1 forøges i makrofager, der er co-dyrket med humane lungecancerceller. Studier med COX-2 inhibitorer og siCOX-2 viste, at ekspression af TREM-1 i makrofager i tumormikromiljøet er afhængig af COX-2-signalering. Disse undersøgelser for første gang definerer en sammenhæng mellem tumor COX-2-induktion, PGE

2 produktion og udtryk for TREM-1 i makrofager i tumor mikromiljø og foreslå, at TREM-1 kan være en roman mål for tumor immunmodulation.

Henvisning: Yuan Z, Mehta HJ, Mohammed K, Nasreen N, Roman R, Brantly M, et al. (2014) TREM-1 induceres i Tumor Associated makrofager af cyclooxygenase Pathway i Human Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (5): e94241. doi: 10,1371 /journal.pone.0094241

Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italien

Modtaget: September 4, 2013; Accepteret: 14. marts 2014 Udgivet: 19 maj, 2014

Copyright: © 2014 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Department of Veterans Affairs (MR til RTS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de dødeligste kræftformer i hele verden. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for mere end 80% af alle lungekræfttilfælde. I gennemsnit 5-årige overlevelsesrate for NSCLC er ca. 15% [1]. Skønt betydelige fremskridt er blevet gjort med konventionelle behandlinger, den lave samlede overlevelse og dårlig prognose for patienter med lungekræft viser behov for at udvikle nye behandlingsmuligheder for denne ødelæggende sygdom [2]. Som følge heraf er der blevet videreført søgen efter at definere de potentielle veje, der driver tumorgenese i lungekræft med et håb om at udvikle alternative og /eller supplerende behandlinger for lungekræft.

Det er i stigende grad erkendt, at tumor mikromiljø spiller en afgørende rolle i initiering og progression af lungekræft. Tumor udvikling afhænger af faktorer i mikromiljø; interaktioner mellem maligne celler, stromaceller, ekstracellulær matrix-komponenter, forskellige inflammatoriske celler og en række opløselige mediatorer bidrager til tumorudvikling og progression [3] [4] [5] [6]. Makrofager i tumorer betegnes sædvanligvis som tumorassocierede makrofager (TAM’er) og deres tilstedeværelse kan være betydelige (op til 60% af tumoren stroma). Et kendetegn for makrofager er deres plasticitet, en evne til enten støtte eller bekæmpe tumorer afhængig af tumor miljø, hvilket har givet dem ry for et tveægget sværd i tumor biologi [7] [8] [9] [10] [ ,,,0],11] [12]. Der er akkumulerende beviser for, at kræftceller kan rekruttere og nedbryde makrofager til at tjene som aktive samarbejdspartnere i deres neoplastisk program. Vedvarende aktivering af makrofager forårsager lokal kronisk inflammation, produktion af cytokiner og chemokiner, der fremmer tumorigenese [3] [4] [6] [9] [13] [14]. Men de molekylære mekanismer, som tumorer aktiverer makrofager til at fremme tumorvækst er ikke veldefinerede.

TREM proteiner (Udløsning receptorer udtrykt på myeloide celler) er en familie af immunglobulin celleoverfladereceptorer udtrykt på myeloide celler [15]. Den TREM familie af protein-receptorer består af TREM-1, TREM-2, TREM-3 (mus), TREM-lignende transkript (TLT) -1, og TLT-2. Den TREM genklynge er placeret på humant kromosom 6p21 og muse kromosom 17C3 [16] [17]. TREM-1 var den første TREM identificeret og indledende studier etableret TREM-1 som en forstærker af den systemisk inflammatorisk respons syndrom og sepsis [18] [19] [17] [20]. Den præcise ligand for TREM-1 er ukendt men vi og andre har vist, at bakterielle og virale produkter [21] [19] inducere ekspression af TREM-1. Derudover har vi vist, at MyD88 afhængige og uafhængige veje aktiverer TREM-1 som reaktion på specifikke TLR ligander [21]. De funktionelle konsekvenser af lyddæmpende TREM-1-genet i makrofager omfatter en ændret tilgængelighed af nøgle signalering (CD14, kBa, MyD88) og effektormolekyler (MCP-1, IL-1, IL-6, IL-23) nedstrøms for TLR-aktivering [22]. Nylige undersøgelser har også vist, at lipide mediatorer, såsom prostaglandiner modulere ekspression af TREM-1. Især PGE

2 inducerer mens PGD

2 og PGJ

2 inhibere ekspressionen af ​​TREM-1 [23] [24]. Sammen disse undersøgelser har antydet en central rolle for TREM-1 i forstærkning af TLR inducerede reaktioner. Imidlertid er ikke fastlagt, rolle TREM-1 i tumorassocieret inflammation og mikromiljø.

