PLoS ONE: Curcumin Chemosensitizes 5-fluoruracil Resistant MMR-mangel Humane Colon Cancer Cells i High Density Cultures

abstrakt

Formål

Behandling af kolorektal cancer (CRC) er fortsat en klinisk udfordring, da mere end 15% af patienterne er resistente over for 5-fluoruracil (5-FU) -baseret kemoterapeutisk regimer og tumortilbagevenden satser kan være så høj som 50-60%. Kræft stamceller (CSC) er i stand til at overleve konventionelle kemoterapi, der tillader regenerering af originale tumorer. Derfor undersøgte vi effektiviteten af ​​5-FU og anlæg polyphenol (curcumin) i forbindelse med DNA mismatch repair (MMR) status og CSC aktivitet i 3D kulturer af CRC celler.

Metoder

Høj densitet 3D kulturer af CRC-cellelinjer HCT116, HCT116 + CH3 (suppleret med kromosom 3), og deres tilsvarende isogene 5-FU-kemo-resistente afledte kloner (HCT116R, HCT116 + ch3R) blev behandlet med 5-FU enten uden eller med curcumin i tids- og dosisafhængig assays.

Resultater

Forbehandling med curcumin væsentligt forbedret effekten af ​​5-FU på HCT116R og HCR116 + ch3R celler, i modsætning til 5-FU alene som fremgår af forøget desintegration af colonospheres, forstærkede apoptose og ved at hæmme deres vækst. Curcumin og /eller 5-FU stærkt påvirket MMR-deficiente CRC celler i høje kulturer densitet imidlertid MMR-dygtige CRC-celler var mere følsomme. Disse virkninger af curcumin i styrke kemosensitivitet til 5-FU blev yderligere understøttet af dens evne til effektivt at undertrykke CSC pools som vist ved nedsat antal CSC markør-positive celler, der fremhæver egnethed denne 3D kultur model for vurdering CSC markør ekspression i en tæt

vivo

indstilling.

Konklusion

Vores resultater viser nye og tidligere indregnede effekter af curcumin i styrke chemosensitization til 5-FU-baseret kemoterapi på DNA MMR-mangel og deres kemo resistente kolleger ved at målrette CSC delpopulation. (246 ord i abstrakte)

Citation:. Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, Shayan P, Lueders C, Goel A (2014) Curcumin Chemosensitizes 5-fluorouracil Resistant MMR-mangel Humane Colon Cancer Cells i High density Cultures. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10,1371 /journal.pone.0085397

Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: 25 oktober, 2013; Accepteret: November 27, 2013; Udgivet: 3 jan 2014

Copyright: © 2014 Shakibaei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest hyppige. kræft påvirker mænd og kvinder lige verdensplan [1]. Nuværende terapier til behandling af kolorektal cancer omfatter primært 5-fluorouracil-baserede kemoterapier, der anvendes enkeltvis eller i kombination med oxaliplatin (FOLFOX) eller antiangiogene midler, og /eller anti-epidermal vækstfaktor midler [2]. Selvom tyktarmskræft incidensrater har aftaget noget, er nuværende behandlinger forbundet med betydelige bivirkninger, høj udgift og tilbagefald satser op mod 50%, primært som følge af udviklingen af ​​erhvervet kemoresistens til konventionelle kemoterapeutika [3], [4]. Disse begrænsninger fremhæve bydende nødvendigt og presserende behov for at identificere og udvikle nye og sikker behandling strategier, der kan hjælpe med at overvinde kemoresistens og forbedre tumor celle respons på anti-tumor narkotika.

Carcinogenese menes at være en flertrins proces, der resulterer fra en trinvis akkumulering af genetiske ændringer i forskellige gener (f.eks metastase-associerede gener, oncogener, tumorsuppressorgener), der fører til progressiv omdannelse af raske celler til tumorceller [5], [6]. Det er nu yderligere erkendt, at epigenetiske ændringer såsom afvigende DNA methylering, histon modifikationer, kromosom remodellering og beskadigelse af mismatch repair (MMR) systemet, også markant indflydelse CRC udvikling, [5], [7]. Skader på MMR systemet forårsager genetisk ustabilitet, da det er vigtigt for korrekturlæsning DNA syntese fejl under replikation, hvilket fører til ændrede celle fænotyper, forbedret modtagelighed for neoplastisk transformation og lette udviklingen af ​​kemo-resistente celler [8], [9].

