PLoS ONE: Den 15 kDa selenoprotein og Thioredoxin reduktase en Fremme tyktarmskræft ved forskellige veje

abstrakt

selenoproteiner medierer meget af de kræftforebyggende egenskaber af essentielt næringsstof selen, men nogle af disse proteiner er blevet vist at også have kræft-fremmende effekter. Vi undersøgte bidragene fra 15 kDa selenoprotein (Sep15) og thioredoxin reduktase 1 (TR1) til udvikling af kræft. Målrettet nedregulering af enten gen inhiberes forankringsafhængige og forankringsuafhængig vækst og dannelse af eksperimentelle metastaser af muse colon carcinoma CT26-celler. Overraskende, kombineret mangel på Sep15 og TR1 vendt de anti-cancer effekter observeret med nedregulering af hver enkelt gen. Vi fandt, at inflammationsrelaterede gener reguleret af Stat-1, især interferon-y-regulerede guanylat-bindende proteiner, var stærkt forhøjede i Sep15-deficient, men ikke i TR1-deficiente celler. Interessant bestanddele af Wnt /β-catenin signalvej var opreguleret i celler, der mangler både TR1 og Sep15. Disse resultater antyder, Sep15 og TR1 deltage i interfererende regulatoriske veje i colon cancerceller. I betragtning af de variable ekspressionsniveauer af Sep15 og TR1 fundet i det menneskelige befolkning, vores resultater giver indsigt i nye roller selenoproteiner i kræft

Henvisning:. Tsuji PA, Carlson BA, Yoo MH, Naranjo-Suarez S, Xu XM, He Y, et al. (2015) Den 15 kDa selenoprotein og Thioredoxin reduktase en Fremme tyktarmskræft ved forskellige veje. PLoS ONE 10 (4): e0124487. doi: 10,1371 /journal.pone.0124487

Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 30, 2014, Accepteret: 3 marts 2015; Udgivet: 17. april, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed: Relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Microarray data er tilgængelige via genekspression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; tiltrædelse # GSE55488)

Finansiering:. Finansieret af Towson University Fisher College of Science og matematik (Begavet Stol, PAT), National Cancer Institute Intramural støtte, National Cancer Institute Cancer Prevention Fellowship Program (PAT), og National Institutes of Health tilskud (CA080946, GM065204 til VNG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft stadig den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1]. Supplerende kosten selen er blevet rapporteret at reducere forekomsten og dødeligheden af ​​tyktarmskræft hos mennesker [2] og dyr med suboptimale selen [3]. Disse kræftforebyggende egenskaber primært medieret gennem selenoproteiner [4], hvilket tyder på en underliggende genetisk modtagelighed for tyktarmskræft. Tre selenoproteiner har været impliceret i både forebyggelse og fremme af kræft: 15 kDa selenoprotein (Sep15) [5-7], thioredoxin reduktase 1 (Txnrd1, TR1) [8], og glutathion peroxidase 2 (GPx2) [9]. Desuden studier af enkelt nukleotid polymorfier afslørede en sammenslutning af både TR1 og selenoprotein P (SEPP1) med avancerede kolorektale adenomer hos mennesker [10]. Vi har tidligere undersøgt den dobbelte personligheder de to første selenoproteiner [7,8,11,12], og her har vi yderligere undersøgt deres samspil i deres regulering af tyktarmskræft. Sep15 og TR1 tilhører den thiol-oxidoreductase gruppe selenoproteiner [13]. TR1 er en væsentlig redox-regulator i pattedyrceller og er også involveret i celleproliferation, angiogenese, transkription, og DNA-reparation [14,15]. Den fysiologiske funktion af Sep15 forbliver dårligt forstået, men det kan være involveret i omlejring af disulfidbindinger eller tjene som en reduktase for ukorrekt dannede disulfidbindinger i misfoldede glycoproteiner bundet til UDP-glucose: glycoprotein-glucosyl-transferase (UGGT) [16].

