PLoS ONE: Energy Landscape Analyse af kræft mutationer i Protein kinaser

Abstrakt

Den voksende interesse for at kvantificere det molekylære grundlag af protein kinase aktivering og allosterisk regulering af kræft mutationer har givet næring beregningsmæssige undersøgelser af allosterisk signalering i proteinkinaser. I den foreliggende undersøgelse, vi kombineret computersimuleringer og den energi landskab analyse af protein kinaser at karakterisere samspillet mellem onkogene mutationer og lokalt frustrerede sites som vigtige katalysatorer for allostetric kinase aktivering. Mens strukturelt stive kinase kerne udgør en minimalt frustreret hub af katalytisk domæne, lokalt frustreret klynger restkoncentrationer, hvis samspil netværk er ikke energisk optimeret, er tilbøjelige til dynamisk graduering og kunne gøre det muligt for allosteriske konformationelle overgange. Resultaterne af denne undersøgelse har vist, at den energi landskab effekt af onkogene mutationer kan være allosteriske fremkalder globale ændringer i den rumlige distribution af meget frustrerede rester. Vi har fundet, at mutation-induceret allosterisk signalering kan omfatte en dynamisk kobling mellem strukturelt stive (minimalt frustreret) og plast (lokalt frustreret) klynger af rester. Den præsenterede undersøgelse har vist, at aktivering kræft mutationer kan påvirke termodynamisk ligevægt mellem kinase tilstande ved allosterisk at ændre fordelingen af ​​lokalt frustrerede sites og øge den lokale frustration i den inaktive form, og samtidig fjerne lokalt frustrerede sites og genoprette strukturel stivhed den aktive form. Energien landsape analyse af protein kinaser og den foreslåede rolle lokalt frustrerede steder i aktivering mekanismer kan have nyttige konsekvenser for bioinformatik-baserede screening og detektion af funktionelle sites kritiske for allosterisk regulering i komplekse biomolekylære systemer

Henvisning:. Dixit A, Verkhivker GM (2011) Energimæssigt Analyse af kræft mutationer i proteinkinaser. PLoS ONE 6 (10): e26071. doi: 10,1371 /journal.pone.0026071

Redaktør: Jie Zheng, University of Akron, USA

Modtaget: Juni 21, 2011; Accepteret: September 19, 2011; Udgivet: 6. oktober, 2011