Nylige undersøgelser har vist, at TREM-1 udtrykkes stærkt i colon, hepatocellulær og lungecarcinom væv [25] [26] [27] [5]. Endvidere har TREM-1-ekspression i patienter med NSCLC blevet associeret med cancer tilbagefald og ringe overlevelse af patienter tyder på, at TREM-1 kan spille en vigtig rolle i cancer progression [27]. Men den mekanisme, hvormed TREM-1 induceres i tumorvæv ikke er blevet defineret.

Vi har udført denne undersøgelse for at bestemme cellespecifik ekspression af TREM-1 i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) væv og at definere den mekanisme, hvorved tumorceller inducerer ekspression af TREM-1. Vi antager, at TREM-1 aktivering i tumorassocierede makrofager kan induceres ved PGE

2 genereret af cyclooxygenase-2 fra tumorceller. Vi undersøgte vores hypotese ved hjælp af en co-kultur-system af humane cancerceller med human monocyt /makrofager

in vitro

.

Materialer og metoder

Etik Statement

Humant normalt lunge og NSCLC blev opnået både i frossen form, og som celle blokke fra klinisk og translationel forskningsinstitut (CTSI) ved University of Florida, der giver en vævsbank til forskningsformål. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, hvis væv er blevet indløst. Skriftlige godkendelser er indgivet for alle undersøgelsens deltagere. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité og Institutional Review Board ved University of Florida. Godkendelse nummer (# IRB201200392).

Reagenser

føtalt bovint serum (FBS) (10%) blev opnået fra AmericanType Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). RPMI-1640 medium blev opnået fra Gibco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), blev NS398 opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). EP1, EP2, EP4, receptor-antagonister (GW848687, AH6809, AH 23848) og rekombinant PGE2 og PGD2 blev købt fra Cayman kemikalier. EP1-antagonist (L-798-106) blev indkøbt fra Tocris Bioscience. cAMP agaonist (forskolin) blev købt fra Sigma-Aldrich. COX-2 og actin antistoffer, ikke-targeting siRNA pool (NS siRNA) og siRNA targeting COX-2 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA).

Celledyrkning og co-kultur Eksperimenter

Menneskelig monocytisk cellelinie U937, lungecancer-cellelinie A549, H23 eller H838 blev indkøbt fra ATCC, og opretholdt i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS. A549, blev H23 eller H838 celler udpladet i seks-brønds skåle (1,5 til-2 × 10

6 celler pr brønd) i dyrkningsmediet. U937-celler blev behandlet med PMA (10 ng /ml) i 48 timer for at adskille dem i makrofager. U937-celler (2 til -2,5 × 10

6 celler pr insert), humane makrofager (10

6 celler pr insert) blev belagt direkte på Transwell indstik (0,4 um, BD Biosciences) i dyrkningsmediet. Forud for co-dyrkning, blev lungecancerceller og makrofager vasket med RPMI indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (basal medium). Efter den sidste vask blev det passende basalt medium tilsat til lungecancerceller og inserter indeholdende makrofager blev anbragt i hver brønd.

Fremstilling af humane makrofager fra perifere blodmonocytter Salg

Humane perifere blodmonocytter (PBMC’er) blev isoleret fra buffy coats fra normale donorer over en Ficoll-paque PLUS (GE Healthcare) gradient. PBMC’er blev differentieret til makrofager ved dyrkning i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS (Gibco) med en densitet på 10

6 /ml i syv dage. For modning af humane makrofager, 50 ng /ml human M-CSF (R 90% CD14

+)

