PLoS ONE: MUC1-Målrettet Cancer Cell Photothermal ablation Brug bioinspirerede Gold nanorods

Abstrakt

Nylige undersøgelser har fremhævet overekspression af mucin 1 (MUC1) i forskellige epiteliale carcinomer og dens rolle i tumorigenese. Disse muciner præsentere en ny mulighed målretning for nanopartikler-medieret fototermisk kræft behandlinger grund af deres unikke antenne-lignende ekstracellulær forlængelse. I denne undersøgelse blev MUC1 antistoffer og albumin immobiliseret på overfladen af ​​guld nanorods bruger “primer” af polydopamine (PD), en molekylær efterligning af catechol- og amin-rige musling adhæsive proteiner. PD danner en klæbende platform for aflejring af albumin og MUC1 antistoffer, at opnå en overflade, der er stabil, bioinert og biofunktionelle. To-foton luminescens konfokal og mørkefelt spredning billeddannelse afslørede målretning af MUC1-BSA-PD-NR’er til MUC1

+ MCF-7 brystcancer og SCC-15 pladecellecarcinom cellelinjer. Behandlede celler blev udsat for en laser, som omfatter det nærinfrarøde AuNR langsgående overfladeplasmonresonans og vurderet for fototermisk ablation. MUC1-BSA-PD-NR’er væsentligt nedsat cellelevedygtighed i photoirradiated MCF-7 cellelinier vs. MUC1- MDA-MB-231 brystcancerceller (p 0,005). Midler udviste ingen cytotoksicitet i fravær af fototermisk behandling. Den facile karakter af belægningen metode, kombineret med målretning og fotoablation effektivitet, er attraktive træk ved disse kandidat kræft nanotherapeutics

Henvisning:. Zelasko-Leon DC, Fuentes CM, Messersmith PB (2015) MUC1-Målrettet Cancer Cell photothermal Ablation Brug bioinspirerede Gold nanorods. PLoS ONE 10 (7): e0128756. doi: 10,1371 /journal.pone.0128756

Redaktør: Bing Xu, Brandeis University, UNITED STATES

Modtaget: Marts 25, 2015; Accepteret: May 1, 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Zelasko-Leon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Imaging arbejde blev udført ved Northwestern University center for Avanceret Molekylær Billeddannelse (CAMI), generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 tildelt H. Lurie Omfattende Robert cancer center. Dele af denne forskning blev udført på Keck-II og EPIC kerner af Northwestern University Atomic og Nanoscale karakterisering Experimental (NUANCE) Center. NUANCE center er støttet af MRSEC programmet (NSF DMR-1.121.262) på Material Research Center, International Institute for nanoteknologi (IIN), Keck Foundation, og staten Illinois. Yderligere karakterisering eksperimenter materiale blev carrieed ud med støtte fra Northwestern University High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) og Keck Biofysik Facility. Dette arbejde blev yderligere understøttet af Northwestern University flowcytometri Facility og en Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). DCZL blev understøttet af en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-0.824.162, https://www.fastlane.nsf.gov/grfp) og en Malkin Scholar Award fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center (RHLCC) af Northwestern University (https://cancer.northwestern.edu/research/research_programs/funding/). CMF blev understøttet af en McCormick Summer Research Award (https://www.mccormick.northwestern.edu/students/undergraduate/research-opportunities/). Yderligere støtte blev leveret af NIH tilskud R01 EB005772 og R37 DE014193 (PBM, https://report.nih.gov/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

Au nanorods (AuNRs) er meget attraktive konstruktioner til tumorterapi grund af deres lette syntese, afstemmelige nær-infrarøde (NIR) lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR), og store, funktionaliserbare overfladearealer [1, 2 ]. LSPR forbedrer optiske egenskaber, der giver anledning til høje absorbans, spredning, og to-foton luminescens fænomener, der kan udnyttes til fototermisk cancerterapi og diagnostisk billeddannelse [1, 2, 3]. Patienter med dårlige tumor margener eller mikroskopisk sygdom kan være dårlige kandidater til invasive kirurgiske procedurer og står til at drage fordel af forbedrede multimodale tilgange [1]. Den ikke-invasive indtrængning af NIR energi til AuNR-behandlede væv tillader lokaliseret hypertermi resulterer i tumor ablation. Som en ekstra fordel, kan denne varme forbedre vævsperfusion, stigende efterfølgende nanopartikel lastning og effekten af ​​adjuverende kemoterapi eller strålebehandling [4, 5].