Copyright: © 2011 Dixit, Verkhivker. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er delvist støttet af midler fra The University of Kansas. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hurtig og effektiv kommunikation af langtrækkende konformationsændringer i proteiner spiller en afgørende rolle i allosterisk regulering af biologiske systemer [1], [2]. Nylige skelsættende anmeldelser af protein allosteri har fremhævet en central rolle cooperativitet og forestillingen om, at katalyse og allosteri kan opstå via fælles kommunikationsveje [3], [4]. Modellering af allosteriske overgange i biologiske molekyler er blevet væsentligt fremført af udviklingen af ​​elastiske netværksmodeller og normale tilstand analyse tilgange [5] – [22]. Elastik netværksmodeller af protein dynamik og signal formering teori har tilladt for en kvantitativ analyse af langtrækkende allosteriske protein interaktioner [13] – [16]. Sekvens-baserede evolutionær analyse [23], [24] og struktur tilgange [19], [20], [25] – [27] har vist, at allosteriske veje i proteiner kan dannes gennem interaktioner mellem evolutionær bevaret og tyndt tilsluttet klynger af rester, der er energisk koblet til mægle langtrækkende kommunikation. En omfattende analyse af allosteriske mekanismer har ført til et samlet overblik over allosterisk regulering, der indebærer eksistensen af ​​allerede eksisterende konforme tilstande og flere kommunikationsveje på konformationel landskab [28] – [32]. Energi landskab teorier og forenklede energimodeller har givet en solid teoretisk ramme at belyse fundamentale aspekter af proteinstruktur, dynamik og allosterisk regulering [33] – [43]. Ifølge den moderne energi landskab teori, tilfældige sekvenser har forrevne landskaber med mange lokale minima som følge af alvorlige modstridende interaktioner (et fænomen kaldet “frustration”), og som et resultat, at forekomsten af ​​strukturelt alternative endnu energisk lignende konformationer. De energi landskabsmodeller har også foreslået, at protein-lignende sekvenser kan have udviklet sig til delvis at fjerne frustrerede interaktioner mellem aminosyrer og har glattet ( “tragt-lignende”) landskaber for at sikre hurtig folde til deres termodynamisk stabile indfødte strukturer. Dette er blevet kendt som »princippet om minimal frustration ‘[44], [45]. Den kanaliseret-lignende karakter af energi landskaber til naturlige proteiner indebærer, at de konformationer, der strukturelt ligner den oprindelige tilstand er også lav i energi og de indfødte statslige interaktioner minimalt frustrerede [33] – [45]. En generaliseret billede af allosterisk regulering baseret på den energi landskab teori (ofte betegnes som en “konformationel udvalg model”), tyder på, at et protein kan fungere i en dynamisk ligevægt af strukturelt forskellige konforme tilstande, hvorved effekten af ​​binding eller mutation kan formeres i lange afstande med samvirkende forskyde ligevægten hen imod en funktionelt relevant konformation [46] – [52]. Den “gamle” view (induceret fit mekanisme) og den “nye” visning (konformationel udvælgelse mekanisme) protein allosteri syntes ikke at være gensidigt udelukkende, men snarere et supplement i rationalisering allosteriske mekanismer på molekylært niveau [53] – [56]. Fysik-baseret simulation tilgange har givet en overbevisende dokumentation for kobling mellem kollektive bevægelser og lokale strukturelle ændringer som en vigtig underliggende princip om allosterisk kommunikation i biomolekyler [53] – [60]. Termodynamik tilgange har yderligere knyttet globale og lokale strukturelle forstyrrelser med fri energi ændringer af allosterisk kobling i mekanismer konformationel skift [61] – [64]. Desuden har energi landskabsmodeller foreslået, at langtrækkende kooperativitet af protein-protein interaktioner under allosteriske overgange kan fremme en kombination af befolkningen-shift og induceret-fit mekanismer, hvorimod kortrækkende, allosterisk binding af proteiner med inhibitorer kunne ofte fortsætte via befolkningen-shift mekanisme [65] – [72]

Ferreiro og Wolynes [69] har for nylig avancerede energi landskab teori ved at kombinere biofysisk modellering og strukturelle bioinformatik analyser af lokale protein interaktioner, der er grundlæggende for foldning. , binding og allosterisk regulering. Ifølge denne model, kan minimalt frustrerede landskaber af protein netværk har udviklet sig til at erhverve evnen til regulering via kooperative allosteriske ændringer. Den foreslåede metode har kvantificeret graden af ​​rumlig lokale frustration i proteiner ved hjælp af en lokal version af den globale kløft kriteriet formulering af den minimale frustration princippet [33] – [45]. Denne model indført en lokal frustration metrisk betegnes “konfigurationel frustration indeks” som et mål for lokal stabilisering for en individuel indfødt par med hensyn til et sæt strukturelle lokkefugle genereret ved at forstyrre både identitet og placering af de interagerende aminosyrer [69], [ ,,,0],70]. Ifølge dette kriterium, hvis interaktionen energi af en indfødt par rester er tilstrækkelig stabilisering i forhold til sæt strukturelle lokkefugle, denne rest par er udpeget som “minimalt frustreret ”, ellers interaktionerne kan klassificeres som enten” neutral ” eller “lokalt frustreret”. Det er værd at bemærke, at princippet om minimal frustration ikke kræver en fuldstændig afskaffelse af lokalt stabile alternative strukturer. En vis grad af lokal frustration er altid til stede i en ellers stort set unfrustrated proteinstruktur og kan være opstået fra evolutionære krav til at tilpasse protein dynamik for specifikke funktioner [43].