Under tumorigenese og formidling tumor herunder coloncancer, cancerceller kræver selvfornyelse kapacitet, svarende til den, der udvises af stamceller. Det er nu almindeligt accepteret, at kræft patogenese i de fleste tumorer, herunder CRC, er drevet af en delmængde af tumorceller, der udviser stamceller egenskaber svarende til fysiologiske stamceller, herunder selv-fornyelse evner og pluripotens [10], [11], og at disse cancer stamceller (CSC) har potentialet til at invadere og danne fjernmetastaser [12], [13], [14]. I tyktarmen, disse colon CSC aberrerende differentiere generere en hovedparten af ​​tumorceller med større fraktion sammensat af mere differentierede celler og en lille brøkdel af stamceller, som i sidste ende erstatte de sunde colon stamceller og hele colon krypt er koloniseret af stamceller kræft celler og deres afkom [10]. Et sæt af specifikke markører er blevet identificeret for colon CSC, herunder CD133

+, CD 44

+, CD166

+ og ALDH1

+ [15], [16]. Tilbagefald af tumorer efter tilsyneladende vellykket kemoterapi menes at være i kraft af kemo-resistente CSCS der unddrager døden ved kemoterapeutiske stoffer [17]. Derfor nye terapeutiske midler, der med held kan målrette CSCS, er meget sandsynligt den mest lovende terapeutisk strategi i møde denne enorme kliniske udfordring.

Emerging litteratur tyder på, at mange kostkomponenter direkte eller indirekte kan regulere inflammatoriske reaktioner i tarmen ved modulering af intestinale barrierefunktion [18]. Endvidere har flere naturligt forekommende kosten forbindelser blevet vist som anti-cancer terapeutiske midler [19], [20], [21], [22]. Faktisk beviser er ved at opstå, at konventionel kemoterapi i CRC væsentligt fordele gennem multikombinerbare behandlinger med nogle af disse naturligt forekommende kosten polyfenoler [5], [23], [24]. En sådan botaniske, curcumin (diferuloylmethane), en gul krydderi stammer fra jordstængler af

gurkemeje longa

, har en lang tradition som et anti-inflammatorisk middel i den traditionelle indiske ayurvedisk system af medicin. Desuden har flere undersøgelser vist, at curcumin virker som en potent kemo- og strålingssensibiliserende i flere humane cancere [25], [26] og kan inhibere cellevækst af MMR-system deficiente coloncancerceller [27], [28]. I en tidligere undersøgelse påviste vi, at curcumin forbedret kemosensitivitet af 5-FU i kolorektale cancercellelinjer ved målretning af NF-KB, Src og NF-KB-afhængige regulerede genprodukter [5]. Det har endvidere vist, at målretning colon cancerceller med 5-FU og oxaliplatin (FOLFOX) i kombination med curcumin svækket EGF-R, IGF-1R og Akt-signalvejen og markant reduceret kræft stamcellemarkør positive celler og forårsagede opløsningen af ​​colonospheres [ ,,,0],23], [24].

Vi har for nylig vist, at kombineret behandling af curcumin med 5-FU inducerer mere signifikant cytotoksicitet i DNA MMR-deficiente CRC monolagskulturer, sammenlignet med hvert middel individuelt [5]. Følgelig er formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge, om curcumin alene eller i kombination med 5-FU kan påvirke DNA MMR-deficiente colon cancerceller, der er naturligt resistente over for 5-FU i modulering colonosphere dannelse og CSC aktivitet i 3D-kulturer.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Culture