Immunhistokemi Analyse

Lungekræft prøver og normalt væv fra para karcinom område blev opnået fra tre patienter med. ikke-småcellet lungekræft. Paraffinsnit (4 um) blev farvet med hematoxylin og eosin til histologisk evaluering. Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af en modificeret avidin-biotin peroxidase-kompleks metode. 4 um snit fra formalinfikserede, paraffinindlejrede væv blev monteret på poly-L-lysin-coatede objektglas og derefter afparaffineres. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i 15 min ved stuetemperatur. Efter antigen-genvinding i HIER (pH 6,0) i 4 minutter, blev sektionerne inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-TREM-1-antistof (HPA005563, Sigma-Aldrich) eller isotype matchet kontrol antistof ved en fortynding på 1:500, derefter opdages ved hjælp af EnVision ™ System-HRP (DAB) (Dako). Specificiteten af ​​immunohistokemi blev verificeret under anvendelse af et antistof isotypekontrol udskifter den primære antiserum med en identisk koncentration af ikke-immuniseret mus eller kanin-serum. Snit blev screenet ved × 100 forstørrelse for at identificere de regioner i største antal TREM-1-positive celler. Immunfarvning af TREM-1 blev analyseret blindt af to bestyrelsesmedlemmer certificerede patologer. Celler blev talt med en tæthed på × 400 forstørrelse i mindst tre regioner med de største antal TREM-1-positive celler.

Indirekte Immunofluorescens

Sektioner fra formalin-fikseret, paraffinindstøbt lungekræft væv og tumor-tilstødende normale væv blev deparaffineret, derefter blokeret med 2% hesteserum i PBST-buffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering blev objektglassene inkuberet med anti-TREM-1-antistof (HPA005563, Sigma) ved fortynding af 1:500 natten over ved 4 ° C efter tre vaske i kold PBS, blottet med sekundært antistof (Alexa Fluor 594 æsel-anti-kanin IgG, 1:500; Molecular Probes) i 1 time ved stuetemperatur. For dual farvning blev objektglassene vasket igen, med blokeringsopløsning og inkuberet med anti-humant CD68-antistof (klon KP1, 1:100; Abcam) og en anden fluor-konjugeret sekundært antistof (Alexa Fluor 488 æsel-anti-muse-IgG, 1: 500; Molecular Probes). DAPI-holdige monteringsmedium (Molecular Probes) blev anvendt til nuklear farvning. Billeder på en enkelt celle niveau blev observeret og fotograferet ved anvendelse af et fluorescensmikroskop udstyret med en Charge Couple Device kamera (Leica SP5, Tyskland).

RNA Interference

Celler blev transficeret med siRNA oligonukleotider målrettet mod humant COX-2-mRNA, og en ikke-relateret kontrol siRNA (Santa Cruz) gennem specifikke Lonza transfektionsreagenser (LONZA) ifølge producentens instruktioner. Celler blev inkuberet med siRNA komplekser i 24 h-72 h før analyse.

Flowcytometri

Humane makrofager og U937-opdelte makrofager blev undersøgt for receptor ekspressionsniveauer under anvendelse af FACS med anti-humant CD14 APC /Cy7 (eBioscience) og anti-human TREM-1 (R 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

TREM-1 er opreguleret i tumorassocierede makrofager i Human ikke-småcellet lungekræft

Det er fastslået, at TREM. -1 opreguleres i infektion og inflammatoriske væv. Da kronisk inflammation er tæt knyttet til kræft vi spørgsmålstegn hvis TREM-1 udtrykkes i NSCLC væv. Vi først udført RT-PCR og RT-qPCR fra lungevæv af patienter med NSCLC. Vi var i stand til at detektere en stigning i TREM-1 besked fra human lunge adenocarcinom væv henviser udtrykket ikke blev detekteret i normalt lungevæv (figur 1A og B). Da ekspression af TREM-1 er begrænset til myeloide celler, vi spørgsmålstegn som celletyper udtrykker TREM-1 i lungekræft væv. For at bestemme de specifikke celletyper, der udtrykker TREM-1 i tumormikromiljøet udførte vi immunhistokemisk analyse (ved anvendelse af modificeret avidin-biotin peroxidase-kompleks metode, primært antistof anti-TREM-1-antistof og isotype-matchet kontrol antistof) fra human lungekræft prøver fra patienter med lunge-adenocarcinom. Immunhistokemi og immunoflorescent farvning fra lungetumorer viste, at TREM-1-positive celler er tumorassocierede makrofager (figur 1C). TREM-1-positive celler er makrofager blev bekræftet ved hjælp af CD68 farvning en specifik makrofag markør, der bekræftede, at cellerne er faktisk makrofager (figur 1D). Derudover har vi også fastslået, hvis lungekræft celler (A549 celler) udtrykkelig TREM-1 protein. Vi var ikke i stand til at detektere ekspressionen af ​​TREM-1-meddelelse eller protein i tumorceller alene (data ikke vist). Kollektivt antyder disse data, at TREM-1-ekspression opreguleres i tumorassocierede makrofager i ikke-småcellet human lungecancer.

