PLoS ONE: Immunoglobulin G Expression i lungekræft og dens virkninger på Metastase

Abstrakte

Lungekræft er en af ​​de førende maligniteter hele verden, men den reguleringsmekanisme for sin vækst og metastase er stadig dårligt forstået. Vi undersøgte den mulige ekspression af immunoglobulin G (IgG) gener i pladecellecarcinomer og adenocarcinomer i lungen og beslægtede cancercellelinier. Rigelige mRNA af IgG og essentielle enzymer til IgG syntese blev detekteret rekombination aktivering gener 1, 2 (RAG1, 2) og aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID) i cancercellerne, men ikke i det tilstødende normale lungevæv eller normal lunge epitelcellelinie . De omfang af IgG udtryk i 86 lungekræft viste sig at associere med klinisk fase, patologisk kvalitet og lymfeknude metastaser. Vi fandt, at knockdown af IgG med siRNA resulterede i fald af cellulær proliferation, migration og fastgørelse til dyrkede lungecancerceller. Metastase-associerede gen 1 (MTA1) syntes at være co-udtrykkes med IgG i lungecancerceller. Statistisk analyse viste, at antallet af IgG-ekspression blev signifikant korreleret med den for MTA1 og lymfeknude metastaser. Hæmning af MTA1 genekspression med siRNA førte også til fald på cellulær migration og tilknytning til dyrkede lunge- kræftceller. Disse beviser foreslået, at inhibering af migration kræft og fastgørelse induceret af IgG nedregulering kan opnås gennem MTA1 regulatoriske pathway. Vores resultater tyder på, at lungekræft-producerede IgG vil sandsynligvis spille en vigtig rolle i væksten af ​​kræft og metastaser med signifikante kliniske implikationer

Henvisning:. Jiang C, Huang T, Wang Y, Huang G, Wan X, Gu J (2014) Immunoglobulin G Expression i lungekræft og dens virkninger på metastaser. PLoS ONE 9 (5): e97359. doi: 10,1371 /journal.pone.0097359

Redaktør: Oliver Schildgen, Kliniken der Stadt Köln gGmbH, Tyskland

Modtaget: December 19, 2013; Accepteret: 17. april, 2014 Udgivet: May 22, 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (30.971.150 til JG, 81001199 til ZC) fra National Natural Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende maligne tumorer i hele verden med en meget høj dødelighed [1], [2]. Metastase er den vigtigste årsag til død og ajour er der ingen effektiv behandling til metastatisk lungekræft. Lungekræft kan opdeles i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC) baseret på deres patologiske træk og den kliniske adfærd [3]. NSCLC tegner sig for 84% af lungekræft, hvoraf de fleste er pladecellekræft (LSCC) og adenocarcinom (LAC) [4]. LSCC og LAC blev valgt som objekter af denne undersøgelse.

For nylig kumulative beviser har vist, at humane tumorceller, herunder cancere i bryst, lunge, prostata, tyktarm, spiserør, thyroidea og placental trophablast samt sarcomer kan syntetisere immunoglobulin G (IgG) [5] – [19]. De væsentlige enzymer herunder rekombination aktivering gener 1, 2 (RAG1, 2) og aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID) til syntetisering IgG i B-lymfocytter og plasma celler blev også fundet i cancerceller [20] – [22]. CA215, et immunglobulin-superfamilien protein oprindeligt isoleret fra ovariecancer blev anset for at være den IgG af kræft oprindelse [23] – [25]. Blokade af kræft IgG med antisense-RNA eller IgG-antistof undertrykt cancercellevækst og forøget apoptose [5], [26] – [28]. Ved at detektere IgG ekspression i 142 spiserøret kræft og 80 blødt væv tumorer og sammenlignende analyse af IgG ekspression med patologiske parametre, blev kræft IgG fundet at korrelere med tumorklassificering og proliferative markører, såsom PCNA og Ki-67 i kræft i bryst, spiserør og bløde væv [8], [11], [29]. Disse resultater antyder, at kræft IgG kan spille en rolle i reguleringen af ​​cancervækst. Imidlertid har effekten af ​​IgG i lungekræft og mulig mekanisme der regulerer dens handlinger ikke blevet undersøgt.