Humane kolon kræftceller (HCT116; MMR-mangel) blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). HCT116 + CH3, er et MMR-dygtige cellelinie, som blev skabt i vort laboratorium ved stabil transfektion af kromosom 3 bærer et vildtype-kopi af

hMLH1

gen, som tidligere beskrevet [29]. Vi genererede også 5-FU-resistente derivater af disse cellelinjer, benævnt HCT116R og HCT116 + ch3R henholdsvis, der blev oprettet ved gentagen behandling af forældrenes cellelinjer til stigende koncentrationer af 5-FU i løbet af en 10-12 måneders periode. Både de parentale og 5-FU resistente cellelinier blev anvendt til at undersøge effekten af ​​enkelte og kombinerede 5-FU og curcumin behandlinger. Cellerne blev holdt i vævskulturkolber i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; 4,5 g /L D-glucose) suppleret med 10% FBS og 1% antibiotisk /antimykotisk i en fugtig inkubator ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. Mediet blev skiftet hver tredje dag, og cellerne blev passeret under anvendelse af trypsin /EDTA.

Antistoffer Salg

Monoklonale antistoffer mod ALDH1 blev indkøbt fra Acris Antistoffer GmbH (Herold, Tyskland). Monoklonale antistoffer mod CD133 og CD44 blev indkøbt fra Abcam PLC (Cambridge, UK). Antistoffer til p-actin (A5316) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoklonalt anti-PARP [poly (ADP-ribose) polymerase] (7D3-6) antistof blev indkøbt fra Becton Dickinson (Heidelberg, Tyskland). Alkalisk phosphatase koblet fåre-antimuse og fåre-anti-kanin-sekundære antistoffer til immunoblotting blev indkøbt fra Millipore (Schwalbach, Tyskland). Alle antistoffer blev anvendt ved koncentrationer og fortyndinger anbefalet af producenten.

vækstmedier, Kemikalier og Cytokiner

vækstmedium (Ham F-12 /Dulbeccos modificerede Eagles medium (50:50) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 25 ug /ml ascorbinsyre, 50 IE /ml streptomycin, 50 IE /ml penicillin, 2,5 ug /ml amphotericin B, essentielle aminosyrer og L-glutamin) blev opnået fra Seromed (München, Tyskland). Trypsin /EDTA (EF 3.4.21.4) blev indkøbt fra Biochrom (Berlin, Tyskland). Epon blev opnået fra Plano (Marburg, Tyskland). 5-FU blev indkøbt fra Sigma (München, Tyskland). Curcumin (BCM-95) var en generøs gave fra Dolcas Biotech (Landing, NJ, USA). Curcumin blev fremstillet ved at opløse det i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration af stamopløsning på 5000 uM og opbevaret ved -20 ° C. Seriefortyndinger blev fremstillet i dyrkningsmedium.

A 100 mM stamopløsning af 5-FU blev fremstillet i absolut DMSO og opbevaret ved -20 ° C. Koncentrationen af ​​DMSO var mindre end 1% af lægemiddelbehandling. Til behandling blev 5-FU fortyndet i DMEM og tilsat til kulturer til opnåelse af den ønskede slutkoncentration. Efter 70-80% konfluens, blev cellerne behandlet med 5-FU eller curcumin enkeltvis, eller deres kombination.

Cell Levedygtighed Assay

cellelevedygtigheden blev vurderet ved 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) -optagelse fremgangsmåde som beskrevet tidligere [30]. Kort fortalt, HCT116, HCT116 + CH3-celler og 5-FU kemoresistente cellelinier blev podet i en 96-brønds plade (1000 pr brønd) og udsat for forskellige koncentrationer af individuelle 5-FU eller curcumin i tre eksemplarer til de indikerede tidsperioder til opnåelse af IC

50 værdier (50% cellevækstinhiberende koncentrationer). Derudover er der i et andet sæt eksperimenter blev celler forbehandlet med 5 pM curcumin i 12 timer og derefter co-behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 uM) i 24 timer til opnåelse af optimale dosis til kombinationsbehandling. Celler blev vasket to gange med PBS og efterfølgende blev MTT-opløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Lysis buffer (20% SDS og 50% dimethylformamid) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet natten over ved 37 ° C. Absorbansen af ​​cellesuspensionen blev målt ved 570 nm (OD570) ved anvendelse Revelation 96-brønds MultiScanner pladelæser (Bio-Rad Laboratories Inc. München, Tyskland). De opnåede data blev beregnet og var repræsenteret i procent af overlevelse i forhold til kontrol. Dette eksperiment blev gentaget 3 gange uafhængigt, og statistisk analyse blev udført for at opnå de endelige værdier.