En primær udfordring i AuNR-baserede behandlinger vedrører ændring eller udskiftning af indledende CTAB dobbeltlag med en overfladebelægning, der er både bioinert og biofunktionelle [6]. En række passiveringslag strategier er blevet udviklet for at overvinde dette problem. Disse strategier omfatter modifikation med amfifile syntetiske polymerer, såsom poly (ethylenglycol) -thiols (PEG-SH) [7], lipider [8], elektrostatiske lag af polyanioniske og polykationiske polymerer [9], og senest, proteiner [10, 11]. Den observerede udvikling af et protein korona efter nanopartikel kontakt i serum-holdige biologiske medier har støttet interesse i albumin som en potentiel nanopartikel passivering agent [11].

Transmembrane muciner rige på glycosyleret prolin, threonin og serin domæner span epitelcellen membran og tilvejebringe en barriere funktion gennem ectodomæner der rager mere end 100 nm fra celleoverfladen [12]. Autoproteolysis genererer C-terminal (MUC1-C) og N-terminal (MUC1-N) underenheder, er den sidstnævnte forankret til celleoverfladen via en stabil, men ikke-kovalent kompleks med MUC1-C. Mens muciner udtrykkes typisk på den apikale overflade af celler til beskyttelse mod miljømæssige toksiner, kronisk stress inducerer et tab i cellepolaritet fører til interaktioner af muciner med basolaterale overflade signalmolekyler såsom receptortyrosinkinaser, udløser den nedstrøms aktivering af spredning og overlevelse gener . MUC1 opreguleres som reaktion på tilstrømningen af ​​inflammatoriske cytokiner under inflammation og infektion, hvilket fører til tab af polaritet og styrke den beskyttende funktion af slimhinden barriere.

Selvom forbigående MUC1 aktivitet funktioner til at reducere inflammation, langsigtet overekspression fremmer aggressive fænotyper i humane kræftformer. MUC1-N indeholder stærkt glycoslyated tandemgentagelser af 20 aminosyrer og er aberrerende underglykosylerede i epiteliale carcinomer, udsætter rester impliceret i immunosurveillance af cancer [13]. MUC1-N kan blokere overfladeinteraktioner og kan også gennemgå sekretion fra cellemembranen, hvilket tillader receptorlignende aktivering af MUC1-C i forskellige tumor signalveje [12]. Betydningen af ​​MUC1 som en relevant terapeutisk mål er fremhævet af sin atypiske udtryk i 64% af carcinomer diagnosticeres hvert år, og i over 90% af brystcarcinomer uanset hormon eller vækstfaktor receptor status [14].

Funktionen og udnyttelse af MUC1 som et tumorantigen fortsat blive belyst [15] . På trods af sin antenne-lignende fysisk manifestation som i princippet egner godt til terapeutisk målretning af mucin-udtrykkende tumorer [12, 16], er MUC1 blevet underudnyttet i målrettet cancerterapi [17, 18, 19, 20]. Undersøgelser har vist, at MUC1 overekspression direkte fremmer

in vivo

transformation af mælkekirtlen og dens afvigende udtryk i transformerede celler kan fremkalde sterisk blokering eller aktivering af celleoverfladereceptorer, der tjener som en drivkraft for invasion [21] og kemoterapi resistens [22, 23]. Klinisk påvisning af cirkulerende serum mucin niveauer er en FDA-godkendt prognostiske faktor i behandlingen af ​​brystkræft [12] og fase III kliniske forsøg evaluere MUC1 baserede immunterapier er undervejs [24].

Her har vi demonstrere polydopamine-medieret (PD) konjugering af guld nanorods (AuNRs) med bovint serumalbumin (BSA) og mucin 1 monoklonale antistoffer (anti-MUC1) til passivering og målretning, (fig 1). De vigtigste mål for dette arbejde var at identificere optimale betingelser for nanopartikel funktionalisering og at demonstrere muligheden for photothermal ablation af MUC1 positive kræftceller via biofunctionalized AuNRs. Resultaterne etablere optimale betingelser for overfladebehandling af AuNRs med BSA og MUC1 antistof og fysiologisk stabilitet. Vellykket målretning og fotoablation af MUC1 positive kræftceller antyder disse konstruktioner kan være nyttige anticancer lægemidler i fremtiden.