Metastase er en kompleks proces, der involverer forskellige proteiner, der virker på løsne kræftceller fra primære steder, infiltrere ind fartøjer og lymfekar , forankring til endotel, trænge ind omgivende matrix, ekstravaseret, overtalelse angiogenese, undgå anti-tumor immunitet, og vokser med metastatiske steder. Metastase-associerede gen 1 (MTA1) er en integreret del af nukleosom remodellering og deacetylering (NuRD) kompleks af histon [30], [31]. MTA1 regulerer transskriptionen af ​​metastase gener ved at modificere mål-kromatin acetylering status samt cofaktor tilgængelighed til mål-DNA. er fundet Høj MTA1 udtryk at være nært knyttet til invasion og lymfe metastaser i forskellige carcinomer [32] -. [34]

I denne undersøgelse undersøgte vi fordelingen mønster af IgG, og forholdet mellem dens udtryk og patologiske parametre i 86 LSCC og LAC. Vi yderligere undersøgt de mulige virkninger af kræft-producerede IgG på cellulær vedhæftning og migration ved hjælp af teknikken med siRNA indblanding i en vedhæftet fil assay, et transwell assay, og en sårhelende assay med to lunge cancer cellelinjer samt en normal lunge epitel cellelinie. Vi undersøgte også forholdet mellem IgG genekspression og et antal metastatiske relaterede gener. Vi fandt, at kræft IgG kan spille en central rolle i lungekræft metastase gennem regulering af metastatisk gen MTA1.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og godkendt af Etisk Komité Shantou University Medical College. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter eller deres familier for brug prøverne til forskning.

Cellelinjer

human lunge pladecellecarcinom cellelinie SK-MES-1, lunge-adenocarcinom-cellelinje A549, normal lunge epitelcellelinie Beas2B, og Burkitts lymfom-cellelinje Raji blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM med 10% FBS. Alle cellelinjer blev dyrket i fugtig atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C.

vævsprøver

seksogfirs formalin fiksering paraffin indlejret lungekræft enheder, heriblandt tilstødende normal lunge væv blev hentet fra patologisk Institut, Shantou University Medical College tilknyttet Tumor Hospital og patologisk Institut, Xiangyang Central Hospital, Hubei-provinsen 2006-2011 med fuldstændig klinisk information af aldre, køn, histologisk type, patologisk kvalitet, klinisk fase og lymfeknude metastase. To praktiserende patologer fornyet behandling i hematoxylin og eosin (H Zymed Laboratory, South San Francisco) og visualiseret med 3-amino-9-ethyl-carbazol (AEC; Golden Bridge International). De primære antistoffer blev anført i tabel S1. Obduceret sunde tonsil væv blev anvendt som positive kontroller for Igγ, IgK og IgA immunfarvninger. PBS i stedet for primære antistoffer blev anvendt som en negativ kontrol. For at sikre specificiteten af ​​immunofarvning blev et antistof pre-absorption test, ved hvilken det primære antistof mod Igγ blev præ-inkuberet med rent humant IgG ved det molære forhold mellem 1:01, 1:05 og 1:10. Den blandede opløsning blev inkuberet ved 4 ° C natten over og derefter anvendt i stedet for det primære antistof.

Igγ og MTA1 ekspression scorings

Scoring af Igγ immunfarvning blev udført som tidligere beskrevet med mindre modifikation [8]. Procentdelen og intensiteten af ​​positive celler blev erhvervet ved at tælle tumorceller fra 10 tilfældigt udvalgte visuelle felter under 400 × forstørrelse. Scoring af 0-3 for procentdelen af ​​positive celler var: 0 = 5%; 1 = 5-25%; 2 = 25-50%; og 3 = 50%. Intensiteten af ​​IHC-farvning blev scoret: 0, 1, 2, 3, repræsenterer fravær af signal, svagt signal (lys rød), moderat signal (rød) og stærkt signal (mørkerød), hhv. Det endelige resultat for hvert enkelt tilfælde blev bestemt ved at tilføje de to scoringer sammen og de samlede resultater blev tildelt negative (-), når summen var 0 eller 1, svagt positive (+), når summen var 2 eller 3, moderat positiv (++ ) når summen var 4 eller 5, og stærkt positiv (+++) når summen var 6. for at undersøge forholdet mellem Igγ og MTA1 blev prøverne af lungekræft opdelt i 2 grupper efter snesevis af Igγ immunfarvning. Tilfælde med snesevis af 0-3 blev betragtet som “svage udtrykket” og 4-6 som “stærkt udtryk”

