PLoS ONE: Novel MUC1 aptamer selektivt Leverer cytotoksisk middel til kræftceller i Vitro

Abstrakt

Kemoterapi er en primær behandling for kræft, men dens effektivitet er ofte begrænset af de negative virkninger af cytostatika. Målrettet lægemiddeltilførsel kan reducere den ikke-specifikke toksicitet kemoterapi ved selektivt at dirigere anticancerlægemidler til tumorceller. MUC1 protein er et attraktivt mål for tumorspecifik lægemiddelafgivelse ejer til dets overekspression i de fleste adenocarcinomer. I denne undersøgelse er en hidtil ukendt MUC1 aptamer udnyttes som den målsøgende ligand til udførelse doxorubicin (Dox) til cancerceller. Vi udviklede en 86-base-DNA-aptamer (MA3), der er bundet til et peptid epitop af MUC1 med en

K

d på 38,3 nM og minimal krydsreaktivitet til albumin. Brug af A549 lungekræft og MCF-7-brystcancerceller som MUC1-udtrykkende modeller blev MA3 vist sig fortrinsvis at binde til MUC1-positive, men ikke MUC1-negative celler. En aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) blev formuleret af interkalerende doxorubicin i DNA struktur MA3. Apt-Dox blev fundet stand til at bære doxorubicin til MUC1-positive tumorceller, mens væsentligt reducere indtaget lægemiddel ved MUC1-negative celler. Desuden Apt-Dox bibeholdt effektiviteten af ​​doxorubicin mod MUC1-positive tumorceller, men sænkede toksicitet over for MUC1-negative celler (P 0,01). Resultaterne tyder på, at MUC1 aptamer kan have potentiel anvendelighed som en målsøgende ligand til selektiv afgivelse af cytotoksiske middel til MUC1-udtrykkende tumorer

Henvisning:. Hu Y, Duan J, Zhan Q, Wang F, Lu X, Yang XD (2012) Novel MUC1 aptamer selektivt Leverer cytotoksisk middel til Cancer celler in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10,1371 /journal.pone.0031970

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: September 15, 2011; Accepteret: 19 januar 2012; Publiceret: 22 feb 2012

Copyright: © 2012 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) og Natural Science Foundation of China (81.071.870)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kemoterapi er en vigtig behandling for kræft, især for sene metastatisk sygdom. Imidlertid er effektiviteten af ​​kemoterapi ofte begrænset af de negative virkninger af cytotoksiske midler, som anvendes i de fleste terapeutiske regimer. Et stort problem forbundet med cytotoksiske lægemidler er, at de forårsager skader på både cancerceller og normale væv, genererer alvorlige bivirkninger, der ofte begrænser intensiteten og varigheden af ​​kemoterapi. Det er derfor ofte vanskeligt for cytotoksiske lægemidler for at fjerne alle kræftceller i kroppen, hvilket resulterer i behandlingssvigt og dårlig prognose. Sådanne svigt understreger behovet for at udvikle mere og mere potent behandling med reduceret toksicitet. En metode til at nå målet er målrettet cancerterapi, hvori anticancerlægemidler selektivt leveres til cancerceller, således at cytotoksicitet over tumor forstærkes, mens de negative virkninger reduceres. Målrettet kræftbehandling lover at forbedre anticancer effekt. Det er blevet rapporteret, at aptamer-guidede bærere indeholder paclitaxel markant kan forbedre effekten mod prostatakræft i dyremodeller [1]. Monoklonale antistoffer er også blevet kovalent bundet til lægemidler til målrettet cancerterapi [2]. En undersøgelse af trastuzumab emtansine (T-DM1), et konjugat af det humaniserede anti-HER2-antistof og et kemisk stof, er i fase III kliniske forsøg [3].