MUC1 antistoffer tjene konstruktioner som nye målretning i anvendelsen af ​​plasmoniske photothermal terapi (A). Sondering MUC1 målrettet på underglykosylerede N- og C-terminale domæner i forskellige epiteliale carcinomer vil udvide vores kræft-targeting repertoire med potentiale for synergistiske terapeutiske virkninger (B, tilpasset fra [12]).

Materialer og Methods

Materialer

Dopamin-hydrochlorid, cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 99%), sodium tetrachloroaurate (III) dihydrat (NaAuCl

4 · 2H

2O, 99%), natriumborhydrid (NaBH

4, 98%), ascorbinsyre, glycin og sølvnitrat (AgNO

3, 99%) blev anvendt til AuNR syntese. PH-værdien af ​​den glycin-opløsning (0,2 M) blev indstillet til 8,0 med 2 M natriumhydroxid før brug. Alle reagenser blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet. AlexaFluor 633 gede-anti-muse-immunoglobulin (IgG) blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Anti-MUC1-N (VU4H5), anti-MUC1-N-PE (VU4H5 PE), muse-anti-MUC1-C (H-6), gede-anti-muse-HRP IgG, gede-anti-kanin-HRP IgG og kanin-anti-BSA (B-140) primære antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ged anti-mus IgG og gede-anti-kanin IgG-antistoffer konjugeret til PE og /eller HRP blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ultrarent, deioniseret vand (18.2MΩ · cm) blev anvendt til at forberede alle vandige opløsninger. SCC15, MCF-7 og MDA-MB-231 cancer cellelinjer var generøse gaver fra laboratorier Dr. David Crowe på University of Illinois-Chicago og Dr. Dean Ho ved Northwestern University.

Metoder

syntese af guld NR’er.

syntesen af ​​CTAB-overtrukne AuNRs (CTAB-NR’er) er veletableret i litteraturen og blev udført ifølge en let modificeret metode anvendes af Huang et al [2] . Alle reagenser blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet. En 0,2 M CTAB vandig opløsning (5,0 ml) blev opvarmet til 30 ° C og blandet med 0,5 mM NaAuCl

4 (5,0 ml). Iskold 0,01 M NaBH

4 (0,6 ml) blev tilsat til denne blanding, og sonikeret i 5 minutter, indtil en gul-brun frø løsning udviklet. Dernæst blev 50,0 ml 0,2 M CTAB forsigtigt blandet med 50,0 ml 1,0 mM NaAuCl

4 og 0,1 ml 0,1 M AgNO

3 til dannelse af en vækst opløsning. Ascorbinsyre (78,8 mM, 0,7 ml) blev tilsat til væksten opløsning som et mildt reduktionsmiddel, efterfulgt af tilsætning af 120 pi af frøene opløsning. Efter 45 minutter blev 100 ml af denne AuNR opløsning blandes med 100 ml 0,2 M glycin (pH 8,0). Denne opløsning fik lov til at reagere natten over uden omrøring ved omgivelsestemperatur.

Biofunctionalization af guld NR’er.

I syntesen af ​​BSA-PD-NR’er, 1 ml prøver af CTAB-NR’er blev centrifugeret ved 10.360

xg

i 10 min for at danne en pellet. Supernatanten blev kasseret, og pelleten blev gendispergeres i 1,0 ml 10 mM bicin-buffer (pH 8,5) suppleret med 0,1 mg /ml dopamin-hydrochlorid. En polydopamine coating blev fremkaldt med lydbehandling ved 37 ° C i 30 minutter. En 1,0 ml opløsning af 20 mg /ml BSA fremstillet i PBS (Ca