Vi har tidligere vist, at tabet af TR1 vendt maligne egenskaber LLC1 mus lunge kræftceller [17]. Tilsvarende tab af Sep15 vendt cancerfænotypen af ​​murin [18] og humane coloncancer-celler [19]. Fordi begge proteiner er selenoproteiner, er det muligt, at de har additive eller synergistiske virkninger. Sep15 udtrykkes differentielt i nogle humane cancere [20,21], og TR1 opreguleres i mange cancere [14]. Heri undersøgte vi sammenhængen mellem Sep15 og TR1 i mus CT26 kolon adenokarcinomceller med hensyn til roller disse selenoproteiner i tyktarmen tumorigenese. Interessant, fjernelse af disse to selenoproteiner syntes at opnå tilbageførsel af kræft fænotyper meget forskellige veje, og, uventet, blev en kombineret mangel på Sep15 og TR1 kompenseres ved opregulering af komponenter i Wnt /β-catenin-signalvejen.

Materialer og metoder

tiltrædelsespartnerskaber Koder

Microarray data er tilgængelige via genekspression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; tiltrædelse # GSE55488).

Materialer

Murin CT26 coloncancer-celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA), og kun lave passagetal blev anvendt. Den pSilencer2.0 U6-Hygro-vektor var fra Ambion (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), føtalt bovint serum, phosphatbufret saltvand (PBS), RPMI 1640, hygromycin B, NuPAGE 4-12% polyacrylamidgeler, SeeBlue Plus2 protein markører, lithium dodecylsulfat (LDS) prøvebuffer, lipofectamin 2000, polyvinylidendifluorid (PVDF) -membraner, og TRIzol reagens fra Invitrogen (Carlsbad, CA), og 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) og aurothioglucose fra Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Antistoffer mod Sep15 og TR1 blev frembragt i kaniner efter Epitomics /Abcam (Cambridge, MA) under anvendelse af et syntetisk peptid (Sep15) eller rekombinant protein (TR1) som antigener, og blev valideret i vores laboratorium for dette selskab. Kanin-anti-Alfaføtoprotein (AFP) antistof og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof mod ged blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA), og muse-anti-phospho-β-catenin primært antistof fra Cell Signaling (Danvers, MA). Antistoffer mod β-actin, α-tubulin, guanylat-bindingsprotein-1 (GBP-1), Stat1 (P84 /P91), og interferon-induceret protein 44 (Ifi44) var fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). Peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof mod kanin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SuperSignal West Dura substrat og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof mod mus var fra Pierce (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL), og iScript cDNA Synthesis kit og SYBRGreen Supermix fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Real-time RT-PCR primere var fra Sigma-Genosys (St. Louis, MO), ædle agar fra Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ), og sort tusch fra Winsor Newton. Andre reagenser var af højeste kommercielt tilgængeligt kvalitet.

Målrettet nedregulering af Sep15, TR1, og TR1 /Sep15

pU6-m3 vektor, der anvendes til at generere kort hårnål RNA (shRNA) mål og stabil transfektion af shSep15 og shTR1 CT26 tyktarmskræft celler blev konstrueret som beskrevet [17,18,22], og kun lave passage tal blev brugt til eksperimenter. Sep15- og TR1-mangelfuld og de tilsvarende CT26 parentale celler blev transficeret med identiske vektorer (se [15,17] for detaljer) undtagen for shRNAs. Vi undersøgte to shRNA oligonukleotidsekvenser, og flere uafhængige cellekloner af disse sekvenser resulterede i meget lignende fald i både mRNA og protein niveauer. De to shRNA oligonukleotidsekvenser til Sep15 og TR1 er blevet vist tidligere for at resultere i tilsvarende tilbageførsel af kræft fænotype [17,18]. De dobbelt-Knockdown celler indarbejdet begge de validerede konstruktioner. Celler med dobbelt-knockdown af Sep15 og TR1 tilsammen blev fremstillet som beskrevet [22].

Cell kultur og celle vækst assays

Mus tyktarmskræft CT26 celler blev dyrket i komplet vækstmedium (RPMI1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% natriumpyruvat) i en fugtig atmosfære (5% CO

2, 37 ° C). Celler blev stabilt transficeret med shSep15, shTR1, en kombination af shTR1 og shSep15 konstruktionerne, eller det tomme pU6-m3 vektor (kontrol) under anvendelse af lipofectamin 2000 ved at vælge celler i nærvær af 500 ug /ml hygromycin B. Cellevækst blev overvåget ved podning 1 × 10

5 celler /brønd i seks brønde i komplet vækstmedium og tælle celler i fire dage.