En typisk målrettet lægemiddelafgivelsessystem består normalt af et anticancerlægemiddel og et targeting ligand, der specifikt kan bindes til tumormarkører der rigeligt udtrykker i cancerceller [4]. En ideel tumormarkør til målrettet behandling bør være et membranprotein, der overudtrykkes på overfladen af ​​cancerceller, med relativt lav ekspression i normalt væv. MUC1 er en velkarakteriseret store transmembrane glycoprotein, som potentielt kan tjene som mål for anticancerterapi. Dets ekspression er forøget mindst 10 gange i de fleste maligne adenocarcinomer, herunder brystcancer, lungecancer og tyktarmscancer, hvilket gør det til et attraktivt tumormarkør til målrettet terapi [5]. Udover tumormarkør, tumor-targeting ligand er også et vigtigt element til målrettet cancerterapi. En ideel målretningsligand bør have høj bindingsaffinitet for tumoren markering, med god specificitet og lav [6] immunogenicitet. Sidst, roman målrettede midler, herunder aptamerer [7], korte peptider [8] og andre små molekyler [9], er blevet den nye generation målrette molekyler. Aptamerer er enkeltstrengede oligonukleotider, der kan binde til målmolekyler med høj affinitet og specificitet. Sammenligning monoklonale antistoffer, aptamerer besidder karakteristiske fordele som målretningsligand: høj affinitet for binding til de fleste molekyler, begrænset syntese omkostninger, lav-immunogenicitet, og lille størrelse, der gør det muligt at penetrere faste tumorer [10]. På grund af disse fordele, er aptamerer været anvendt som hidtil ukendte målretningsligander i lægemiddeltilførselssystemer mod prostatacancer [11], [12], [13] og leukæmi [14]. For tumormarkør af MUC1, har Ferreira et al udviklet flere aptamerer, der kunne binder til MUC1-positive tumorceller [15]. Det er også blevet vist, at MUC1 aptamerer kunne anvendes til selektivt at levere lysbehandling agent til kræftceller

in vitro

[16].

cytotoksiske lægemidler er de vigtigste komponenter i de fleste kemoterapi for kræft behandling. Det er derfor vigtigt at undersøge, om MUC1 aptamer kan anvendes direkte til selektivt at levere cytotoksisk middel til kræftceller. Hidtil imidlertid ikke en sådan undersøgelse er rapporteret i litteraturen. Her i denne undersøgelse, har vi udviklet en ny MUC1 aptamer, og vurderet sin evne til at levere doxorubicin til kræftceller

in vitro

. Specifikt valgte vi en 86-base-DNA-aptamer (betegnet MA3) mod et peptid epitop af MUC1, og evalueret dets bindingsaffinitet til MUC1-positive og -negative celler. At undersøge bindingsspecificiteten af ​​aptameren, vi også vurderet dets binding til albumin, der er den mest rigelige protein i plasma, og kan ikke-specifikt binder til aptamerer og forstyrre deres målretning funktion. Doxorubicin er et af de mest anvendte anticancerlægemidler, og kan inhibere proliferation af cancerceller gennem interkalerende ind i DNA-struktur i cellekerner. En aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) blev formuleret ved at inkorporere doxorubicin ind i aptamer struktur MA3. Vi rapporterer nu, at Apt-Dox selektivt kan levere doxorubicin til MUC1-positive celler

in vitro

.

Materialer og metoder

Reagenser

Oligonukleotidprimere var syntetiseret af Invitrogen (Shanghai Kina). Peptider af mindst 95% renhed, blev syntetiseret ved SBS Genetech (Beijing Kina). Bovint serumalbumin (BSA) blev købt fra Tbdscience (Tianjin Kina). Monodisperse magnetiske urinstof-formaldehyd-mikrosfærer blev indkøbt fra Baseline Chromtech (Tianjin Kina). Trypsin blev indkøbt fra Amresco (US). Streptavidinovertrukne magnetiske perler blev indkøbt fra Promega (US). 1-ethyl-3- (3-dimethyllaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC) blev indkøbt fra Sigma (USA).

Cellelinjer

human brystcancer (MCF-7), human liver cancer (HepG2), human lungecancer (A549), og humane normale leverceller (L02) blev opnået fra Cell center of Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og en blanding af penicillin /streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Alle forsøg blev udført på celler i den eksponentielle vækstfase.