A) RNA ekstraheret fra human lungekræft prøver viste en stigning i TREM-1 meddelelse. B) Real time RT-PCR bekræftede stigningen i TREM-1 meddelelse (n = 3, * p 0,05). C) Repræsentant immunhistokemi billede viser en øget ekspression af TREM-1 protein i makrofager i tumor stroma D) Konfokal mikroskopi med CD68 en specifik makrofag markør og TREM-1 bekræftede, at celler, der udtrykker TREM er TAM’er.

TREM-1 er induceret i humane makrofager Co-dyrket med lungeadenokarcinom Celler

Da vores data viser, at TREM-1 udtrykkes i tumorassocierede makrofager i human lunge adenocarcinom vi udviklet en

in vitro

co-kultur model til at bestemme, om ekspressionen af ​​TREM-1 i TAM i tumoren specifikt er relateret til tumorcellerne. Co-kultur eksperimenter blev udført ved anvendelse af humane makrofager (humane monocytter fra blod blev modnet til makrofager som beskrevet i fremgangsmåder) og A549, H23 og H838 humane lungecancerceller. Til disse eksperimenter tumorceller eller normale epitelceller (NL-20, ATCC) blev co-dyrket med modnet humane makrofager i 48 timer. Ekspression af TREM-1 blev bestemt ved FACS-analyse. Co-kultur af tumorceller med makrofager førte til en induktion af TREM-1 som bestemt FACS-analyse (figur 2A). På den anden side makrofager, der var samdyrket med normale epitelceller viste ikke en stigning i ekspressionen af ​​TREM-1-protein (figur 2A og B) antyder, at ekspressionen af ​​TREM-1 i TAM’er er en effekt af tumorceller på makrofager. Vi udførte også yderligere eksperimenter for at bekræfte den forøgede ekspression af TREM-1 meddelelse. Normale epitelceller, og cancerceller A549, H23 og H838-celler blev co-dyrket med humane makrofager i 48 timer, hvorefter RNA blev ekstraheret fra makrofagerne. TREM-1 meddelelse blev påvist ved RT-PCR. Efter aftale med vores data med TREM-1 protein udtryk makrofager, der var co-dyrket med cancerceller viste en stigning i TREM-1 budskab, som ikke blev registreret i makrofager, der var dyrket med normale epitelceller (Figur 2C). Tilsammen bekræfter disse data, at tumorceller kan inducere ekspression af TREM-1 meddelelse og protein i makrofager.

A) Makrofager blev co-dyrket med NL-20 (normale epitelceller) eller lungecancerceller (A549, H23 eller H838) i 48 timer. TREM-1-ekspression blev øget i makrofager, der var samdyrket med cancerceller som påvist ved FACS-analyse B) procentdel af celler, der farves positive for TREM-1, n = 3-4, * p 0,05) C) repræsentant RT- PCR fra makrofag co-dyrket med tumorceller viste en viste en øget ekspression af TREM-1 besked.

Induktion af TREM-1 i tumorassocierede makrofager er afhængig af COX-2

Dernæst ville undersøge den mekanisme, hvorved tumorceller inducerer ekspressionen af ​​TREM-1 i makrofager. Forhøjet cyclooygenase-2 (COX-2) udtryk er ofte blevet observeret i humane ikke-småcellet lungekræft [10], [29]. Vi og andre har vist, at prostaglandiner modulerer ekspressionen af ​​TREM-1 som respons på LPS, især PGE2 inducerer henviser PGD

2 og PGJ

2 inhiberer ekspressionen af ​​TREM-1 [23] [24]. Vores hypotese derfor, at ekspression af TREM-1 i TAM’er kan induceres af PGE