2+ og Mg

2+ free) blev tilsat til denne PD-NR blandingen og fik lov at reagere i yderligere 30 minutter med lydbehandling. Efter omsætning natten over under forsigtig omrøring, blev prøverne centrifugeret, gendispergeres i vand eller PBS, og opbevares ved stuetemperatur indtil videre anvendelse. For antistof bøjninger, 0,25-5,0 ug antistof var enten omsættes direkte med CTAB- eller PD-NR’er før BSA tilføjelse eller færdigblandet med BSA eller bufferopløsninger inden tilsætning.

antistof binding og kvantificering.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

: gede-anti-muse-IgG overtrukket 96-brønds ELISA mikroplader (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) blev skyllet med PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). Muse anti-MUC1-N /C-antistof standarder og AuNR supernatant prøver indeholdende ukendte mængder af MUC1-N eller -C (100 pi /brønd) blev fyldt og fik lov til at fange i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig blanding. Pladerne blev vasket 3X i 200 pi PBST. Sekundært gede-anti-muse-IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, 100 uL /​​brønd, 1: 6000 fortynding) blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C under blanding. Pladen blev vasket 3 gange med PBST og en 1 mg /ml 2,2′-azino-bis (3-ethylbenz-thiazolin-6-svovlsyre) (ABTS) opløsning blev fremstillet i 50 mM citronsyre og 100 mM dinatriumphosphat . Umiddelbart før anvendelse blev ABTS opløsning blandet med 10 pi 30% H

2O

2 og tilsat til brønde (100 ul). ABTS farveudviklingen baseret på tilstedeværelsen af ​​HRP-mærkede sekundære antistof blev målt ved 405 nm inden for 15 minutter på en Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Mængden af ​​AuNR-bundne MUC1-N og MUC1-C-antistoffer blev bestemt ved at subtrahere koncentrationerne påvist i prøven supernatanter fra de kendte belastningsbetingelser under fremstillingen. Koncentrationer blev beregnet ud fra punkt-til-punkt lineær regression standardkurver

Optisk spektroskopi

UV-Vis-NIR spektrofotometri

:.. UV-Vis-NIR spektre af forskellig modificerede AuNRs blev registreret i et Hitachi U-2010 spektrofotometer (Hitachi City, Japan). Langsgående LSPR toppositioner blev bestemt og bruges som en indikator for overfladebehandling og sammenlægning

Cirkulær dichroisme

:. Cirkulære dichroisme (CD) spektre blev optaget med en J-815 CD spektrofotometer (Jasco, Easton, MD) i det fjerne UV område (190-300 nm, 1 nm opløsning) i 1 mm banelængde kvartskuvetter ved omgivelsestemperatur. AuNR pellets (30 pi) blev fortyndet i 900 pi ultrarent vand ved alle målinger. BSA (0,25 mg /ml) tjente som et protein reference, mens ultrarent vand blev anvendt til baggrund subtraktion. Den rumlige arrangement og rygrad konformation af protein amider giver anledning til den karakteristiske CD spektre af specifikke sekundære strukturer. Minima ved 222 og 208 nm skyldes a-helical protein amider og lys polariseret i retningen af ​​a-helixer henholdsvis [25]. Mens metoder til beregning af% helicitet er bredt tilgængelige [26], de kræver protein koncentrationer, som ikke kunne være præcist bestemt i vores eksperimenter på grund af catecholamin interferens [27]. Således at kvantificere omfanget af sekundær struktur konservering i BSA, den α-helix tilbøjelighed [26], (1) kan anvendes som en grov men praktisk estimat af α-helix indhold, hvor

θ

repræsenterer rå ellipticitet i millidegrees ved 208 og 222 nm. Forhold mellem 0,80 og 0,95 repræsenterer enkeltkædede a-helixer og øges med stigende α-helix indhold [26].

cellekultur.

MCF-7 brystcancerceller blev dyrket i høj glucose DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% FBS (Invitrogen), 1% gentamicinsulfat (Invitrogen), og 10 ug /ml rekombinant human insulin (Santa Cruz Biotechnology). MDA-MB-231-celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% FBS og 1% gentamicinsulfat. SCC15 oral pladecellecarcinom blev dyrket i højglucose DMEM suppleret med 10% FBS og 1% gentamicinsulfat. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i inkubatorer med fugtig luft med 5% CO

2.

Cell billeddannelse.