Immobilisering af mål på magnetiske perler

Målet for aptamer selektion er en 9-AA peptider (peptide1) med rækkefølgen af ​​APDTRPAPG. Konjugeringen af ​​målet til magnetiske perler blev gennemført via tværbinding af -COOH og -NH2. To ug peptide1 blev blandet med 5 × 10∧5 carboxylerede magnetiske perler og inkuberet med 200 pi EDC (40 mM) ved stuetemperatur under forsigtig omrøring i 2 timer. De magnetiske perler blev derefter vasket tre gange med Hanks-puffer og opbevaret ved 4 ° C. Lignende metode blev anvendt til at konjugere perlerne med andre stoffer, herunder BSA og en 29-AA lange peptider med sekvensen af ​​GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).

SELEX bibliotek og primere

En start DNA-bibliotek bestående af 86-mer oligonucleotider med centrale 40-base lang randomiserede sekvenser blev syntetiseret. Sekvensen af ​​biblioteket er 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 ‘, hvor N betegner et randomiseret nukleotid i enten A, G, C eller T. An FITC-mærket 5′-primer (5′-FITC-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3′) og en biotin-mærket 3′-primer (5’-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3 ‘) blev anvendt i PCR til syntese af dobbelt-mærket, dobbeltstrengede DNA-molekyler, som derefter blev blandet med streptavidin-coatede magnetiske perler i 10 min ved stuetemperatur. Efter denaturering i alkaliske betingelser (0,1 M NaOH), blev FITC-konjugeret sense enkeltstrenget DNA (ssDNA) adskilt fra biotin-mærket antisense ssDNA-streng med streptavidin-belagte magnetiske kugler og anvendes til aptamer selektion.

In vitro-selektion af target-bindende aptamerer

procedurerne for udvælgelse var som følger. The ssDNA pool (200 pmol) blev først opvarmet til 95 ° C i 5 minutter og derefter afkølet straks til 0 ° C i bindingspuffer (Hanks buffer) i 15 min før binding til målet. For at reducere baggrunden interferens, 0,1 mg /ml laksesperma-DNA og 1 mg /ml BSA blev tilsat til bindingsbuffer. I den indledende udvælgelsesrunde blev peptide1-overtrukne perler suspenderet i 200 pi bindingsbuffer indeholdende 200 pmol af tilfældig ssDNA. Efter inkubation af blandingen ved 37 ° C i 30 minutter under forsigtig omrystning blev de ubundne oligonucleotider fjernet ved vask fire gange med 500 pi bindingsbuffer. Efterfølgende blev perle-bundne oligonukleotider blandinger amplificeret ved PCR med FITC- eller biotinmærkede primere (25 cykler af 40 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 65 ° C, 40 sekunder ved 72 ° C, efterfulgt af 10 minutter ved 72 ° C, Taq polymerase og dNTP’er blev opnået fra Takara). Den efterfølgende dsDNA fra PCR blev adskilt i ssDNA via ovenfor beskrevne procedure. Den valgte sense ssDNA adskilt fra det biotinylerede antisense-DNA-streng af streptavidin-coatede magnetiske perler blev anvendt til næste runde i SELEX. Efter flere runder af udvælgelse, den valgte ssDNA pool var PCR-amplificeret under anvendelse af ikke-modificerede primere og klones i Escherichia Coli med TA kloning kit til DNA-sekventering.

Flowcytometrianalyse

At overvåge berigelse af aptamer-kandidater efter selektion, blev FITC-mærket ssDNA pool inkuberet med peptide1-belagte magnetiske kugler i 200 pi udvælgelse puffer indeholdende 10% FBS ved 37 ° C i 30 minutter. Perlerne blev vasket to gange med 0,5 ml bindingsbuffer og derefter suspenderet i 0,2 ml bindingsbuffer. Den FITC fluorescens blev bestemt med en FACScalibur cytometer (Accuri C6, US). FITC-mærkede randomiseret ssDNA bibliotek blev anvendt til at generere styresignalet.