Scoring af MTA1 immunfarvning blev beregnet ved hjælp af en mærkning indeks (LI) som følger:. LI = 100 × (p /t)% ( “p” er antallet af MTA1-positive cancerceller og “t” er antallet af totale cancerceller). Ca. 3000 celler under × 400 forstørrelse blev talt (10 tilfældigt udvalgte felter på hvert dias).

In situ hybridisering

Proberne blev designet til at detektere humant immunglobulin G1 tung kæde konstante region (IGHG1) . PCR-primere for IGHG1 var som følger: sense, 5′-ACGGCGTGGAGGTGCATAATG-3 ‘; antisense, 5’-CGGGAGGCGTGGTCTTGTAGTT-3 ‘. Fremgangsmåden til syntese af de specifikke prober er blevet rapporteret tidligere [6]. Kort sagt blev en sprængt milt forårsaget af traumer bruges til at adskille lymfocytter. PCR-produktet blev subklonet i pGEM-T-vektoren (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). Efterfølgende endonukleasen

Nco

I eller

Sal

jeg blev brugt til linearisering af nye plasmid, og T7 eller SP6 RNA-polymerase blev anvendt til at danne antisense eller sense probe med den nye plasmid som en skabelon.

ISH blev udført som tidligere beskrevet [8]. Kort sagt, deparaffineret, rehydrerede væv objektglas blev behandlet med 0,1 M HCI i 10 minutter, opvarmet til 100 ° C i citratpuffer (0,01 M, pH 6,0) i 15 minutter, fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og derefter dehydreret ved 90 % ethanol. Indtil tørhed fuldstændigt blev objektglassene inkuberet med 20 pi hybridiseringsblanding indeholdende 18 pi fortyndingsmiddel og 2 pi sense eller antisense-probe ved 50 ° C i 18~20 timer. Efter vask med 5 x SSC, 2 x SSC plus 50% formamid og 2 x SSC to gange i 15 min ved 37 ° C blev objektglassene blokeret med hesteserum ved stuetemperatur i 1 time og inkuberet med anti-digoxigemin-Ap Fab-fragmenter (1:500, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz) ved stuetemperatur i 1 time. Objektglas blev farvet ved hjælp af NBT-BCIP (Promega, Madison, USA). For dyrkede celler vokser på dias, alle de procedurer svarede til væv slides undtagen afparaffinering, rehydrering og opvarmning hentning. Yderligere objektglas blev inkuberet med sense prober som negative kontroller.

Immunofluorescens

A549, SK-MES-1 og Beas2B lodes vokse på objektglas. Immunofluorescens blev udført ifølge en protokol som tidligere [11] beskrevne. De primære antistoffer anvendt i dette assay er beskrevet i tabel S1. Efter vask i PBS blev objektglassene inkuberet med FITC-konjugeret gede-anti-kanin /ged anti-mus IgG (Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) ved stuetemperatur i 30 min. DAPI blev anvendt til at modfarve kerner. Glassene blev undersøgt og fotograferet med en fluorescens mikroskop (Zeiss AxioImager Z1, Zeiss GmbH, Göttingen, Tyskland).

Laser guidet mikrodissektion, RNA ekstraktion og revers transkription

Friske frosne vævsprøver blev snittet ved 10 um, monteret på et polyethylennaphthalat (PEN) -membrane glider (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og derefter straks fikseret i 75% ethanol i 1 minut. Målceller i sektioner blev mikrodissekeres og opsamlet til hætten af ​​et Eppendorf rør med laser magt ved hjælp af Leica Mikrodissektionsteknikker Systems 6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Totalt RNA blev ekstraheret fra isolerede celler med en RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Target cDNA’er blev syntetiseret med en hævet III første-streng syntese kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner.