Analysen af ​​lokalt frustrerede protein regioner bruger en ikke -redundant sæt af 314 monomere proteindomæner og et kurateret sæt redundante dimere komplekser har vist, at de lokalt frustrerede steder svarer til de der er involveret i binding med andre makromolekyler og ligander regioner og kunne ofte sammenstillet med de funktionelle grupper tilbøjelige til store strukturelle ændringer [69 ], [70]. Wolynes og kolleger har for nylig undersøgt en kurateret database af allosteriske proteiner med kendte inaktiv og aktiv krystalstrukturer og har demonstreret, at allosteriske proteindomæner er forbundet af en bane af minimalt frustrerede interaktioner, mens stærkt frustreret rester kan fortrinsvis grupperet nær proteinoverfladen [71 ], [72]. Ifølge denne undersøgelse, minimalt frustrerede regioner i allosteriske proteiner domæner udgør næsten 40% af de samlede kontakter, med omkring 10% af de samlede interaktioner anses for at være “stærkt frustreret”, og resten af ​​interaktioner tilskrives kategorien ” ‘neutral” .

Proteinkinaser signalerer afbrydere med en konserveret katalytisk domæne, der phosphorylerer proteinsubstrater og spiller en kritisk rolle i celle-signaleringsveje [73] – [82]. Proteinkinasegenerne udgør ca. 2% af alle gener i humane genom og dette protein familie består af mere end 500 forskellige medlemmer. De krystalstrukturer af humane proteinkinaser omfatter 167 unikke menneskelige protein kinase domæner og 170 kinaser, overvejer nært beslægtede orthologer (https://www.sgc.ox.ac.uk/research/kinases/). Strukturelle studier af protein kinase katalytiske domæne strukturer og regulatoriske proteinkomplekser har afsløret forskellige scenarier, som kinaser kan styre en dynamisk ligevægt mellem strukturelt lignende aktive og meget specifikke inaktive kinase stater – en strukturel kendetegnende for kinasedomænet kritisk for sin normale funktion [83] – [89]. Allosterisk regulering kan opnås via forskellige mekanismer, herunder inhibitor-induceret stabilisering af den specifikke inaktiv form i ABL [90] – [95], BRAF [96], KIT [97], PDGFR, P38 [98], PI3K kinaser [99] og binding til det allosterisk myristoyl-bindende lomme i ABL [100] – [103]. Protein kinase aktivering kan også reguleres via dannelse af strukturelt forskellige regulatoriske komplekser især eksemplificeret for ABL [104], [105] og EGFR kinaser [106] – [109], men alligevel en samlende strukturel mekanisme i forbindelse med asymmetriske tyrosinkinaseinhibitorer arrangementer i regulatoriske komplekser kunne ligge til grund aktiveringsmekanismen af ​​hele EGF proteinfamilien [110] – [113]. En støt fremgang i forståelsen af ​​protein kinase mekanismer har givet næring en stor indsats for at opdage og design selektive ATP-konkurrencedygtige og allosteriske inhibitorer rettet mod specifikke former for kræft, kinase kræft mutanter og tilhørende målrettede veje [114] -. [116]