Bindingsaffiniteten af ​​aptamerer blev bestemt ved at inkubere peptide1-coatede magnetiske perler med varierende koncentrationer af FITC-mærket aptamer i 200 pi bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Perlerne blev vasket to gange med 0,5 ml bindingsbuffer, opslæmmet i 0,2 ml bindingsbuffer, og underkastet flow-cytometrisk analyse. FITC-mærkede umarkeret ssDNA bibliotek blev anvendt som en negativ kontrol for at bestemme uspecifik binding. Alle forsøg til bindingsassay blev gentaget tre gange. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af target mærket ved aptamerer blev anvendt til beregning af specifik binding ved at subtrahere den gennemsnitlige fluorescensintensitet af ikke-specifik binding fra uselekterede bibliotek DNA [17]. De ligevægtsdissociationskonstanter (

K

d), aptamer-peptide1 interaktion blev opnået ved at tilpasse afhængigheden af ​​fluorescensintensitet af specifik binding af koncentrationen af ​​aptamererne til ligningen Y = Bmax X /(Kd + X).

for at vurdere den specifikke binding af aptamerer at målrette, blev FITC-mærkede aptamer separat inkuberet med peptide1-, peptied2- eller BSA-belagte magnetiske perler. Perlerne blev vasket to gange med 0,5 ml bindingsbuffer, opslæmmet i 0,2 ml bindingsbuffer og analyseret ved flowcytometri. Til vurdering aptamer binding til celler blev celler skrabet kulturen flaske og vasket med Hanks puffer. FITC-mærket aptamer blev inkuberet med 10∧5 af enten MCF-7, A549, HepG2 eller L02 celler i bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Celler blev derefter vasket tre gange med Hanks-puffer og analyseret med flow cytometrey.

Celler og siRNA transfektion

A549-celler blev udpladet i 6-brønds plader ved 1-3 x 10

5cells /godt, dyrket i antibiotiske-fri medier natten over og transficeret med MUC1 siRNA eller kontrol siRNA [18] under anvendelse af lipofectamin 2000 Opti-MEM i reduceret serummedium ifølge producentens anvisninger (Invitrogen Life Technology, Inc.). Efter 72 timer blev cellerne høstet og farvet med FITC-mærket aptamer til flowcytometri assay og cellelysater blev fremstillet til immunoblotanalyse.

Western blot-analyse

Lysater blev fremstillet ud fra subsammenflydende celler. Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Immunoblots blev probet med anti-MUC1 antistof. Immunkomplekserne blev påvist med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og forøget kemiluminescens (ECL).

Påfyldning af aptamer med doxorubicin

Aptamerer blev først opvarmet til 95 ° C i 5 minutter og derefter afkølet straks til 0 ° C i vand i 15 minutter. Aptamererne blev inkuberet i en vandig opløsning af doxorubicin (3 nM) i 1 time i en plade med 96 brønde sort ved forskellige aptamer /DOX molforhold. Fluorescensspektret af doxorubicin blev derefter undersøgt af en Synergy4 analysator (X ex = 488 nm, Aem = 500-700 nm). FITC-mærket Apt-Dox eller Apt-Dox blev inkuberet med A549-celler i bindingsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter. Celler blev derefter vasket tre gange med Hanks buffer og analyseret med flow cytometrey.

Cellulær optagelse af doxorubicin

Den specifikke cellulære optagelse af Apt-Dox af MUC1-positive A549 celle blev undersøgt ved konfokal fluorescens-scanning mikroskopi (Perkin Elmer Ultraview, US) og flowcytometri. HepG2-celle blev anvendt som en MUC1-negativ kontrol. Celler fik lov til at holde sig til et glas dækglas i 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med 1,5 uM af Dox eller aptamer-Dox i 2 timer ved 37 ° C. Efter at være blevet vasket to gange med Hanks-buffer blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd i 10 minutter og analyseret ved konfokal fluorescens scanning mikroskopi.

I flowcytometrianalyse, celler blev skrabet fra kulturen flasken og vasket to gange med Hanks puffer. Cellerne blev inkuberet med 1,5 uM Dox eller aptamer-Dox i 4 timer ved 37 ° C, og vasket to gange med Hanks-puffer. Cellerne blev derefter fikseret med 4% formaldehyd i 10 min og analyseret med flow cytometriy.

MTS celleviabilitetstest

For at vurdere cytotoksicitet Apt-Dox eller Dox mod A549 og HepG2-celler, både cellelinier blev først dyrket i plader med 96 brønde, og derefter co-inkuberet ved 37 ° C med Apt-Dox, Dox, eller aptamer ved koncentration på 3 uM i 4 timer. Cellerne blev vasket med Hanks puffer i to gange, og dyrket i yderligere 48 timer. Bagefter blev MTS-assay (Promega, USA) anvendes til at bestemme cellernes levedygtighed pr standardprotokol skitseret af fremstillingen.