TRIZOL (Invitrogen), blev chloroform, isopropanol og ethanol anvendes til at ekstrahere RNA fra vævsprøver ifølge en protokol, som Invitrogen. RNase-frit DNase (Invitrogen) blev anvendt til at fjerne eventuel genomisk DNA-kontaminering. Målrettet cDNA’er blev dannet med første streng cDNA systhesis kit (Toyobo videnskabelige, Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner.

Polymerasekædereaktion (PCR)

Som tidligere beskrevet IGHG1, RAG1, rag2, og AID blev forstærket med nested PCR [8]. Primerne (Sangon Biotech, Shanghai, Kina), der anvendes i dette assay, er vist i tabel S2. PCR-produkterne blev undersøgt med 2% agarosegelelektroforese. Vand i stedet for cDNA blev anvendt som PCR-skabeloner som negative kontroller for de gener, hvis primere strække sig over to exoner. For RAG1, rag2 og IgK, hvis primere beliggende i et exon blev RNA behandlet med DNase anvendt som en negativ kontrol. Raji cellelinje blev ansat som en positiv kontrol. Rengøring gen GAPDH blev brugt til at normalisere relative ekspressionsniveauer.

DNA-sekventering

PCR prodocts for Vγ, VK og VA-ekstraheres med Agarose Gel DNA Extraction Kit (Takara Biotech, Dalian, Kina) og derefter klonet ind i en pGEM-T-vektoren (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). Efter transficeret ind Kompetent

E. coli

TOP10, nye kloner blev dannet, der blev amplificeret med bakterier avl. Efterfølgende blev nye kloner oprenset med Universal DNA Purification Kit (Tiangen Biotech) og undersøgt med 2% agarosegelelektroforese. De nye kloner blev anvendt i DNA-sekventering, som blev udført af BGI-Shenzhen, Kina. Sekvenserne af de nye kloner blev sammenlignet med kendte sekvenser i GenBank hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Real-Time PCR og kvantitativ analyse

Brug af en ABI PRISM 7500 instrument, blev real-time PCR udført med SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio, Inc., Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner. For at detektere nedstrøms gener muligvis reguleret af IgG, blev fælles metastatiske gener MTA1, CD44, E-cadherin, MMP9, MMP2 og Intergrin β1 undersøgt efter siRNA interferens (se “RNA-interferens”). De anvendte primere til real-time PCR er anført i tabel S3. Amplifikation af β-actin blev anvendt til normalisering. De relative udtryk for hvert gen i de testede celletyper blev bestemt med fremgangsmåden af ​​2

-ΔΔCt [36].

Western blot-

Western blot blev udført som tidligere beskrevet [11 ]. Protein-alikvoter 150 ug blev kørt på 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Hele molekylære IgG var på ikke-reducerende geler og andre proteiner var på reducerende geler. De primære antistoffer anvendt i dette assay er beskrevet i tabel S1. At påvise nedstrøms gener muligvis reguleret af IgG, blev fælles metastatiske gener MTA1, CD44, E-cadherin, MMP9, MMP2 og Intergrin β1 undersøgt efter siRNA indblanding af IgG gener. Rent humant IgG blev anvendt som en positiv kontrol og rengøring gen β-actin blev anvendt til at normalisere de relative ekspressionsniveauer.