For fluorescens og to-foton luminescens (TPL) konfokal billedbehandling, suspensioner af celler (1×10

5) i 0,2 ml medie blev podet i hver af de 8 brønde i en Lab-Tek kamre dækglas slide (Nunc, Rochester, NY). Celler blev dyrket til konfluens og inkuberet med frisk medium indeholdende AuNRs (3 pm). Celler blev inkuberet med AuNRs i 24 timer, skyllet to gange med PBS, og afbildes levende for TPL emissioner i frisk medium. Konfokal billeder blev erhvervet med en omvendt Axio Observer. Z1 mikroskop udstyret med et 20X objektiv og opvarmet fase (37 ° C) indstillet til 5% CO

2 inkubation (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). For TPL billeddannelse blev AuNRs ophidset af en Mai Tai femtosekund (fs) Ti: Sapphire laser (Mai Tai, Spectra-Physics, Santa Clara, CA) med en puls på 130 fs og en gentagelse på 80 MHz. TPL Excitationsbølgelængden blev indstillet til LSPR toppen af ​​AuNR prøve (780 nm). En intern spektral detektor korrigeret for emissioner mellem 500-615 nm detekteres TPL fra AuNRs. En 543 nm HeNe-laser anvendtes til lysfelt billeddannelse. I mørkefelt (DF) scattering eksperimenter blev celler podet (1×10

4 celler /brønd) på 16 og chamber slides (Lab-Tek, Nunc), dyrket til konfluens, og behandlet med 3,75 pM AuNRs i medier i 1 time. Individuelle brønde blev skyllet 3 gange med PBS. Brøndene og kammer pakninger blev omhyggeligt fjernet og objektglasset blev dækglas til øjeblikkelig billeddannelse ved 40X forstørrelse med en opretstående Leica DM2500 (Wetzlar, Tyskland) mørkefelt mikroskop. Billeder blev erhvervet ved en konstant eksponering (f-stop 1/15) via et EOS Rebel T2i kamera.

elektronmikroskopi.

elektronmikroskopi (EM) gitre (Ted Pella) blev fyldt med pelleterede AuNRs (5 pi, 1 nM), modfarvet med phosphotungstinic syre, og tørret natten over ved omgivelsesbetingelser. Gitre blev afbildet med en Hitachi HD-2300 Ultra High Resolution field-emission scanning transmissions elektron mikroskop (FE-STEM) (Hitachi City, Japan) i transmission EM (TEM) og sekundære elektron (SE) tilstande.

ζ potentiel analyse.

modificerede og umodificerede AuNRs (15 pm) blev injiceret i standard foldet kapillær celler til f-potentiale målinger. Målinger blev udført på en Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, Storbritannien) ved omgivelsestemperatur og beregnet som gennemsnittet af syv scanninger.

Photothermal behandling med MUC1-modificerede AuNRs.

MCF- 7, MDA-MB-231, og SCC15 (5,0 x 10

5) cancerceller blev dyrket i 12 brønd TCP-plader og dyrket til konfluens over 2-3 dage. Brønde blev vasket med PBS og behandlet med 0-3 pM anti-MUC1-N, anti-MUC1-C, eller BSA-only-modificerede AuNRs fortyndet i celledyrkningsmedier. Efter 1 h inkubation ved 37 ° C og 5% CO

2, brøndene blev skyllet 3X med PBS for at fjerne ubundne AuNRs og markeret ved to fokuspunkter med ækvivalente Confluence niveauer. En af hver af disse punkter blev udsat for en SuperK Versa bredbånd laserkilde (NKT Photonics, 480-850 nm, 1 mm spot) i 3,5 minutter ved en effekttæthed på 0,18 W /nm ved plasmon center bølgelængde (780 nm). Efter en 24 timers inkubation blev cellerne skyllet med PBS og farvet med calcein AM (2 uM) og propidiumiodid (4 uM) for levende /døde billeddannelse. Fluorescens mikroskopi blev udført med et Leica DMIRB mikroskop (Wetzlar, Tyskland) udstyret med en 250 W Hg-buelampe og en QIClick kamera (QImaging, Surrey, BC Canada). Punkter af bestråling og ikke-bestråling blev fanget i hver brønd til sammenligning. Billeder blev behandlet med GNU Image Manipulation Program (GIMP, v. 2.8.0). ImageJ anvendes til omdannelse live /dead billeder til sort (baggrund) og hvide (celler) tærsklingsbehandles masker. Den procentvise del af baggrunden pixels med (Area%

+ NIR) eller uden laser eksponering (Area%

-NIR) blev beregnet med

Mål

funktion i ImageJ. Følgende ligning blev anvendt til at kvantificere behandlingseffektivitet: (2) Resultater blev normaliseret til ubehandlede fordybninger ± NIR eksponering. Forsøg blev gentaget med SCC15 mundtlige og MDA-MB-231 brystkræft cellelinier.