Unormal aktivering af regulering i proteinkinaser er en dominerende kilde til tumor-associerede somatiske mutationer. Strukturelle og mutagenese undersøgelser af ABL [93] – [95] og EGFR kinaser [117] – [119] har afsløret strukturelle divergens af kinaser som reaktion på aktiverende mutationer. Kinome hele bioinformatik undersøgelser har bidraget til identifikation af konserverede sekvensmotiver huser sygdomsassocierede og cancer mutationer, hvilket antyder, at et betydeligt antal onkogene kræft mutationer kunne danne strukturelt konserverede mutationelle hotspots i kinase-katalytisk kerne [120] – [123]. Computersimulering studier har undersøgt molekylære mekanismer af protein kinase aktivering i c-Src [124] – [127], adenylatkinase [128], ABL [129], CDK5 [130], KIT [131], RET, MET [132] og EGFR-kinase [133] – [135]. Multi-skala simulation studier af konformationelle overgange i de normale og onkogene former af ABL og EGFR kinaser har indikeret, at virkningen af ​​de onkogene mutanter kan spredes ud over den umiddelbare stedet for mutation, der fører til globale allosteriske ændringer [134]. Senest har datamodellering af allosterisk regulering afsløret organisere principper for mutation-induceret aktivering i ABL og EGFR kinaser, der kan bestemmes ved en dynamisk kobling mellem strukturelt stive αF-helix og konformt adaptive αI-helix og aC-spiraler [136] . Disse strukturelle elementer udgør en dynamisk netværk af effektivt interagerende funktionelle regioner, der kan universelt styrer langtrækkende interdomæne kommunikation og allosterisk aktivering i proteinkinaser. Energimæssigt undersøgelser har tidligere foreslået, at lokaliseret frustration kan være forbundet med allosteriske konformationsændringer i proteiner [69] -. [72]

Kollektivt, har beregningsmæssige undersøgelser antydet, at molekylære mekanismer for allosterisk regulering i proteinkinaser kan være beskrevet ved anvendelse modeller af mutation-induceret modulering af den konformationelle landskab og konformationelle udvælgelsesprincipper i de termodynamisk relevante tilstande. I dette arbejde blev kinome-baserede strukturel bioinformatik analyse og biofysisk modellering af protein kinase strukturer ansat til at karakterisere og kvantificere samspillet mellem onkogene kinase mutationer og lokalt frustrerede sites som potentielle katalysatorer og formidlere af kinase aktivering. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at den energi landskab effekt af onkogene mutationer kan være allosterisk i naturen, fremkalde globale ændringer i den rumlige fordeling af meget frustrerede rester. Vi viser, at kræft mutationer kunne virke ved samtidigt at forstyrre netværket af minimalt frustrerede interaktioner i den inaktive kinase tilstand, samtidig med at den lokale frustration og genoprette allosteriske interaktioner i den aktive kinase formular. Derfor kan lokalt frustrerede steder i den katalytiske kerne tjener en vigtig funktionel rolle ved at muliggøre mutation-induceret konformationelle overgange mod konstitutivt aktive kinase kropsbygning.

Resultater

De Energy Landskaber og Local Frustration i Protein kinaser

i den foreliggende undersøgelse, vi kombineret molekylær dynamik (MD) simuleringer af proteinkinaser med den energi landskab analyse til at karakterisere den rolle, lokale frustration som en vigtig faktor i forbindelse med allostetric kinase aktivering. Fra den energi landskab perspektiv bør de mekanistiske træk ved aktivering overgangene bestemmes af den strukturelle topologi kinasedomænet fold, og derfor kunne fange fremtrædende aspekter af aktiverende mekanisme. For at undersøge den rolle, som lokale frustration i konformationelle overgange mellem strukturelt forskellige funktionelle tilstande, vi undersøgte de lokale frustration profiler i protein kinase strukturer og karakteriseret netværket af minimalt frustrerede interaktioner med ansvar for strukturel stabilitet af kinase katalytiske kerne. Vi har også placeret og karakteriseret klynger af lokalt frustrerede steder hvor princippet minimal frustration kunne krænkes. Ændringen i konfigurationelle frustration indekset ved mutation kan give et kvantitativt mål for en tendens til at skabe en konformationel ændring i proteinet. Effekten af ​​kinase kræft mutationer på lokale frustration profiler tilladt os at kvantificere, hvordan mutation-induceret omfordeling af lokalt frustrerede rester kan fremme allosteriske overgange mellem strukturelt forskellige funktionelle tilstande. Konfigurationen frustration indeks kunne måle den relative stabilitet i en bestemt indfødt kontakt i forhold til det sæt af alle mulige kontakter i denne placering, hvilket gør det muligt at klassificere de enkelte indfødte kontakter i proteinstruktur i henhold til deres frustration niveau. En kinome-dækkende undersøgelse af konfigurationelle frustration indekset beregnes for et stort antal af protein kinase krystalstrukturer (tabel S1 i File S1) viste, at de typiske værdier kan variere mellem -4 til +4. Den samlede rest-baserede distribution af en frustration indeks for vildtype (WT) kinaser blev forudindtaget mod minimalt frustrerede rester med de positive værdier af frustration indeks (figur 1A). Fordelingen vises også en mindre lavvandet top svarende til lokalt frustrerede rester med den frustration indeks i området fra -0,6 til -0,7 enheder. Virkningen af ​​mutationer resulterede i en subtil endnu mærkbar ændring i fordelingen lokale frustration i den katalytiske kerne, afslører en anden lige så vigtigt højdepunkt omkring -1,0 værdi. Derfor blev den samlede fordeling næsten ligeligt fordelt mellem de minimalt frustrerede og frustrerede rester, efterlader færre rester på den neutrale status (figur 1B).