Dannelse og Inhibering af Colonosphere Kolonier

I tumor colonosphere dannelse assay, 10 pi dråbe, ca. 2 millioner celler, blev HCT116, HCT116 + CH3, og deres respektive 5-FU kemoresistente afledte cellelinjer udpladet på en cellulose filter på toppen af ​​en stålnet bro [31]. Celledyrkningsmedium nået filtermediet interface og cellerne blev næret ved diffusion. Denne model gør det muligt for cellerne at aggregere, og udgør en særskilt pellet, som blev undersøgt efter 1-10 dage. Den HCT116, HCT116 + CH3, og deres respektive 5-FU kemoresistente cellelinjer blev behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) eller deres kombination (curcumin 5 uM og 5-FU 0,1 uM) i 1, 3, 7 og 10 dage. Anvendt koncentrationer blev beregnet og repræsenteret som procent overlevelse i forhold til ubehandlede kontroller. IC

50 blev defineret som lægemiddelkoncentrationen kræves for at inhibere HCT116, HCT116R eller HCT116 + CH3 og HCT116 + ch3R med 50% i forhold til kontroller. IC

50 værdier blev estimeret ud fra dosisresponskurven. Data blev afledt af mindst tre uafhængige forsøg. Colonosphere-dannelse blev vurderet ved lysmikroskopi, DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, Sigma) og elektronmikroskopi.

Transmission Electron Microscopy (TEM)

Elektronmikroskopi blev udført som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt, høj densitet cellekulturer behandlet som beskrevet ovenfor, blev fikseret i 1 time i Karnovsky fiksativ efterfulgt af post-fiksering i 1% OSO

4-opløsning. Efter dehydrering i en stigende alkohol-serien, blev kulturer indlejret i Epon og skære ultratynde med en Reichert-Jung Ultracut E (Darmstadt, Tyskland). Snit blev kontrasteret med en blanding af 2% uranylacetat /blycitrat og undersøgt med et transmissionselektronmikroskop (TEM 10, Zeiss, Institut for farmakologi Berlin, Tyskland).

Kvantificering af mitokondrie Changes (MC) og Apoptotisk celledød

Ultratynde snit af prøverne blev fremstillet og evalueret med et elektronmikroskop (TEM 10; Zeiss, Institut for farmakologi Berlin, Tyskland). At kvantificere MC og apoptotiske celler, blev antallet af celler med morfologiske træk ved apoptotisk celledød bestemt ved lave 100 celler fra 25 forskellige mikroskopiske felter.

DAPI farvning for apoptotiske celler

chromatinkondensering og apoptotiske celler blev undersøgt ved nuklear farvning med DAPI (4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindol, Sigma) som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt blev de høje kulturer densitet nedsænket i O.C.T. indlejringsmedium og straks frosset i flydende nitrogen. Otte til ti um tykke snit blev skåret. Snit blev fikseret med methanol i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Efterfølgende blev kulturerne vasket to gange med PBS, og derefter 1 pi DAPI-opløsning (5 mg /ml) i fem ml PBS blev fordelt på kulturerne efterfulgt af inkubation i 20 minutter i mørke. Mærkede celler blev vasket gentagne gange med PBS for at fjerne det overskydende DAPI-farvet, dækket med fluoromount mountant og vurderet under et fluorescensmikroskop (Leica, Tyskland). Eksperimenter og analyser blev udført tre gange.