Statistisk analyse.

t-test blev anvendt til at analysere procent antistof læsses fra ELISA. To-vejs variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni post-tests blev anvendt til at bestemme, om de gennemsnitlige% levedygtige områder blandt MUC1

+ og MUC1

– cellelinjer var væsentlige for dosering og behandling betingelser. Forskellene blev betragtet som statistisk signifikant, når

P Drømmeholdet værdi var 0,05 (n = 3-6). Alle analyser blev udført af GraphPad Prism-version 5.0a til Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultater og Diskussion

Albumin som en overflade passiverende agent

minimal uspecifik begroning af overflader er ofte et ønskværdigt mål i biomedicinsk forskning og medicinsk udstyr design [28, 29], for hvilke der er foreslået podning af biomolekyler og syntetiske polymerer til en overflade som en opløsning [30, 31]. Graden og arten af ​​uspecifik protein adsorption til en overflade er afhængig af mange faktorer, herunder protein sammensætning (størrelse, koncentration, ladning, og intern stabilitet), miljøforhold (pH, temperatur og ionstyrke), og overfladeegenskaber (morfologi, opkræve , og fri energi) [32]. Anvendelsen af ​​adsorberet BSA som en tilgang til overfladepassivering har længe været en spændende strategi til biomedicinske forskere. En af de tidligste anvendelser af denne strategi var observation ved Packham og andre, at blodplader modstår adsorption til albumin-coatede glasrør [33]. Passivering med albumin blev foreslået for plasmaferesecentre kredsløb, arterielle proteser samt andre blodprodukter i kontakt anordninger forhindrer trombogenese, men denne fremgangsmåde viste begrænset effekt på grund af lav overfladedækning eller forskydning af fysisorberet albumin ved proteiner med højere bindingsaffiniteter [34].

Efterfølgende blev gjort forsøg på tværs af link adsorberet albuminer med glutaraldehyd eller gammastråling behandlinger; imidlertid det resulterende tab i protein fleksibilitet begrænser deres evne til at bidrage til sterisk frastødning [35]. Da disse første observationer, er albumin blevet brugt til at modificere jernoxid [36], polystyren [37], Ag og Au [38, 39], kvantepunkt [40], og liposomale nanopartikler [41]. Undersøgelser har ikke blot vist, at BSA-konjugerede nanopartikler reducerer aggregatdannelse, men de har også afsløret forbedring af kvanteudbytte, som er af relevans for de fototermisk applikationer udforskes i denne undersøgelse [42].

Polydopamine til funktionalisering nanopartikler med biomolekyler

i denne undersøgelse beskrives en musling adhæsivt protein inspireret strategi til forankring BSA og antistof på overfladen af ​​guld nanorods. Det marine musling er promiskuøs begroning af organiske og uorganiske overflader er blevet tilskrevet af Waite og andre til de usædvanlige proteiner, der findes i de terminale klæbende plaques sine byssal tråde [43, 44]. Specifikt høje niveauer af catechol-holdige aminosyre 3-4-dihydroxyphenylalanin (DOPA) og aminholdige aminosyren lysin forekommer i byssal plaques, og denne observation er i høj grad påvirket udformningen af ​​alsidige molekylære klæbemidler, ankre for syntetiske polymerer, og overordnede strategier for overfladebelægninger [44, 45].