2-produktion fra tumorceller via cyclooxygenase-vejen. Vi først bekræftet, at tumorvæv og celler udtrykker COX-2 (data ikke vist). Niveauerne af PGE

2 blev forøget i lungerne tumorvæv (figur 3A). Næste vi behandlet knoglemarv afledte makrofager fra vildtype mus med rekombinant PGE

2 og PGD

2 (10 pmol) og udførte RT-qPCR at bestemme ekspressionen af ​​TREM-1 besked. Behandling med PGE resulterede

2 i ekspression af PGE

2 hvorimod celler behandlet med vehikel og PGD viste ikke

2 induktion af TREM-1 (figur 3B).

A) PGE

2 niveauer målt fra human lunge tumorvæv viste en stigning i PGE

2 budskab fra kræftvæv uden signifikant detektion i den normale lunge (n = 3, p 0,05). B) Knoglemarv afledte makrofager fra vildtypemus blev behandlet med rekombinant PGE

2 eller PGD

2 (10 pmol) i 12 timer og blev detekteret TREM-1-ekspression. BMDM behandlet med PGE

2 viste en stigning i TREM-1 budskab som reaktion på PGE

2 behandling (n = 3-4, s 0,05) men TREM-1 besked blev ikke påvist i celler, der blev behandlet med PGD ​​

2.

for at bekræfte rollen som COX-2 i induktion af TREM-1 vi udførte eksperimenter, hvor vi co-dyrket lungekræft celler med monocyt /makrofager i 48 timer i tilstedeværelsen af ​​COX-2-inhibitorer eller behandling køretøj. Kontrol- makrofager blev co-dyrket med normale epitelceller NL-20. Ekspression af TREM-1 blev bestemt ved FACS-analyse. Som vist i figur 4A monocytter (U937) celler, som var co-dyrket med kræftceller (A549-celler) viste en øget ekspression af TREM-1-protein, som ikke blev detekteret, når U937 celler blev co-dyrket med NL-20 normale epitelceller. Behandling med COX-2-inhibitor (NS-398, 100 pmol) resulterede i ophævelse af induktionen af ​​TREM-1 (figur 4A og 4B). For entydigt at definere den rolle af COX-2-induktion af TREM-1 vi slået ned COX-2-ekspression i makrofager ved anvendelse siCOX-2. Makrofager blev transficeret med siCOX-2 eller kontrol siRNA i 48 timer før co-dyrkning med cancerceller eller normale epitelceller (NL20) og ekspression af TREM-1 protein blev påvist ved FACS-analyse. Vi først bekræftet, at ekspression af COX-2 var svækket i COX-2 Knockdown-celler som bestemt ved Western blot-analyse for COX-2 (figur 5A). Som vist i figur 5B og C TREM-1 protein blev opreguleret i makrofager udtrykker kontrol siRNA, der blev co-dyrket med lungecancerceller (A549, H23 og H838 celler), men ikke i makrofager, der var dyrket med normale epitelceller. Imidlertid ekspressionen af ​​TREM-1-protein blev ophævet i makrofager transficeret med COX-2 siRNA, der var samdyrket med kræftceller (A549, H23 eller H838 celler) (figur 5B, 5C). Ekspression af TREM-1 budskab blev også ophævet i makrofager, som blev behandlet med siCOX-2 og co-dyrket med tumorceller (figur 5D). Tilsammen viser disse data endegyldigt, at ekspressionen af ​​TREM-1 er COX-2 afhængig og er medieret af produktionen af ​​PGE

2.

A) Repræsentant billede af FACS-analyse-U937 monocytter blev co-ultured med NL-20 eller A549-celler i nærvær af fravær af NS-398 (100 pmol) (specifik COX-2-inhibitor). Ekspressionen af ​​TREM-1 blev forøget i U937-celler co-dyrket med A549-celler. Behandling med NS-398 hæmmede denne øgede udtryk B) Procent celler, der farvede positivt med TREM-1 (n = 4-5, s. 0,5)