(A) vildtypekinaser og (B) Mutant kinaser.

Vi fokuserede derefter på den lokale frustration analyse udført for en delmængde af protein kinase gener (ABL, EGFR, BTK, kIT, BRAF, MET, og RET), der tegner sig for langt størstedelen af ​​meget onkogene mutationer i det katalytiske domæne (tabel S2 i File S1). Disse proteinkinasegenerne blev udvalgt til en mere detaljeret analyse på grund af det væld af strukturelle og funktionelle oplysninger, der leveres supplerende eksperimentelle data til validering af vores modeller. Vigtigere imidlertid en forskelligartet repertoire af aktiverende og lægemiddelresistente mutationer i disse kinaser gener repræsenterer kritiske cancer syndere som kunne ofte bidrage til en tilstand af onkogen afhængighed i en række forskellige cancere. Fordelingen af ​​lokale frustration i disse kinase gener, som målt ved den konfigurationelle frustration indeks, afslørede et særskilt mønster, hvor toppe blev mærkbart forskudt mod mere frustreret rester for både WT og mutant kinaser (figur 2). Andelen af ​​minimalt frustrerede interaktioner i den katalytiske kerne tegnede sig for mere end 40% af de samlede kontakter med betragtes omkring 15-20% af de interaktioner som frustreret og resten neutral. Denne analyse generelt enige med den rapporterede distribution af frustrerede regioner og deling af minimalt og meget frustrerede rester i proteiner [69], [70]. Men den gennemsnitlige fraktion af lokalt frustrerede rester var højere i proteinkinaser end den rapporteret for små monomere proteiner. Derfor foreslog vores data, at konformationelle landskaber af kinase onkogener kan karakteriseres ved et øget niveau af lokal frustration og protein mobilitet.

(A) vildtypekinaser og (B) Mutant kinaser. Et sæt af beskæftigede kinase onkogener inkluderet ABL, EGFR, BTK, KIT, MET, BRAF, og RET kinaser. Analysen omfattede mutanter af disse kinase gener med høj onkogent potentiale i henhold til de frekvensprofiler i mutationsmønstre prøver ( 5). Fås fra COSMIC repository [153]