Motiveret af den høje katekolamin indholdet af musling adhæsive proteiner, blev dopamin identificeret som en simpel strukturel efterligner af muslingefod protein 5 (MFP-5) og vist spontant deponere tynde melanin-lignende film på stort set alle bulk-materiale overflade [46]. Polydopamine (PD) film dannes ved spontane polymerisering af dopamin-molekyler under mildt alkaliske vandige betingelser, der efterligner det marine miljø. Selv om mekanismen for dannelse og endelige sammensætning af PD er stadig under undersøgelse [47, 48, 49, 50, 51, 52], på de betingelser, der normalt anvendes til at danne PD belægninger dopamin oxideres til at give dopamin-quinon som efter intramolekylære omlejring , yderligere oxidation og intermolekylære kobling, giver en eumelanin-lignende heterogen polymer [44]. Det er sandsynligt, at en række forskellige strukturelle underenheder og limning typer findes inden PD filmen såvel som på PD-substrat og PD-protein-grænseflader, herunder kovalente bindinger, elektrostatiske og stærke ikke-kovalente interaktioner, såsom ladningsoverførsel, hydrogenbinding, og π-stabling. Klæbemidlet og reaktive karakter polydopamine tynde film blev udnyttet som en bekvem platform eller primeren «hvorpå kan deponeres yderligere sekundære coatinger via en række potentielle mekanismer, herunder kovalent binding med organiske thiol, amin og histidinrester [53]. Med denne fremgangsmåde i to trin til en lang række funktionelle anvendelser af polydopamine er blevet udviklet til biomedicinske anvendelser [54], såsom podning af PEG-thioler til at undertrykke biologisk forurening [46, 55] eller den særlige fremme af celleadhæsion til overflader [ ,,,0],46].

Fremstilling og karakterisering af BSA modificeret AuNRs Salg

Ændring af AuNRs med PD blev udført som tidligere beskrevet [56, 57], hvilket gav AuNRs omgivet af en tynd PD belægning. Tilstedeværelsen af ​​PD blev bekræftet ved UV-vis rødforskydning (Fig A i S1 File). PD-NR’er fandtes at aggregere i puffer, men redispergering i BSA-opløsning og isolering ved centrifugering førte til stabile dispersioner af BSA-PD-NR’er. Brug af løsningen AuNR LSPR intensitet og peak shift (Fig B i S1 File) analyseret via UV-Vis-NIR spektrofotometri som et mål for NR stabilitet, screening af en række BSA-koncentrationer (0-30 mg /ml), der anvendes i de to -Step belægningsmetode førte til identifikation af en optimal protokol bestående af 0,1 mg /ml dopamin for PD coating af CTAB-NR’er fulgt af stabilisering i ≥10 mg /ml BSA. Under disse optimale betingelser, sammenlægning af BSA-PD-NR’er var syv gange mindre i forhold til PD-NR’er (Fig B i S1 File). Alle efterfølgende eksperimenter blev udført på PD-NR’er modificeret ved 20 mg /ml BSA for at sikre fuld passivering af PD underlag, der ellers kan tjene til at fremme AuNR aggregering. AuNRs (20 x 60 nm) modificeret med PD og BSA (20 mg /ml) blev afbildet via TEM efter modfarvning med phosphorwolframsyre at give kontrast til det organiske BSA lag. Et lag måling ~ 15 nm i tykkelse blev visualiseret på godt adskilte BSA-PD-NR’er i SE-tilstand (Fig 2A). Dæmpningen af ​​XPS Au4f signal af en guld overflade observeret ved udsættelse for dopamin og BSA er i overensstemmelse med aflejringen af ​​en PD coating efterfulgt af podning af BSA (Figur C i S1 File).

(A) Elektronmikroskopi BSA-PD-NR’er i sekundær elektron-mode. Scale bar = 600 nm; Indsat = 50 nm; (B) Cirkulær dichroisme af modificeret versus umodificeret guld NR’er. BSA-modificerede NR’er blev modificeret med 10 eller 20 mg /ml BSA, som angivet. Koncentrationen af ​​BSA kontrol var 0,25 mg /ml. Proteindenaturering i β-sheet-dannelse er angivet på PD-behandlede NR’er modificeret med en suboptimal koncentration af BSA. Ellers BSA sekundær struktur bevares, som kvantificeret ved den respektive α-helical tilbøjelighed af hver modifikation.