Statistik Salg

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Statistical Analysis System (SAS, version 9.2 ). En-vejs ANOVA med Fishers mindste signifikante forskel (LSD) post hoc sammenligninger på 99% konfidensintervallet blev brugt til statistiske sammenligninger. Alle data præsenteres som en middelværdi med sin standardafvigelse angivet (middelværdi ± SD).

Resultater

aptamer udvælgelse og karakterisering

Det ekstracellulære protein kerne af MUC1 er lavet op af varierende antal en stærkt bevaret tandem gentagelsessekvens sammensat af 20 aminosyrer (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Blandt tandemgentagelse, havde sekvensen APDTRPAPG blevet identificeret som den mest immundominante peptidepitop [20], og blev anvendt som mål for MUC1 aptamer selektion i tidligere forskning [15]. Her i denne undersøgelse har vi også anvendt denne peptider som mål i vores SELEX-fremgangsmåden. Target peptider blev kovalent konjugeret til magnetiske perler ved anvendelse EDC som katalysator. Under hver runde af selektion blev kuglerne inkuberet med FITC-mærket ssDNA pool og berigelse af aptamerer blev overvåget ved flowcytometri. Sammenlignet med den tilfældige DNA fra biblioteket pool, en stigende mængde ssDNA bundet til at målrette-overtrukne magnetiske perler efter hver runde af selektion (fig. 1). Aptamererne blev efterfølgende klonet, og 50 kloner blev analyseret for yderligere karakterisering. Blandt disse kloner, én apatmer betegnet MA3 viste relativt høj binding til målet MUC1 peptider. DNA-sekvensen af ​​aptamer MA3 er 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.

Compared med udgangs tilfældige DNA pool (skraveret histogram), flowcytometri afslørede en stigning i fluorescensintensitet af aptamerer bundet til MUC1 peptid (APDTRPAPG) efter den tredje (den grå kurve) og tilbage (den sorte kurve) selektionsrunder.

Bindingsspecificitet er vigtigt for evaluering af aptamer ydeevne. Da albumin er den mest rigelige protein i blodet, undersøgte vi binding af aptamer MA3 til albumin. Albumin eller MUC1 peptider perler blev inkuberet med FITC-mærket MA3, og analyseret ved flowcytometri. Fravalgt tilfældig DNA fra biblioteket pulje blev anvendt som kontrol. Som beskrevet i figur 2, den MA3 aptamer genereret en signifikant binding til MUC1 peptider (Fig. 2A), men en forholdsvis svag binding til BSA svarende til den, der genereres af tilfældige DNA (fig. 2B). Resultaterne antydede, at, mellem MUC1 peptider og albumin, aptameren MA3 udviste en målsøgende specificitet mod førstnævnte. Til sammenligning blev der udført lignende forsøg for anden MUC1 aptamer, S2.2, som havde den laveste

K

d blandt alle de offentliggjorte MUC1 aptamerer [15], [16]. Resultaterne viste, at selv S2.2 kunne binde til MUC1 peptider (fig. 2C), også det bundet til albumin til en vis grad (fig. 2D). Dataene viste, at sammenlignet med S2.2, MA3 havde en lavere krydsreaktivitet til albumin.

(A) MUC1-peptid perler behandlet med MA3. (B) BSA perler behandlet med MA3. (C) MUC1-peptid perler behandlet med S2.2. (D) BSA perler behandlet med S2.2. De fyldte histogrammer repræsenterer kontrol- fluorescerende signaler genereret af FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pool.

kvantitativt vurdere bindingsaffiniteten af ​​aptameren til MUC1, perler overtrukket med MUC1 peptider blev inkuberet med FITC -mærket MA3 af forskellige koncentrationer (fig. 3A). Brug af ikke-lineær regressionsanalyse blev aptamer sig at have en