Baseret på denne analyse, vi foreslået, at den rumlige fordeling af lokal frustration i proteinkinaser kan reguleres og let ændres ved onkogene mutationer. Ifølge vores formodning, kunne aktivere kinase mutationer forstærke den lokale frustration i inaktiv tilstand, og samtidig fjerne (eller delvis fjernelse) lokalt frustrerede steder i aktiv tilstand. Som følge heraf kan mutation-induceret redistribution af lokale frustration i protein kinase strukturer bidrage til de molekylære mekanismer, der styrer kinaseaktivitet ved at ændre den dynamiske ligevægt mellem funktionelle kinase former. For at verificere denne hypotese, vi analyserede ændringer i den lokale frustration profiler for et repræsentativt sæt af meget onkogen ABL (figur 3) og EGFR-kinase mutanter (figur 4) i både inaktive og aktive tilstande. Vi observerede, at stærkt onkogene mutationer faktisk kan forårsage en stigning i den lokale frustration af muterede rester i den inaktive autoinhibitory tilstand af ABL (PDB ID 1IEP) [90] og EGFR (PDB ID 1XKK) [117] (3, 4). Derfor kan kinase mutationer med en høj onkogent potentiale destabilisere autoinhibited kinase formular. Vigtigere, kunne onkogene mutationer delvis lindre lokal frustration i den aktive kinase tilstand (figur 3, 4). En mere omfattende minimalt frustreret netværk af interaktioner rigidifies den aktive form af det katalytiske domæne for ABL (PDB ID 1M52) [91], [92] og EGFR (PDB ID 2J6M) [118]. Selvom krystalstrukturer anvendes i vores undersøgelse (tabel S1 i File S1) hovedsagelig blev løst i den ubundne form, var der visse strukturer i den undersøgte sæt (især ABL og EGFR kinaser), der oprindeligt blev krystalliseret i komplekser med ATP eller småmolekylære inhibitorer . Da ATP-binding, kan muligvis øge den strukturelle stivhed af det katalytiske domæne, den lokale frustration analyse, der omfattede strukturer med en fjernet ATP kan producere kunstige ændringer i frustration indekset for bindingssted rester. Vi evaluerede den samlede statistiske fordeling af den konfigurationsmæssig frustration indekset ved hjælp krystalstrukturer med bundne molekyler. Virkningen viste sig at være temmelig ubetydelige, og det resulterende fordeling var næsten ikke skelnes fra den, der vises i figur 1. Faktisk en betydelig del af de involverede i binding site-interaktioner protein kinase rester hører til strukturelt stive hængselregion der er en minimalt frustreret element af den katalytiske kerne og som sådan robust over for mindre forstyrrelser af interaktioner. Vi fandt imidlertid nogle interessante små variationer i den lokale frustration profiler af ABL (figur S1) og EGFR kinaser (Figur S2), som blev observeret for onkogene mutationer i glycin-rige P-loop (ABL-G250E, ABL-Q252H, ABL-E255K, EGFR-G719S, EGFR-G719A, EGFR-G719C). Det er kendt, at P-loop i ABL-kinase kan stabiliseres i Imatinib-bundne inaktiv struktur, hvilket kan forklare den forøgede lokale frustration ved P-loop mutationer i den inaktive tilstand (figurer S1, S2). Interessant er disse punktmutationer kendt for at svække bindingen af ​​Imatinib (Gleevec) til ABL ved at flytte den termodynamiske ligevægt mod aktive form uforenelig med inhibitoren bindende [114] – [116]. Vores data antydede, at mutation-induceret lokal frustration i inhibitor-bundne inaktiv kinase tilstand dels kan bidrage til at indlede en befolkning skift mellem funktionelle former. Vi analyserede også fordelingen og strukturel deling af minimalt frustrerede og lokalt frustrerede regioner i ABL-kinase (Figur S3). Et tæt net af minimalt frustrerede rester blev fundet i den strukturelt stive kerne af det katalytiske domæne (forbundet ved grønne linjer). Dette minimalt frustreret web blev dannet af strukturelt bevaret αF-helix og αE-helix. I modsætning hertil klynger af lokalt frustrerede rester (forbundet af røde linjer) samles på proteinet periferi, herunder aC-helix, aktivering loop, P + 1 loop i den C-terminale lap. Da autoinhibiting interaktioner frigivet i aktiv form, kan proteinkinaser blive mere fleksibel med en betydelig grad af residual lokale frustration. Dette blev afspejlet i den øgede tilstedeværelse af lokalt frustrerede rester forbundet med røde linjer i aC-helix, og C-terminale lap af den aktive ABL (figur S3B).