RNA-interferens

Den dyrkede A549, SK-MES-1 og Beas2B celler blev inddelt i tre grupper (siRNA-IGHG1 eller siRNA-MTA1, siRNA-krypteret og ubehandlede). Kodede siRNA’er blev anvendt som en negativ kontrol. Alle siRNA’er blev indkøbt fra Shanghai GenePharma Inc. IGHG1 siRNA-sekvenserne var sense: 5′- CCAAGGACACCCUCAUGAUTT-3 ‘og antisense: 5′-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3′; MTA1 siRNA-sekvenser var sense 5’-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCTT-3 ‘og antisense 5′-GCUUUAACUUGCUCUCAGCTT-3′; scrambled siRNA-sekvenser var sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘og antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. For siRNA transfektion blev X-tremeGENE reagens (Roche Diagnostics), der anvendes. Forholdet mellem transfektionsreagens til siRNA var 10 pi: 2 ug pr 3 × 10

5-celler. Transfektionsproceduren blev udført ifølge producentens anvisninger. Effektiviteten af ​​siRNA interferens blev undersøgt med Real-time PCR 48 timer senere og med Western blot 72 timer senere.

MTS assay

Om 1 × 10

4 cancerceller (A549 eller SK-MES-1) blev udsået og dyrket på en plade med 96 brønde i 24 timer. Cellerne blev inddelt i følgende grupper: behandlede grupper (siRNA-krypteret og siRNA-IGHG1), ubehandlede gruppe og blank gruppe (komplet medium uden kræftcelle). Proceduren for RNA-interferens blev udført og dyrkes i en 48-timers periode. MTS (Jianchen Biosciences, Nanjing, Kina, 20 pi) blev tilsat til hver brønd, og efter inkubation i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C i 1 time blev OD-værdien for hver brønd aflæses ved 450 nm bølgelængde ultraviolet. Forsøgene blev udført in triplo. Den celledeling blev beregnet som følger:

Attachment assay

Oplysninger om vedhæftede assays blev beskrevet tidligere med mindre modifikationer [37]. Kort fortalt blev den dyrkede A549, SK-MES-1 og Beas2B celler transficeret med siRNA. To dage senere, 1 x 10

4 celler per brønd blev podet på Matrigelcoatede 96-brønds plader (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Efter 2 timer blev pladerne vasket for at fjerne ikke-klæbende celler. Hver brønd blev inkuberet med 20 pi MTS reagenser i 2 timer ved 37 ° C og den optiske densitet blev detekteret ved 450 nm bølgelængde ultraviolet. Kontroller med scrambled siRNA’er blev udført med den samme protokol som beskrevet ovenfor. Cellen udsåningstæthed er en empirisk værdi. Målet er at etablere 30% -50% cellekonfluens efter cellevedhæftning til dyrkningspladen for at lette vækst. Når de er etableret, seeding tæthed var ens for alle grupper for at sikre fair sammenligning.

Transwell assay

Smeltet metrigel blev blandet med precolled DMEM i en endelig koncentration på 0,8 pg /pl og derefter belagt på de øvre kamre i transwell inserts (Millipore, Billerica, MA) ved 100 ul /brønd, indtil koagulering ved 37 ° C. Efter 48 timer af siRNA transfektion, ca. 1 × 10

5 trypsinerede celler blev podet ind i det øvre kammer ved hjælp af serum-frit DMEM. Igen cellen podningstæthed var ens for alle grupper. Transwell inserts blev sat i 24-brønds pladen, brønde, hvor 200 pi DMEM plus 10% FBS blev tilføjet. Pladen blev sat stadig ved 37 ° C i 24 timer. Assays blev derefter stoppet ved fjernelse ikke-invaderende celler i det øvre kammer med podninger. Celler i den nedre side af indsatsen blev farvet med hematoxylin. Celler i fem visuelle felter under 400 × forstørrelse pr insert blev talt og fotograferet.

Sårheling assay

dyrkede A549, SK-MES-1 og Beas2B celler podet i 12-brønds plader ( 1 × 10

5 celler /brønd) blev transficeret med siRNA som beskrevet ovenfor. Når cellerne nåede 90% konfluens, sletning cellemonolaget med en steril 10 pi pipettespids blev brugt til at skabe et sårområde. Derefter blev pladerne vasket med PBS for at fjerne løsnede celler, og cellerne blev dyrket med FBS-frit DMEM. Efterfølgende blev pladen indstillet stadig ved 37 ° C i 48 timer. Såret område blev overvåget med et inverteret mikroskop og fotograferet.