Western blot-analyse

For at bestemme virkningen af ​​curcumin, 5-FU eller curcumin /5-FU på spaltning af PARP og ekspressionen af ​​cancer stamceller (CSC) markører, blev hele cellelysater fremstillet og fraktioneret ved SDS-PAGE [33]. Kort fortalt blev cellerne skyllet i PBS, og proteinerne blev ekstraheret med lysispuffer (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1% (volumen /volumen) Triton X-100, 1 mM natriumorthovanadat, 50 mM natriumpyrophosphat, 100 mM natriumfluorid, 0,01% (v /v) aprotinin, pepstatin A (4 ug /ml), leupeptin (10 pg /ml), og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) i 30 minutter på is. Efter justering af totale proteinkoncentration, lige mængder (500 ug protein pr bane) af totale proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (7,5% eller 12% geler) under reducerende betingelser. Separerede proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner og inkuberet i blokeringsbuffer (5% (vægt /volumen) skummetmælkspulver i PBS, 0,1% Tween 20) i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev inkuberet natten over med det primære antistof fortyndet med blokerende buffer ved 4 ° C på et rysteapparat, vasket 3 gange med blokerende buffer, og derefter inkuberet med det sekundære antistof konjugeret med alkalisk phosphatase i 90 minutter ved stuetemperatur. Membraner blev vasket 3 gange i 0,1 M Tris (pH 9,5) indeholdende 0,05 M MgCl

2 og 0,1 M NaCl. Endelig blev detekteret specifikke antigen-antistof-komplekser under anvendelse af nitroblue tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3-indoylphosphate (

s

toluidin salt, Pierce, Rockford, IL, USA) som substrater for alkalisk phosphatase.

Statistisk Analyse

Numeriske data er udtrykt som middelværdierne (+/- SD) for et repræsentativt eksperiment udført tre gange. Midlerne blev sammenlignet ved anvendelse Students

t

test antager ens varianser. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant, hvis

s Drømmeholdet værdi var mindre end 0,05.

Resultater

Menneskelig MMR-mangel og -proficient CRC celler (HCT116, HCT116 + CH3 ) og deres respektive 5-FU kemoresistente afledte cellelinier (HCT116R, HCT116 + ch3R) blev anvendt i vores undersøgelse for at undersøge virkningen af ​​curcumin eller /og 5-FU på cellelevedygtighed, apoptose og cancer stamceller (CSC) i kulturer med høj tæthed.

MMR- mangelfuld CRC Celler og deres respektive 5-FU resistente celler er følsomme over for curcumin

De cytotoksiske virkninger af 5-FU eller curcumin på fire tyktarmskræft cellelinjer blev bestemt anvendelse af MTT-assayet. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) eller curcumin (0, 1, 5, 10 og 20 uM) og cellelevedygtighed blev undersøgt ved MTT-assayet (fig. 1A 1B). Vi observerede, at 5-FU blokerede udbredelsen af ​​cellelinjer HCT116, HCT116 + CH3 i en dosisafhængig måde med en IC

50 værdi på 5 uM, mens deres respektive 5-FU-resistente derivater ikke havde nogen reaktion til 5-FU-behandling (fig. 1A). HCT116 + CH3-celler og de tilsvarende 5-FU kemoresistente cellelinjer var lige følsomme over for curcumin (IC

50 5 uM), hvorimod DNA MMR-defekte cellelinier HCT116 og HCT116R celler var mindre følsomme over for curcumin i forhold til DNA MMR-dygtige cellelinjer HCT116 + CH3 og HCT116 + ch3R (IC

50 20 uM;. figur 1B). Disse resultater antyder, at genoprettelsen af ​​hMLH1 aktivitet i HCT116 cellelinien, ved indføring af kromosom 3, var forbundet med en øget følsomhed over for 5-FU.

HCT116, HCT116 + CH3, HCT116R og HCT116 + ch3R celle linjer blev behandlet med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) alene (A) i 24 timer, forskellige koncentrationer af curcumin (0, 1, 5, 10 og 20 uM) alene (B) i 24 timer, eller blev forbehandlet med curcumin 5 uM i 4 timer og derefter udsat for forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 4) i 24 timer (C). Cellelevedygtighed blev målt med MTT metoden og IC

50 bestemt ved 50% vækstinhibering. Resultaterne er angivet som middelværdier med standardafvigelser fra mindst tre uafhængige forsøg. Værdier blev sammenlignet med kontrollen og statistisk signifikante værdier med p 0,05. Væsentlige værdier er markeret med (*).