K

d af 38,3 nM. For yderligere at vurdere, om aptamer MA3 ville binde til MUC1 struktur, vi også undersøgt dets binding til en 29-AA peptider (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP) indeholdende hele tandem gentagelsessekvens (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS), der består det ekstracellulære MUC1 protein core. De 29-AA peptider blev kovalent konjugeret til magnetiske perler, som blev inkuberet med FITC-mærket MA3 og analyseret ved flowcytometri. FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pulje blev anvendt som kontrol. Som vist i fig. 3B, genereret MA3 et fluorescenssignal, der var signifikant mere potent end tilfældige DNA, hvilket indikerer, at aptamer også kunne binde til en struktur indeholdende hele MUC1 tandem gentagelsessekvens. Da det ekstracellulære domæne af MUC1 protein core primært er lavet af tandemgentagelser, er det muligt, at aptamer MA3 kan genkende MUC1 struktur eksponeret på overfladen af ​​MUC1-udtrykkende tumorceller.

(A) Kvantitativ analyse af affiniteten mellem FITC-mærket MA3 og MUC1 epitop (APDTRPAPG). (B) Flowcytometrianalyse af binding mellem FITC-mærket MA3 og 26-AA MUC1 peptid (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). Den fyldte histogram er kontrol fluorescens baggrund genereres af FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pool.

MA3 aptamer selektivt binder til MUC1-udtrykkende tumorceller

For at vurdere, om aptamer MA3 ville binde til MUC1-udtrykkende cancerceller, blev FITC-mærket MA3 inkuberet med enten MUC1-positive (A549 eller MCF7) [21], [22] eller MUC1-negative (HepG2 eller L02) cellelinier [21], [23]. Cellerne blev senere analyseret ved flowcytometri under anvendelse af celler inkuberet med FITC-mærket tilfældig DNA som kontrol. De flowcytometriske profiler er vist i figur 4. For MUC1-positive cellelinier A549 og MCF7, MA3 behandling genererede fluorescenssignaler, der var signifikant mere potent end den for tilfældig DNA behandling (fig. 4A og B). Men for MUC1-negative cellelinier HepG2 og L02, MA3 behandling resulterede i fluorescenssignaler, der var svarende til den af ​​tilfældig DNA behandling (fig. 4C og D). Resultaterne indikerede, at aptamer MA3 fortrinsvis kunne binde til MUC1-positive cancerceller, og at aptamer kan genkende MUC1 struktur på disse celler.

histogrammer blev genereret efter inkubering FITC-mærket MA3 med A549 (A ), MCF7 (B), HepG2 (C), og L02 (D) celler. De fyldte histogrammer repræsenterer kontrol fluorescens signaler genereret af FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pool.

MUC1 udtryk påvirker bindingen af ​​aptamer til tumorceller

For yderligere at undersøge den binding af aptamer til MUC1-positive tumorceller, blev ekspressionen af ​​MUC1 protein i A549 og HepG2-celler evalueret ved Western blot med anti-MUC1 antistof. Som beskrevet i figur 5A, mens A549 celler udtrykte MUC1 protein i rigelig mængde, gjorde HepG2-celler ikke, hvilket antyder, at A549 var faktisk en MUC1-positiv cellelinie og at HepG2 var en MUC1-negativ cellelinie. Resultaterne er i overensstemmelse med flere offentliggjorte undersøgelser, som i vid udstrækning analyserede ekspression af MUC1 i forskellige cellelinjer og klart identificerede A549 som MUC1-positive og HepG2 som MUC1-negative cellelinje [18], [24].

(A) Western blots af proteinekstrakter fra A549-celler, HepG2-celler, A549-celler behandlet med kontrol siRNA, og A549-celler behandlet med MUC1 siRNA hhv. Actin blev også blottet for at tjene som kontrol. (B og C) Flowcytometri evaluering af apatamer s binding til A549-celler behandlet med MUC1 siRNA (B) eller kontrol siRNA (C). De fyldte histogrammer repræsenterer kontrol fluorescens signaler genereret af FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pool.