Statistisk analyse

Korrelationer mellem Igγ udtryk i lungekræft og forskellige kliniske patologiske parametre blev udført med Pearson chi-square test.

Students t-test blev anvendt til at sammenligne data opnået med de tre grupper, dvs. siRNA-IGHG1, siRNA-krypteret og den ubehandlede i analyser af MTS, transwell, vedhæftet fil, Real-time PCR og Western blot. De korrelationer mellem Igγand MTA1 udtryk og mellem MTA1 udtryk og kliniske patologiske parametre blev evalueret med Students t-test. Niveauet af signifikans blev sat til

p

. 0,05

Resultater

Igγ, IgK og IgA udtryk i LSCC og LAC

De fleste lungekræft ( 85%) undersøgt udtrykt Igγ og IgK, mens et lille antal ( 15%) udtrykkes også IgA samtidigt. Igγ, IgK og IgA blev udtrykt i de samme celler som påvist med fortløbende sektioner. Positiv farvning signaler blev lokaliseret til cytoplasmaet og på de cellulære membraner. Størstedelen af ​​positive cancerceller blev omdelt på de perifere områder af kræft reder i LSCC eller med diskontinuert plettet mønster i de rørformede strukturer LAC (figur 1, A-F). Mange IgG postive kræftceller havde atypiske kerner og nuklear kondens. Obduceret mandler indeholdt Igγ, IgK og IgA immunoreaktiviteter i B-lymfocytter (figur 1, G-I). Vi udnyttede CD20 som markør for B-lymfocytter og pan CK som markør for celler af epitelial oprindelse. Med serielle snit, vi har registreret to slags celler, der udtrykker Igγ. Den ene er store epithelioide celler med positiv pan CK, og den anden er små runde celler med positiv CD20. Baseret på morfologi og cellemarkører, der er konstateret vi, at førstnævnte er cancerceller og sidstnævnte infiltrerer B-lymfocytter (figur 1, J-O). Normal lungevæv støder op til cancer reder indeholdt ingen positiv IgG immunreaktivitet (figur 1, P-R).

A-C, Igγ (A), IgK (B) og IgA (C) immunfarvninger er positive i cytoplasmaet og cellulære membran af LSCC på serielle snit. Bemærk: IgG-positive cancerceller er fordelt ved periferien af ​​tumormassen. D-F, positive signaler for Igγ (D), IgK (E) og IgA (F) er vist i cytoplasmaet og cellulære membran af et LAC. G-I, Igγ (G), IgK (H) og IgA detekteres (I) udtryk i lymfocytter fra tonsil væv som en positiv kontrol. J-L, Igγ (J), pan CK (K) og CD20 (L) er udtrykt i LSCC på serielle snit. M-O, Igγ (M), er pan CK (N) og CD20 (O) udtrykt i serielle sektioner af LAC. Igγ (P), er IgK (Q) og IgA (R) ikke udtrykkes i normale epitelceller støder op til tumormasse på serielle snit. Sorte pilespidser peger på den samme cancercellen på serielle snit. Sorte pile peger på positive lymfocytter. Med AEC farvelægningsmetode, de positive immunfarvninger med AEC er rød i farven. Bemærk: IgG er positiv i både cancerceller og infiltrerende lymfocytter med sidstnævnte stærkere end førstnævnte. Målestok:. 20 pm

I de antistof præabsorption tests, stigende koncentrationer af rent humant IgG-antigen ført til faldende intensitet immunfarvning (figur 2, A-F). Infiltrerer B lymphoctyes i mesenchyma omgiver kræft reder eller de rørformede strukturer udtrykte IgG stærkere end kræftcellerne. For yderligere at skelne kræftceller fra lymfocytter, vi undersøgte udtryk for CD16, CD32, CD64 og FcRn i LSCC og LAC. Ingen cancerceller blev fundet at udtrykke disse receptorer (figur 3, A-H), og de eneste celler, der udtrykker dem var lymfocytter (figur 3, I-L).