Resten-baserede frustration indeksværdier er vist for et sæt af onkogene ABL-kinase-mutanter i den inaktive (a) og aktive former (B). De frustration indeksværdier er vist i udfyldte gule søjler for vildtypekinasen blanketten og i røde fyldte barer for de mutante former. Analysen blev udført på den ubundne form af krystal strukturer i ABL i den inaktive form (FBF ID 1IEP) [90] og aktiv form (FBF ID 1M52) [91], [92].

Resten-baserede frustration indeksværdier er vist for et sæt onkogene EGFR kinase mutanter i den inaktive (a) og aktive former (B). De frustration indeksværdier er vist i udfyldte gule søjler for vildtypekinasen blanketten og i røde fyldte barer for de mutante former. Analysen blev udført på den ubundne form af krystal strukturer i EGFR i den inaktive form (FBF ID 1XKK) [117] og aktiv form (FBF ID 2J6M) [118].

Lokal Frustration og protein fleksibilitet

Vi undersøgte også en sammenhæng mellem lokal frustration og protein fleksibilitet kinase strukturer. I vores tidligere undersøgelser har vi karakteriseret de konformationelle landskaber i ABL, EGFR, RET og Met kinaser samt forskellige cancer mutanter under anvendelse MD simuleringer af Apo-kinase og komplekser med ATP og småmolekylære inhibitorer [132], [134], [ ,,,0],136]. Her har vi sammenlignet resultaterne af lokale frustration analyse med kinase fleksibilitet profiler, som blev udledt fra MD simuleringer og evalueret ved hjælp af geometriske middelværdi udsving (RMSF) af de katalytiske domæne rester. Især MD studier af ABL og EGFR kinaser i de normale og onkogene tilstande vises en høj lokal fleksibilitet i den nedre del af aktiveringen sløjfe [134], [136]. Tilsvarende bundtet af a-helixer i den C-terminal, som repræsenterede den tætteste klynge af minimalt frustrerede rester (fig S4, S5), også vist den mindste variation i RMSF værdier – en egenskab af strukturelt stive protein kerne [134] . De lokale frustration profiler også matchet op pænt med B-faktorer af protein kinase rester. Et eksempel på sådan sammenlignende analyse var detaljerede for EGFR-WT i den aktive form (figur S5). En robust korrelation blev fundet mellem resten-baserede lokale frustration indeks og B-faktor værdier (Figur S5 D). Vi bemærkede også, at de meget frustrerede EGFR rester svarede til konformt mobile regioner med de højere B-faktor værdier. For yderligere at illustrere disse resultater, vi udførte strukturelle kortlægning af de gennemsnitlige B-faktorer på et sæt af inaktive (figur S5 A) og aktive strukturer (figur S5 B) af ABL, EGFR, BTK, KIT, BRAF, MET, og RET kinaser . Derudover lokalt frustrerede rester blev også afbildet på den katalytiske kerne. De lokalt frustrerede steder svarede til protein regioner med den øgede termiske mobilitet og overlappede med proteinrester af højere B-faktorer.

Analysen af ​​protein kinase fleksibilitet har også vist, at konformationsændringer i funktionelt vigtige kinase regioner kan være allosterisk koblet og meget korreleret. Mere specifikt fandt vi tegn på stærkt korrelerede protein bevægelser og allosterisk kobling af aC-helix og aktivering loop med alle andre kinase regioner (tabel S3 i File S1). Interessant nok aC-helix og aktiveringssløjfen repræsenterede to mest koblede protein kinase regioner. Andre stærkt korrelerede segmenter af det katalytiske domæne omfattede (a) hængselregionen og katalytisk løkke, og (b) P-loop og aktivering sløjfe. Disse resultater er i overensstemmelse med vores seneste analyse af kollektive bevægelser i ABL og EGFR regulatoriske komplekser, manifesteret i “vejrtrækning” stive kroppens bevægelser af den katalytiske kerne kombineret med udsving i P-loop, aktivering loop, aC-helix og αG-helix af C-terminale [136]. Talrige strukturelle biologiske undersøgelser har også vist en central inddragelse af aC-helix og aktivering loop i allosterisk kobling, der styrer reguleringen af ​​protein kinase aktivitet [110] -. [113]