For at evaluere celle følsomhed over for kombinationen af ​​curcumin og 5-FU behandling, vi forbehandlet HCT116, HCT116 + CH3 og de respektive 5-FU kemo-resistente celler først med 5 pM curcumin efterfulgt af behandling med forskellige koncentrationer af 5-FU (0, 0,1, 1, 2 og 4 uM) i 24 timer (fig. 1C). MTT-assays blev udført, og IC

50 værdier blev bestemt. Resultaterne viser, at curcumin væsentligt forbedret cytotoksicitet af 5-FU til begge cellelinier (HCT116 og HCT116 + CH3) ved ca. 0,1 uM 5-FU (fig. 1C). Interessant, forbehandling med 5 uM curcumin reducerede IC

50 værdier for 5-FU til 2 uM i 5-FU resistente HCT116R og HCT116 + ch3R cellelinjer (p 0,05;. Figur 1C). Disse resultater antyder, at DNA MMR-manglende HCT116R og DNA MMR-dygtige HCT116 + ch3R celler forbehandlet med curcumin var mere følsomme over for 5-FU end celler behandlet med 5-FU alene og indførelsen af ​​kromosom 3 i HCT116-celler viste en øget følsomhed cellerne til behandling med 5-FU og /eller curcumin i forhold til de HCT116 celler.

curcumin og /eller 5-FU Undertryk Colonosphere vækst af MMR-deficiente CRC celler og deres respektive 5-FU-resistente celler i High density Cultures

for at vurdere virkningerne af 5-FU og /eller curcumin enten alene eller i kombination på størrelsen af ​​colonospheres, en fremtrædende del af cancer stamceller [34], tredimensionale high-density kulturer [31] af HCT116 og de tilsvarende kemoresistente cellelinier blev udført (fig. 2A-C).

kulturer høj tæthed af HCT116 (A) eller HCT116R (B) celler blev enten efterladt ubehandlede eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 1, 3, 7, og 10 dage, og billeder af de indfødte kulturer taget. Billeder er repræsentative for tre individuelle eksperimenter. Colonosphere størrelse blev målt, og præsenterede resultater er middelværdier med standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. C: densitet kulturer af HCT116, HCT116 + CH3, og deres respektive 5-FU-resistente overfor kemoterapi celler streng var enten ubehandlet eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 10 dage blev colonosphere størrelse målt og præsenterede resultater er middelværdier med standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. Signifikante værdier er markeret med (*).

I ubehandlede kontrolkulturer, viste resultaterne, at både HCT116 og HCT116R celler dannede sfæroide kolonier, med en tidsafhængig stigning i størrelsen af ​​colonospheres under 10 dages periode (fig. 2A, 2B). Behandling af HCT116 kulturer med 5-FU alene, i modsætning til deres tilsvarende 5-FU resistent HCT116R cellelinie, dramatisk reduceret størrelse colonospheres sammenlignet med de tilsvarende kontroller (Fig. 2A, 2B). Som forventet, behandling af 5-FU-resistente celler med 5-FU individuelt ikke havde en negativ effekt på colonosphere størrelse (Fig. 2B). I modsætning hertil i kulturer behandlet med curcumin alene og /eller 5-FU, den colonosphere størrelse blev signifikant reduceret sammenlignet med de tilsvarende kontroller (Fig. 2A, 2B, 2C). Behandlingen med curcumin alene eller kombinationsbehandlingen blev vist at være yderst effektiv til inhibering kuglen danner evne af alle fire CRC cellelinier. Størrelserne af colonospheres i med curcumin behandlede grupper var signifikant mindre i forhold til kontrolgrupperne, hvilket indikerer, at a) curcumin i sig selv supressed colonosphere størrelse i DNA MMR deficiente HCT 116 celler, og b) curcumin sensibiliseret HCT116R og HCT116 + ch3R celler til 5- FU-induceret cytotoksicitet (fig. 2A, 2B, 2C). Ved slutningen af ​​forsøgsperioden (10 dage), kan det konstateres, at medens kontrolcellerne dannet veludviklede colonospheres, 5-FU-resistente CRC celler udsat for curcumin alene eller i kombination behandling viste betydeligt mindre klumpformet dannelse (fig. 2C). Taget sammen indikerer disse resultater, at colonoshere størrelse blev markant reduceret i høj tæthed kulturer behandlet enten med curcumin alene eller en kombination af curcumin og 5-FU, hvilket indikerer en colonosphere inhiberende virkning af curcumin og /eller 5-FUon HCT116, HCT116 + CH3, og deres respektive 5-FU-resistente derivater.