A-C, muse-anti-humant Igγ monoklonalt antistof: rent humant IgG = 1:01, 1:05, og 1:10 i LSCC sektioner. D-F, den tilsvarende gradient forholdet Igγ: rent humant IgG i LAC sektioner. Med forhøjelsen af ​​antigenkoncentration (rent humant IgG), blev den positive IgG signal svækket. Bar: 20 pm

CD16 (Fcy receptor III) er vist i LSCC (A) og LAC (E) væv.. CD32 (Fcy receptor II) vises i LSCC (B) og Lac (F) væv. CD64 (Fcy-receptor I) er vist i LSCC (C) og LAC (G) væv. FcRn (neonatal Fcy receptor) er vist i LSCC (D) og LAC (H) væv. I de sektioner, er positive signaler kun udtrykkes i cytoplasmaet og membranen af ​​lymfocytter, mens ingen positive signaler findes i cancerceller. CD16 (I), CD32 (J), CD64 (K) og FcRn (L) er udtrykt i biopsi humane tonsil væv som positive kontroller. Bar:. 20 pm

Næsten alle kræftceller var positive for IGHG1 mRNA. I sammenhængende dele, blev proteinet af Igγ og mRNA af IGHG1 lokaliseret til cytoplasmaet af de samme cancerceller og infiltrerende B-lymfocytter (figur 4, A, B, D og E). Positive signaler af IgG-mRNA blev også fundet i B-lymfocytter fra humane tonsil væv (figur 4, G og H). Ingen positivt signal blev set i lymfocytter og cancere, når sense probe blev anvendt (Figur 4, C, F og I). Normal lungevæv støder op til cancer reder udtrykte ikke IgG-protein og mRNA fra IGHG1 (figur 4, J-L).

co-lokalisering af IgG mRNA og protein i LSCC og LAC vævsprøver demonstreret med ISH og IHC . A-C, Igγ immunfarvning (A, rød) og mRNA-signaler (B, lilla, med antisense probe) er positive på serielle sektioner af en LSCC. C er en negativ kontrol med sense-proben. D-F, Igγ Immunofarvning (D, rød) og mRNA-signaler (E, lilla, med antisense probe) er positive på serielle sektioner af en LAC. F er negativ med sense-proben. G-I, Tonsil væv anvendt som en positiv kontrol. G er for Igγ med IHC viser positive lymfocytter. H er for antisense probe med ISH viser positive lymfocytter. Jeg er med sense probe i ISH viser ingen positivt signal. J-L, Igγ protein (J) og mRNA (K, antisense-proben) ikke udtrykkes i normale epitelceller støder op til tumormasse. L er sense-proben. Sorte pilespidser peger på de samme cancerceller på serielle snit. Sorte pile peger på positive lymfocytter.

Med frisk kirurgisk lungekræft væv, udførte vi LMD at indfange cancerceller og normale lungeepitelceller støder op til cancer reder blot uden lymfocytter (figur 5, A) for at detektere mRNA-transkripter af IgG herunder IGHG1, κ konstant (CK), λ konstant (Cλ), γ variabel (Vγ), κ variabel (VK), λ variabel (VA-), sterile kimcelletransformanter transkripter (Iγ-Cy) og essentielle enzymer herunder RAG1, rag2 og AID for immunglobulin syntese og klasseskift. Positive signaler af disse gener blev fundet i LSCC og LAC cancerceller i stedet for den normale lungeepitelceller (figur 5, B). Fire tilfælde af lungekræft viste meget høj homologi til de offentliggjorte sekvenser af Vγ, VK, og VA-kun med få genmutationer. Ved sekvensalignment, vi fandt også, at V (D) J-omlejring opstod, når den tunge kæde eller lette kæder blev syntetiseret, men præsenteret en monoton mønster (figur 6).

A er de repræsentative billeder af LMD i LSCC, LAC og normal lunge støder op til tumormasse. B, båndene repræsenteret, at IgG syntese forbundet gener blev detekteret i LSCC, LAC og normal lunge med LMD kombineret med RT-PCR. Ingen CD19 blev registreret, hvilket udelukker mulig forurening B-lymfocytter. Raji cellelinje blev anvendt som en positiv kontrol. Vand blev anvendt som en negativ kontrol i stedet for primerne. RNA behandlet med DNase (forkortet som R) blev anvendt som en skabelon for at udelukke mulige falsk positivitet i 1R-6R. NL er en forkortelse af normal lunge.