For at vurdere indflydelsen af ​​MUC1 udtryk på aptamer s binding til MUC1-positive celler, vi udnyttet MUC1 siRNA der var tidligere blevet vist evne til at slå ned MUC1 ekspression [18]. SiRNA blev transficeret ind i MUC1-positive A549-celler, og blev bekræftet med Western blot, at det ned kunne regulere MUC1 ekspression (fig. 5A). A549-celler blev behandlet med enten MUC1 siRNA eller en kontrol siRNA, inkuberet med FITC-mærket aptamer, og evalueres ved hjælp af flowcytometri. Som vist i figur 5B og C blev aptamer binding til cellerne signifikant reduceret efter nedregulering af MUC1 ekspression (fig. 5B), hvorimod bindingen til celler behandlet med kontrol-siRNA ikke blev påvirket (fig. 5C). Resultaterne antydede, at MUC1 ekspression på målceller påvirket aptamer affinitet til disse celler, og at tabet af MUC1 protein kan reducere aptamer bindende significantl

y

.

Ilægning aptameren med Dox

for at kunne levere Dox til MUC1-positive tumorceller, en aptamer-doxorubicin kompleks (Apt-Dox) blev dannet ved interkalerende doxorubicin i DNA struktur MA3 aptamer. For at vurdere, om Dox faktisk blev indarbejdet i MA3, vi gjort brug af det fænomen, at fluorescens fra Dox ville slukkes efter interkalerende i DNA [25]. Konkret har vi udført bindende undersøgelser mellem MA3 og Dox, og ansat fluorescens spektroskopi til vurdering af fluorescerende signal genereret af doxorubicin. Som vist i figur 6A, blev observeret sekventielle fald i det native fluorescensspektret for Dox når en fast koncentration af Dox blev inkuberet med en stigende molære forhold mellem MA3 aptamer. Når aptamer /DOX molforholdet nåede 0,1, fluorescensspektret for Dox var på det laveste niveau og ikke ændre yderligere, hvilket indikerer, at de fleste dox havde inkorporeret i DNA-struktur af MA3 på dette aptamer /DOX-forhold.

(A) Fluorescence spektre af doxorubicin-opløsning blandet med stigende molære forhold af MA3 aptamer (fra top til bund: 0, 0,001, 0,003, 0,005, 0,01, 0,03, 0,1, og 1). (B) A549-celler behandlet med FITC-mærket MA3 aptamer. (C) A549-celler behandlet med FITC-mærket Apt-Dox. De fyldte histogrammer repræsenterer kontrol fluorescens signaler genereret af FITC-mærket tilfældige DNA fra biblioteket pool.

For at undersøge, om interkalering af doxorubicin i aptamer ville forstyrre aptamer affinitet til MUC1-positive tumorceller kan bindingen af ​​Apt-Dox komplekset til A549-celler blev evalueret med flowcytometri, og sammenlignet med den for MUC1 aptamer alene. Som vist i figur 6B og C, Apt-Dox-kompleks (fig. 6C) havde en affinitet til A549-celler, der var magen til MUC1 aptamer alene (fig. 6B). Resultaterne antydede, at indføjelse af doxorubicin i MUC1 aptamer ikke signifikant forstyrrer bindingen af ​​aptamer til MUC1-positive tumorceller.

Aptamere som køretøjer til selektiv levering af doxorubicin til MUC1 positive kræftceller

ikke-selektive optagelse af gratis Dox af både kræft og normale celler er en primær årsag til dens negative virkninger mod normalt væv. Når DOX er interkalateret i DNA-strukturen af ​​MUC1 aptamer (Apt-Dox), kan komplekset binder fortrinsvis til MUC1-positive cancerceller. For at teste dette postulat blev fluorescensegenskaber af doxorubicin anvendes til at evaluere lægemiddeloptagelse af enten MUC1-positive (A549) eller MUC1-negative (HepG2-celler). Cellerne blev inkuberet separat med fri Dox eller Apt-Dox og analyseret ved konfokal mikroskopi. Resultaterne viste, at den røde fluorescens fra lægemidlet var lige så stærk i de to cellelinier behandlet med fri Dox (fig. 7A og B), hvilket indikerer, at optagelsen af ​​frie Dox af disse celler var ikke-selektiv. I modsætning hertil, når cellerne blev behandlet med Apt-Dox, fluorescensen i MUC1-positive A549-celler var signifikant højere end den, MUC1-negative HepG2-celler (Fig. 7C og D), og at optagelsen af ​​lægemidlet ved HepG2-celler var markant nedsat. Resultaterne antydede, at Apt-Dox udviste celle-specificitet og kan selektivt optages af MUC1-positive celler. Interessant, den intracellulære fordeling af lægemidlet i A549 celler var primært begrænset til kerner med gratis Dox, men udvides til cytoplasma i fastsættelsen af ​​Apt-Dox, tyder på, at mekanismerne for optagelse af gratis Dox og Apt-Dox kan være anderledes.