Curcumin og /eller 5-FU Forøg cytotoksicitet Colonospheres af MMR-mangelfulde CRC Celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density Cultures

for at undersøge hvorvidt colonosphere dannelsen-inhiberende virkning af curcumin og 5-FU i HCT116, HCT116 + CH3, er HCT116R og HCT116 + ch3R cellelinier relateret til induktion af apoptose, blev behandlede celler vurderet ved anvendelse DAPI-farvning, som viste, at apoptotiske legemer indeholdende nukleare fragmenter og chromatinkondensering blev dannet i den apoptotiske pulje af celler (fig. 3A, 3B). Faktisk inkubation af HCT116 og HCT116R celler i serum-udsultet medium resulterede i dannelsen af ​​colonosphere i en periode på 10 dage. Inkubation af HCT116 og HCT116R celler med 5-FU, curcumin eller curcumin sammen med 5-FU i 10 dage resulterede i en markant nedbrydning af colonosphere (r) sammenlignet med deres tilsvarende kontroller (fig. 3A, 3B). Højeste desintegration blev observeret som respons på kombinationen af ​​curcumin og 5-FU i HCT116 + CH3 og HCT116 + ch3R cellelinier (fig. 3A, 3B).

kulturer høj tæthed af HCT116, HCT116 + CH3 (A ), eller HCT116R og HCT116 + ch3R (B) var enten ubehandlede eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 1, 3, 7, og 10 dage, og farvet med Hoechst 33258 (DAPI) at afsløre apoptotiske ændringer af cellekerner. Billeder er repræsentative for tre individuelle eksperimenter.

Curcumin Forhøjer 5-FU-medieret apoptose af MMR-mangelfulde CRC Celler og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density Cultures

Til undersøge, om vækst-inhibitoriske virkning af curcumin og 5-FU i colonosphere dannelse i tredimensionale høj densitet kulturer er relateret til induktion af apoptose, blev ultrastrukturelle evalueringer udført (figur 4 . 5) i HCT116, HCT116 + CH3 , HCT116R og HCT116 + ch3R celler behandlet med 5-FU (5 uM) og curcumin (20 uM) alene, eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM) i 1, 3, 7 og 10 dage. I kontrolkulturer, HCT116, HCT116 + CH3, og deres 5-FU-resistente counterpart cellelinier udviste store afrundede levedygtige celler (indeholdende særskilt fordeling af endoplasmatisk reticulum, mitokondrier og andre cellulære organeller) og disse celler fremstillet intim celle-til-celle-kontakt ( fig. 4A, 5A). Behandling af HCT116 celler med 5-FU eller curcumin alene, medførte degeneration af celleorganeller, mitokondriel opsvulmen og udseende af flere vakuoler, med fremtrædende tegn på apoptose, især i curcumin-behandlede høj densitet kulturer rundt dag 10 (fig. 4A-B). Disse omfattede områder af kondenserede heterokromatin inden kernerne, og multiple autophagocytic cytoplasmatiske vakuoler. Lignende observationer blev gjort for HCT116 + CH3-celler (data ikke vist). I modsætning hertil kunne sådanne virkninger ikke observeres i 5-FU eller curcumin behandlet HCT116R (fig. 5A-B) eller HCT116 + ch3R celler (data ikke vist). Men en kombinatorisk behandling af 5-FU og curcumin over 10 dage markant forbedret degeneration af alle tumorceller. blev påvist markeret degenerative ændringer og apoptotiske celler omkring dag 3 i HCT116 (fig. 4A-B) og HCT116R celler (fig. 5A-B), som allerede var synlig omkring dag 1 i HCT116 + CH3-celler (fig. 4A-B) og HCT116 + ch3R celler (fig. 5A-B). Kvantificering og statistisk analyse af ultrastrukturelle data fremhæver de fremtrædende virkninger af kombineret 5-FU og curcumin behandling på inducere og fremme mitokondrielle forandringer (MC) og apoptotiske effekter i HCT116-celler (fig. 4B) og HCT116R celler (Fig. 5B).