A er for de sekvenser af Vγ, B er for VK, og C er for VA-.

Påvisning af IgG og essentielle enzymer til IgG syntese i A549, SK-MES-1 og Beas2B cellelinier

LSCC cellelinie (SK-MES-1) og LAC cellelinie (A549) viste sig at udtrykke Igγ, IgK og IgA med immunofluorescens (figur 7, A-F). Det positive signal blev set i cytoplasmaet og på cellemembranen. Som en positiv kontrol blev Igγ, IgK og IgA også påvist i cytoplasmaet af Raji-celler (figur 7, G-I). Normal lunge epitel celle linje (Beas2B) ikke udtrykke Igγ, IgK og IgA (figur 7, J-L). Abundant IGHG1 mRNA blev påvist i A549 og SK-MES-1 (figur 7, M og O) samt Raji-celler (figur 7, Q). Ingen positiv signal blev set, når sense probe blev anvendt (figur 7, N, P og R). IGHG1 mRNA blev ikke fundet i Beas2B (figur 7, S og T).

A-C, Igγ (A), IgK (B) og IgA (C) udtrykkes i A549-celler med immunofluorescens. D-F, Igγ (D), IgK (E) og IgA (F) er udtrykt i SK-MES-1-celler. G-I, Igγ (G), IgK (H) og IgA (I) er i Raji celler som positiv kontrol. J-L, Igγ (J), IgK (K) og IgA (L) ikke udtrykkes i Beas2B celler. Positive signaler (lilla) for IGHG1 antisense probe ses i cytoplasmaet i A549 (M), SK-MES-1 (O) og Raji (Q) celler. N, P og R viser negative resultater (sense probe) i A549, SK-MES-1 og Raji-celler. Ingen positive signaler findes i Beas2B celler (S, antisense sonde; og T, sense probe). For at fremhæve de celler uden lilla signal, methyl grøn var brug for at kontrastfarve kernerne. Scale barer: 20 pm

mRNA’erne af IgG og de væsentlige enzymer til IgG syntese blev alle udtrykt i A549 og SK-MES-1 i stedet for Beas2B (figur 8, A).. Hele molekylet af IgG samt forskellige fragmenter, dvs. Igγ, IgK og IgA blev alle påviselige i A549 og SK-MES-1-celler (figur 8, B) med tilsvarende molekylvægt svarende til IgG fra B-lymfocytter. Tilstedeværelsen af ​​RAG1, rag2 og AID i A549 og SK-MES-1 blev også bekræftet med Western blot (figur 8, C). I modsætning til kræftcellerne, havde Beas2B ikke udtrykke IgG komponenter eller de enzymer for IgG syntese (figur 8, B og C).

A, båndene repræsenteret, at IgG syntese associerede gener blev påvist med RT-PCR i A549 og SK-MES-1, mens ikke i Beas2B. B viser, at IgG hele molekylet, Igγ, IgK og IgA er påvist i A549, SK-MES-1, mens ikke i Beas2B med Western blot. Humant rene IgG blev anvendt som molekylvægt standard til sammenligning med det fra lungecancerceller. Raji cellelinje var en positiv kontrol. C viser, at RAG1, rag2 og AID udtrykkes i lunge kræftceller, mens ikke i Beas2B. Raji cellelinje blev serveret som en positiv kontrol.

IgG og MTA1 gen udtryk blev hæmmet af siRNA interferens for IGHG1

udtryk for Igγ både mRNA (figur 9, A) og proteinniveauer (figur 9, C og D) var specifikt nedreguleres af siRNA-IGHG1 i A549 og SK-MES-1cell linjer. Sammen med IgG, blev MTA1 ekspression markant nedsat på mRNA (figur 9, B) og de proteinniveauer (figur 9, C og D) i de to cellelinier.