AuNRs blev yderligere evalueret via UV-Vis-NIR-spektroskopi at analysere ændringer i den langsgående LSPR topposition (fig B i S1 File). BSA-DP-NR’er demonstrerede en plasmon-rød forskydning på 10 nm på grund af ændringer i det lokale dielektriske miljøet som følge af overfladeadsorption begivenheder. Denne ændring i maksimal LSPR bølgelængde, Δλ

max, svarer til en adsorberet tykkelse

d

af 15 nm baseret på ligning [57, 58], (3) Hvis

m

er den bulkbrydningsindeks respons nanopartikel, Δ

n

er brydningsindekset ændring induceret af adsorberende arter, og

l

d

er henfaldet længde af det elektromagnetiske felt. Denne beregnede tykkelse er i overensstemmelse med vores TEM observationer (Fig 2A). Derudover blev f-potentiale målinger registreres for at spore AuNR biofunctionalization og er rapporteret i tabel 1. Den trinvise ændring i ζ-potentiale med PD og BSA modifikation kulminerede i et negativt ladet BSA belægning.

BSA binding til PD-NR’er sandsynligvis opstod via kovalente mekanismer beskrevet ovenfor eller ved kovalent kobling til nogen af ​​60 tilgængelige overflade lysinrester [38]. Parallelle eksperimenter udført på ubehandlede CTAB-NR’er dispergeret i 10 mg /ml BSA gav ikke en stabil suspension, hvilket indikerer vigtigheden af ​​PD i styrkelsen BSA passivering. Selvom højere koncentrationer af BSA viste sig at stabilisere CTAB-AuNRs i fravær af PD som angivet ved sedimentation forsøg (Fig B i S1 File) og ELISA (data ikke vist), disse konstruktioner undladt at lette optimal antistof immobilisering i senere eksperimenter.

tertiære struktur af serumalbumin er sammensat af tre domæner (i-III), som yderligere er opdelt i ni sløjfer med 17 disulfidbindinger [59]. Især BSA opretholder en enkelt fri sulfhydryl rest ved Cys-34, hvis tilstedeværelse er impliceret i både metalchelatering og frie radikaler aktivitet [60]. I fysiologiske betingelser, BSA fastholder 67% α-helix indhold, 10% p-drejninger, og 23% forlænget kæder [59, 61]. Ved fysiologisk pH BSA opretholder en negativ nettoladning (pI = 4,7), bidrager til dens fremragende vandopløselighed, selvom der forventes et fald i effektiv ladning som en funktion af stigende pH [59, 62], belyse den potentielle betydning af elektrostatiske interaktioner albuminbinding til CTAB eller polydopamine modificerede overflader. Vigtigt er det, så er der elektrostatisk drevet adsorption af negativt ladet BSA ved pH 8,5 til AuNR overflader dekoreret af kationiske CTAB ammoniumgrupper hovedgrupper sig at inducere nogle denaturering af α-helical sekundær struktur som observeret via cd (Fig 2B).

vi foreslog polydopamine-medieret adsorption af BSA som en simpel strategi til forbedring af kolloide stabilitet af guld nanorod suspensioner samtidig minimere indvirkningen til den sekundære struktur af proteinet belægning. Vi fandt, at BSA-PD-NR’er var i stand til at opretholde en højere α-helical tilbøjelighed (p (α) = 0,899) sammenlignet med BSA-only modificerede modstykker (p (α) = 0,824), og at dette forhold nærmere nærmede sig kontrol BSA standard (0,25 mg /ml, p (α) = 0,917). Den høje alfa-helix tilbøjelighed betragtes det som fordelagtigt, da denaturering kan føre til den uønskede udsættelse af immunstimulerende domæner i BSA [42, 63]. Desuden er en elektrostatisk drevet modifikation som det ville være tilfældet i fravær af PD, kan være ustabil i fysiologiske miljøer [11], hvilket tillader fortrængningen af ​​passivering BSA ved højere affinitet proteiner, der kan køre fjernelse af nanopartikler via det retikuloendoteliale system [64 ]. Delvis BSA denaturering kan afsløre og forstyrre interiør disulfid obligationer, som har vist sig at bidrage til limning gennem Au-thiol interaktioner [65].

Det er slående, BSA-PD-NR’er udarbejdet på suboptimal 10 mg /ml BSA-koncentrationer sammen som denaturerede p-sheets (fig 2B).