A: Høje kulturer tæthed af HCT116 og HCT116 + CH3 blev enten efterladt ubehandlede eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 1, 3, 7, og 10 dage, og evalueres ultrastrukturelt med en transmission elektron mikroskop. På det tidligste tidspunkt, hvor apoptose (pile) først blev opdaget, er billederne fremhævet i røde kasser. Mikrografer viste er repræsentative for tre individuelle eksperimenter. Forstørrelse: X5000, bar = 1 um. B: Mitochondriale ændringer (MC) og apoptose blev kvantificeret ved at tælle 100 celler med morfologiske træk ved apoptotisk celledød fra 25 forskellige mikroskopiske felter og præsenterede resultater er middelværdier med standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. Væsentlige værdier er markeret med (*)

A:. High density kulturer af HCT116R og HCT116 + ch3R var enten venstre ubehandlet eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM) eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 1, 3, 7, og 10 dage, og evalueres ultrastrukturelt med et elektronmikroskop. På det tidligste tidspunkt, hvor apoptose (pile) blev først opdaget billeder er fremhævet i røde kasser. Mikrografer viste er repræsentative for tre individuelle eksperimenter. Forstørrelse: X5000, bar = 1 um. B: Mitochondriale ændringer (MC) og apoptose blev kvantificeret ved at tælle 100 celler med morfologiske træk ved apoptotisk celledød fra 25 forskellige mikroskopiske felter og præsenterede resultater er middelværdier med standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. Væsentlige værdier er markeret med (*).

Curcumin forstærker antitumorvirkningen af ​​5-FU via apoptose Pathway i HCT116, HCT116 + CH3-Cells og deres respektive 5-FU resistente celler i High Density Cultures

Siden ultrastrukturel evaluering med elektronmikroskopi resultaterne viste, at 5-FU +/- curcumin-induceret apoptose (fig. 4-5), og PARP synes at være involveret i induktionen af ​​apoptose i tumorceller [35], således det undersøgt om curcumin potenserer PARP-spaltning ind med 5-FU-behandlede HCT116, HCT116 + CH3 og deres tilsvarende 5-FU-resistente modstykker. Som vist i fig. 6, immunoblot analyse viste, at spaltningen af ​​PARP blev forbedret, når cellerne blev eksponeret for curcumin (20 mM) eller 5-FU (5 mM) alene, eller i kombinationen af ​​curcumin og 5-FU (0,1 /5 uM) . Disse virkninger var mere udtalt i kombinationsbehandling med curcumin og 5-FU, end i enkelte behandlinger (fig. 6).

densitet kulturer af HCT116 og HCT116 + CH3 (venstre Lanel) Højt og HCT116R og HCT116 + ch3R (højre panel) celler blev enten efterladt ubehandlede eller blev behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (20 uM), eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM). Kulturer blev evalueret efter 3 dage og hele cellelysater fremstillet og analyseret ved Western blotting for spaltning af PARP. Western blots viste er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Husholdning protein β-actin tjente som en positiv læsning kontrol i alle forsøg.

Curcumin har Potent Chemosensitization Effekt på Colon Cancer Stamceller i MMR-mangel og -proficient CRC Celler i High Density Cultures

for at demonstrere chemosensitization effekt af curcumin på kolon CSC markører CD133, CD44 og ALDH1 udtryk i høje kulturer densitet, western blotting analyse blev udført (fig. 7). Høj densitet kulturer af HCT116, HCT116 + CH3 og deres tilsvarende 5-FU-resistente kolleger blev enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 uM) eller curcumin (20 uM) alene, eller 5-FU /curcumin i kombination (0,1 /5 uM) i 12 timer.