(A-D) Konfokal laser scanning mikroskopi billeder af A549 og HepG2 celler efter inkubering med frit doxorubicin (A og B) eller Apt-Dox (C og D) i 2 timer. (E og F) Flowcytometri histogram profiler af A549 (E) og HepG2-celler (F) efter inkubering med enten frit doxorubicin (sorte kurver) eller apt-Dox (grå kurver). De fyldte histogrammer er de styresignaler genereret af ubehandlede celler.

For yderligere at undersøge, om Apt-Dox kunne selektivt optages af MUC1 positive celler, flowcytometri blev også anvendt til at overvåge fluorescens genereret af doxorubicin efter inkubation af de to cellelinjer med gratis Dox eller Apt-Dox. For MUC1-positive A549-celler, de fluorescerende signaler genereret af fri Dox eller Apt-Dox var ens (figur 7E.); henviser til MUC1-negative HepG2-celler, det fluorescerende signal genereret af Apt-Dox var bemærkelsesværdigt lavere end genereres af fri Dox (fig. 7F). Resultaterne igen antydede, at Apt-Dox kunne selektivt optages af MUC1 positive cancerceller. Tilsammen vores mikroskopi og flowcytometri data indikerer, at aptamer kan MA3 tjene som et middel til målrettet levering af Dox til MUC1-positive kræftceller.

Apt-Dox selektivt reducerede cytotoksicitet til MUC1-negative kræftceller

Da optagelsen af ​​doxorubicin blev reduceret i MUC1-negative celler behandlet med Apt-Dox, er det muligt, at cytotoksiciteten til disse celler også ville være nedsat. For at teste postulat,

in vitro

cytotoksicitet forårsaget af Apt-Dox eller gratis Dox blev sammenlignet i HepG2 og A549-cellelinjer. Som beskrevet i figur 8A, for MUC1-negative HepG2-celler, blev cytotoksiciteten genereret af Apt-Dox faktisk faldet i forhold til den, der genereres af fri Dox (P 0,01). Men for MUC1-positive A549-celler, blev ingen forskel detekteret, mellem cytotoksiciteten genereret af Apt-Dox eller frit Dox (fig. 8B). Resultaterne antyder, at Apt-Dox tendens til at reducere skader på MUC1-negative celler og samtidig bevare effektiviteten af ​​doxorubicin mod MUC1-positive celler. Det skal bemærkes, at aptamer alene var ikke-toksisk over for begge cellelinier, hvilket viser, at aptamer selv var relativt sikre til cellerne, og at cytotoksiciteten skyldes primært doxorubicin.

HepG2 (A) og A549 (B ) celler blev evalueret med en standard MTS assay efter 48 timers yderligere inkubation (gennemsnit ± SD, n = 6).

diskussion

effekten af ​​kemoterapi er ofte begrænset af negative virkninger af cytotoksiske midler, der skader både cancer og normale celler. En strategi for reduktion af de negative virkninger af kemoterapi er målrettet drug delivery til kræftceller. MUC1 betragtes som en værdifuld mål for ligand-styrede anticancer kemoterapi på grund af sin overekspression i de fleste adenokarcinomer. Her i denne undersøgelse, under anvendelse af SELEX-teknik og et peptid epitop af MUC1 som mål, har vi udviklet en hidtil ukendt MUC1 aptamer (MA3) med en

K

d på 38,3 nM. Vi fandt, at MA3 specifikt kunne binde til MUC1-positive cancerceller med minimal krydsreaktivitet til albumin (fig. 1,2,3,4). Desuden blev en aptamer-lægemiddelkompleks (Apt-Dox) dannet ved interkalerende doxorubicin i DNA struktur MA3 aptameren (fig. 6).