RNA-analyse

Total RNA blev ekstraheret fra celler med TRIzol. cDNA blev syntetiseret med iScript og 1,5 ug af total RNA ifølge producentens anvisninger. Til kvantitativ real-time RT-PCR (qPCR), blev 1,5 pi cDNA tilsat til 20 pi reaktioner med DNA Engine Opticon2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Primerne til qPCR er vist i S1 tabel. mRNA-niveauer af selenoproteiner blev beregnet i forhold til ekspression af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

), der anvendes som en intern kontrol.

Western blotting analyser

Protein prøver ekstraheret fra de fire stabilt-transficerede CT26 cellelinier blev elektroforesebehandlet på NuPAGE 4-12% polyacrylamidgeler efterfulgt af overførsel til PVDF-membraner. Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer (1: 200 til 1: 2.000) natten over ved 4 ° C. Peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer (1: 10.000). Blev påført, membranerne inkuberet i kemiluminescerende substrat og eksponeret for røntgenfilm

Thioredoxin reduktase (TR) aktivitet

TR aktivitet var bestemmes spektrofotometrisk [23], er baseret på den modificerede metode Holmgren og Björnstedt [24]. Kort fortalt blev TR aktivitet bestemt som forskellen mellem total TR aktivitet og tidsafhængig stigning i absorbans ved 412 nm i nærvær af TR-inhibitor, aurothioglucose. En aktivitetsenhed defineredes som 1,0 pmol 5-thio-2-nitrobenzoesyre dannet /min /mg protein. Proteinkoncentrationer blev målt med bicinchoninsyre.

Soft agar assay

Anchorage-uafhængig vækst blev undersøgt af blød agar analyser [17,18]. Modsætning til de fleste celler med en normal fænotype, mange cancerceller er i stand til at vokse uforankret i blød agar. Ca. 3.000 celler af hver stabilt-transficerede CT26-cellelinien blev suspenderet i 3 ml 0,35% ædelt agar i komplet RPMI 1640 og spredes ud på 60-mm skåle maskeret med en basal lag af 3 ml 0,7% ædelt agar i medierne. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i tre uger, og komplet vækstmedium blev påført på skålene hver tredje dag. Kolonier blev visualiseret ved farvning natten over med

s

-iodonitrotetrazolium violet, scannet og talt.

Cellecyklusanalyse

CT26-celler blev dyrket i komplet medium til 50% konfluens, vasket to gange med sterilt PBS, og opretholdt i serumfrit medium i 48 timer for at inducere G0-G1 cellecyklus synkronisering. Celler blev derefter inkuberet med komplet vækstmedium i 0, 6, 24 eller 48 timer, vasket to gange med PBS, trypsiniseret, og suspenderet i PBS (1 × 10

7 Hvis 2 × 10

7 celler /ml) på is. Iskold 70% ethanol blev tilsat gradvist, og celler blev fikseret natten over. Cellerne blev centrifugeret, resuspenderet i RNase (100 enheder), og inkuberet ved 37 ° C i 20 min. Suspensionen blev farvet med propidiumiodid i mørke ved 4 ° C natten over, filtreret gennem en 50-um mesh, og erhvervet med en FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev analyseret ved ModFitLT version 3.0 (Verity, Topsham, ME).

Dyreforsøg

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af NCI-Bethesda Animal Care og brug Udvalg (tilladelse nummer for denne undersøgelse er LCP-005). Dannelse af eksperimentelle lungemetastaser upon

jeg

.

v

. injektion af plasmid-transficeret kontrol blev shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15 celler undersøgt i BALB /c-mus (Jackson Laboratories), som har den samme genetiske baggrund som CT26 adenocarcinomaceller. Dyrene blev givet fri adgang til vand og blev overvåget nøje for kliniske tegn på dårligt helbred i hele undersøgelsen. Seks uger gamle BALB /c-mus blev holdt på en Torula gærbaseret kost suppleret med passende selen (0,1 ug selen /g diæt) som natriumselenit (Harlan-Teklad, Indianapolis, IN). Efter tre uger, 5 × 10