A) Western blot-analyse fra humane makrofager med COX-2 siRNA bekræftet banke ned af COX-2-protein i celler med siCOX-2 sammenlignet med mock (kontrol) siRNA. B) FACS billeder demonstrerer TREM-1 ekspression fra humane makrofager udtrykker kontrol siRNA eller COX-2 siRNA co-dyrket med NL-20-celler eller cancerceller (A549, H23 eller H 838 celler). Udtrykket af TREM-1 blev forøget i makrofager udtrykker kontrol siRNA samdyrket med kræftceller, mens makrofager med siCOX-2 viste en svækket udtryk for TREM-1. C) Procentdel af celler, der farves positive for TREM-1 farvning n = 3, p 0,05). D) Repræsentant RT-PCR fra makrofager med siCOX-2 viser en nedsat TREM-1 besked i forhold til makrofager med kontrol siRNA.

Vi næste ønskede at definere den mekanisme, hvormed PGE

2 medierer ekspressionen af ​​TREM-1 i tumorassocierede makrofager. PGE

2 påvirkninger celle adfærd gennem ligering af sine fire særskilte G-protein-koblede E-prostanoid receptorer, nummereret EP1-4 [30], [31]. For at bestemme de receptorer, hvorigennem PGE

2 ændrer ekspressionen af ​​TREM-1 udførte vi forsøg med EP1 gennem EP4 antagonister. Makrofager blev behandlet med det respektive antagonist (10, 50 pmol) forud for co-dyrkning med A549-celler. EP1 (GW848687) og EP3-antagonister (L-978-106) havde ingen signifikant virkning på ekspressionen af ​​TREM-1 (data ikke vist), men celler, som blev behandlet med EP2 (AH6809) og EP4 (AH23848) antagonist viste en reduceret ekspression af TREM-1-protein som bestemt ved FACS-analyse (fig 6A og B). EP2 og EP4-receptorer er potente immunregulerende molekyler, der deler kapacitet til at øge intracellulære koncentrationer af cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) inden for sekunder til minutter af PGE

2 binding. Således ønskede vi at afgøre, om disse effekter medieres gennem stigning i cAMP niveauer. Vi udførte derfor forsøg med cAMP-agonist forskolin (10 pmol), og efter aftale med vores data med EP2 blokade fandt vi en signifikant stigning i ekspressionen af ​​TREM-1 i respons på forskolin (Fig 6A og 6B). Kollektivt disse data viser, at ekspressionen af ​​TREM-1 i tumorassocierede makrofager, som induceres af PGE

2 medieres gennem EP2 og EP4-receptorer, og er drevet af en stigning i niveauet af cAMP.

A ) FACS billeder der viser, at TREM-1-ekspression er svækket i makrofager, der er co-dyrket med tumorceller i nærværelse af EP2 og EP4 antagonist (AH6809 og AH23848), mens den er steget i tilstedeværelse af forskolin. B) Procent celler, der farvede positivt med TREM-1 (n = 4-5, * p. 0,05)

Diskussion

Vores undersøgelse viser overbevisende, at TREM-1 udtrykkes i humant NSCLC væv, og at ekspression selektivt ses i tumorassocierede makrofager i cancer stroma. Vi var ikke i stand til at detektere ekspressionen af ​​TREM-1 i normale lungevæv eller i isolerede tumorceller. Derudover viser vi, at tumorvæv har en forøget ekspression af COX-2 med PGE

2-produktion, og at makrofager, der er behandlet med PGE

2 viser øget ekspression af TREM-1. Endvidere behandling med COX-2 inhibitorer og knockdown af COX-2 i makrofager svækket ekspressionen af ​​TREM-1 i en co-kultur model af lungecancerceller med makrofager. Sammen antyder disse data at TREM-1 kan være et kritisk led i tumormikromiljøet mellem tumorassocieret makrofagaktivering, inflammatorisk respons og cancer progression.