Allosterisk Effekt af oncogen mutationer på lokal Frustration

Vi undersøgte hvis rumlige fordeling af lokal frustration kan udgøre initiation point for globale konformationelle ændringer og hvorvidt virkningen af ​​onkogene mutationer på den lokale frustration ville være lokal eller allosterisk. Hvis virkningen af ​​onkogene mutationer var lokale, ville det medføre kun lokale forstyrrelser og resultere i negative værdier af frustration indekset for rester i umiddelbar nærhed af det mutationel site. Men hvis effekten af ​​onkogene mutationer var global, kan den rumlige fordeling af meget frustrerede rester være allosterisk påvirket og resultere i mærkbare ændringer på fjernt fra mutationsmønstre webstedet regioner. En sammenligning af lokalt frustreret rester kortlægning i ABL-WT og ABL-T315I mutant afslørede subtile endnu relevante ændringer, hvor de fleste af de påvirkede rester blev fjernt fra mutationel (figur 5). Vi observerede, at gate-keeper mutation i den inaktive kinase formularen allosterisk kan forstyrre strukturelle stivhed af den katalytiske kerne og øge den lokale frustration af αF-helix, αE-helix, og aC-helix-regioner. Vores resultater blevet bekræftet med en hydrogen-udbytning massespektrometri (HX MS) undersøgelse af ABL-kinase [100], hvilket indikerer, at virkningen af ​​ABL-T315I-mutationen kan resultere ikke bare i lokale konformationelle forstyrrelser nær aC-helix, men også allosterisk ændre protein fleksibilitet i fjernt fra mutation protein regioner. Ændringerne i den lokale frustration induceret af ABL-T315I mutation i den inaktive kinase kunne illustreres i eksemplerne vist i figurerne S6, S7. Mens frustration plot af ABL-WT og ABL-T315I var generelt ens, var der nogle ændringer i de røde linje klynger forbinder Asp-381 i DFG motivet til Glu-286, som yder et vigtigt hydrogenbinding med Lys-271 (figur S6) . En anden ændring kunne noteres i anti-parallel β-ark fra den nedre del af aktiveringen sløjfe (fig S7). I denne region et par af resterne blive meget frustreret efter mutation som tydeligt ved røde linjer forbinder rester Tyr-393, Ala-395 og Pro-402.

Den geografiske fordeling af den lokale frustration i de inaktive former af ABL -WT (A) og ABL-T315I (B). Farven glidende arrangement med lokale frustration spænder fra minimalt frustreret (vist med blåt) til højt frustreret (vist rødt). De vigtigste funktionelle områder af proteinkinasen sammen med den respektive række proteinrester refereres til ved pile. Strukturelle kortlægning af lokal frustration på ABL-kinase-katalytisk kerne er vist for den inaktive ABL-WT struktur (PDB ID 1IEP) [90]. Virkningen af ​​T315I på den inaktive ABL struktur blev evalueret via strukturel modellering i detaljer i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. Det PyMOL programmet blev anvendt til visualisering af protein kinase strukturer og den lokale frustration kortlægning (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrödinger, og LLC).

Det er vigtigt, delvis udfoldning af anti- parallel β-sheet i den lavere ende af aktiveringssløjfen blev tidligere bestemt som en forudsætning for stabilisering af mellemproduktet Src-lignende struktur og en fælles mekanistisk træk ved ABL og EGFR aktivering pathways [134]. I Src-lignende konformation, blev aC-helix roteres og bevæges ud af det aktive sted (aC-helix-Glu-out position), DFG-motivet spejlvendt i det mellemliggende DFG-in position, anti-parallel β-ark fra