Kræft-relaterede inflammation er nu anerkendt som et kendetegn for tumorer og forbindelsen mellem lunge carcinogenese og kronisk immun aktivering er veletableret [32] [33] [34] [35] [36]. Betændelsen stede i tumormikromiljøet er kendetegnet ved leukocytinfiltration som omfatter tumorassocierede makrofager mastceller, dendritiske celler, naturlige dræberceller, neutrofiler, eosinofiler og lymfocytter [37] [38] [32]. Det er også i stigende grad anerkendt, at interaktionen af ​​cancerceller, makrofager og inflammatorisk respons i tumormikromiljøet kan lette cancercelleinvasion og metastase [39] [40] [41] [42] [43] [44]. Tidligere har vi vist, at hjemmehørende lunge makrofager er afgørende effektorer af modtagelighed for metastatisk vækst lungecancer [45]. Flere murine og humane studier har vist, at høje TAM densitet meste er forbundet med dårlig patient prognose og resistens over for terapier i en række forskellige cancere, herunder ikke-småcellet lungekræft [46] [47] [40] [41] [42] [ ,,,0],48] [44] [49]. Endvidere har monocyt /makrofag udtynding i eksperimentelle indstillinger haft succes med at begrænse tumorvækst og metastatisk spredning og opnå bedre respons på konventionel kemoterapi og antiangiogenisk terapi [50] [13]. Selvom TAM’er bidrager væsentligt til produktionen af ​​VEGF, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-23, IL-8, MMP’er, som har pro-angiogene og vækst attributter, specifikke molekylære veje i makrofager, der immunoedit tumorvækst er ikke veldefineret [37]. Vi fandt rigelige makrofager i stroma af tumorvævet som viste både TREM-1 og CD68 udtryk. CD68 er en makrofag markør for tumorassocieret makrofag der spiller en vigtig rolle i angiogenese og metastase. Stigning i CD68 positive makrofager i vores undersøgelse understøtter den hypotese, at inflammatoriske makrofager udtrykker TREM-1 kan bidrage til en fortsat produktion af mediatorer, som kan fremme tumorvækst.

Udløsning receptor udtrykt på myeloide celler 1 (TREM-1) er et medlem af den super immunoglobulin familien udtrykkes på en udvalgt gruppe af myeloide celler hovedsageligt monocyt /makrofager. Ekspression af TREM-1 er blevet associeret med immun- inflammatorisk respons. Inflammation fremmer flere kendetegnende for kræft, såsom vedvarende proliferativ signalering, modstandsdygtighed over for celledød og induktion af angiogenese [51] [35] [36]. Nylige undersøgelser tyder på, at ekspressionen af ​​TREM-1 i tumorer kan forudsige kræft aggressivitet og sygdom resultater i lever og lungekræft implicerer, at ekspressionen af ​​TREM-1 i makrofager kan være en forbindelse med tumorvækst og progression [25] [26] [27] . Vi har vist, at de funktionelle konsekvenser af lyddæmpende TREM-1-genet i makrofager omfatter en ændret tilgængelighed af nøgle signalering (CD14, kBa, MyD88) og effektormolekyler (MCP-1, IL-1, IL-6, IL-23) nedstrøms for TLR-aktivering [22] [21] [19]. Især produktionen af ​​IL-6 og IL-23 er overdrevet af TREM-1-aktivering [22], [52]. IL-6 og IL-23 har vist sig at være involveret i immuno-redigering i carcinom mikromiljøer og er forbundet med dårlig prognose [53] [54] [55] [56]. Selvom spekulative den overdrevne produktion af disse mediatorer ved TREM-1 kan være en mekanisme, hvorved TREM-1-ekspression i Tams kan fremme tumorvækst og progression. Igangværende og kommende undersøgelser vil etablere rolle TREM-1 i tumorvækst og definere de mekanismer, som TREM-1 modulerer tumorvækst [27] [56].

I denne undersøgelse har vi også undersøgt den mekanisme, hvormed TREM-1 udtrykkes i Tams. Eftersom ekspressionen af ​​TREM-1 moduleres af lipide mediatorer især prostaglandin undersøgte vi rollen som cyclooxygenase-vejen. Vi viser, at inhibering af COX-2 førte til dæmpning af ekspression af TREM-1 i makrofager. Så vidt vi ved er dette den første undersøgelse, der viser, at ekspression af TREM-1I TAM’er i tumormikromiljøet er afhængig af COX-2-signalvejen. Vi viser også, at lungetumor væv har en forøget produktion af PGE

2, som sandsynligvis bidrager til ekspressionen af ​​TREM-1 i TAMer. Desuden vores studier med EP-receptor-antagonister viser, at virkningerne af PGE2 i tumor mikromiljø medieres af EP2 og EP4 receptor og er et resultat af øget cAMP.