5 CT26 celler i 200 pi PBS (

n

= 10 hver for plasmid-transficerede kontroller, shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15 celler) blev injiceret i halevenen . Dyr blev aflivet, og lunger blev undersøgt 12 dage efter injektion. Tre milliliter 15% tusch /PBS-opløsning blev injiceret i lungerne gennem luftrøret. Lungevæv blev udskåret og “bleget” med Fekete opløsning (60% ethanol, 3,2% formaldehyd, og 0,75 mol /l eddikesyre) i 48 timer. Lungelæsioner på overfladen af ​​hver lap blev talt med et dissektionsmikroskop. Lunger med . 250 læsioner blev tildelt en værdi på 250, da det er i sagens natur vanskeligt at pålideligt tælle mere end 250 læsioner /lunge [18]

microarray analyse

I alt mRNA blev isoleret fra plasmid-transficeret kontrol, shSep15, shTR1 og shTR1 /shSep15 CT26-celler. Microarray analyse blev udført på Affymetrix Mouse 430_2.0A genchips. Fire arrays blev analyseret fra fire forskellige mRNA prøver pr konstruktion. Robust Multi-Array Analyse algoritme blev anvendt til baggrund og støj korrektion i omdannelsen af ​​sonden niveau til genekspression data. Knapper og celler med målrettet nedregulering af Sep15, TR1, eller TR1 /Sep15 blev sammenlignet ved ANOVA. Gener, der var væsentligt forskellige fra plasmid-transficeret kontrol celler (

P

0,05) blev udsat for funktionel gen-analyse af Ingenuity Pathway Analysis (IPA, version 7.5), der registrerer netværk af genekspression skifter efter funktionel biologisk processer snarere end udelukkende at fokusere på de mere dramatiske ændringer i ekspressionen af ​​få udvalgte gener. Tidligere offentliggjort, og offentligt tilgængelige, blev microarray data fra et studie med Sep15 knockout-mus adgang til sammenligningsformål [7].

Statistiske analyser

Data præsenteret som gennemsnit ± SE blev analyseret ved en -Way ANOVA efterfulgt af Tukey multiple-sammenligning

post-hoc

test med GraphPad Prism (version 5, La Jolla, CA). Niveauet af signifikans blev sat til α = 0.05, og statistisk signifikante ændringer blev angivet i tal som følger:

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001 sammenlignet med kontrol. CellMiner s NCI-60 Analysis Tool, som integrerer molekylære datasæt af 60 menneskelige kræftceller rutinemæssigt anvendes til farmakologisk screening og komparative molekylære analyser, blev brugt til at identificere gener signifikant korreleret med Sep15 udtryk (https://discover.nci.nih.gov/cellminer, database version 1.4) baseret på Pearsons korrelationskoefficient med en befolkning størrelse på 60, ​​r = 0,254, og

P

0,05 uden multiple sammenligninger korrektion. Gentranskriptet ekspressionsmønstre blev også sammenlignet. CellMiner baser udskrift intensitet niveauer på målinger fra fem mikroarrays (Affymetrix HG-U95, HG-U133, HG-U133 plus 2.0, og HuEx 1.0, og Agilent Whole Human Genome Microarray) som beskrevet [25].

Resultater

Individuel og samtidig mangel på TR1 og Sep15

mus tyktarmskræft CT26 celler blev stabilt transficeret med shSep15, shTR1, shTR1 /shSep15, eller den tilsvarende pU6-M3- (tom vektor) – kontrol konstruktioner. Vi anvendte to shRNA oligonukleotider, og flere uafhængige cellekloner blev udvalgt til analyse for at udelukke ikke-tilsigtede virkninger på grund af konstruktioner eller transfektion proces, som offentliggjort [17,18]. qPCR og Western blotting viste, at Sep15 mRNA (Fig 1A, øverste panel) og protein niveauer (Fig 1A, nederste panel) var effektivt ( 90%) faldt i celler transficeret med shSep15 eller shTR1 /shSep15. qPCR, Western blotting og katalytiske aktivitetsassays viste, at TR1 mRNA (Fig 1B, øvre panel) og proteinekspression (fig 1B, nederste panel), samt katalytisk aktivitet (Fig 1C) blev nedsat med henholdsvis 90% i shTR1 og shTR1 /shSep15 celler. MRNA udtryk for glutathionperoxidaser 1 (GPx1) og 2 (GPx2) blev ikke ændret væsentligt, og selenoprotein M (Selm) blev kun let øget hos shSep15 (

P

0,05) og shTR1 /Sep15 celler (

P

0,05), som forventet (S1 fig)

Cellerne blev stabilt transficeret med kontrol af pU6-m3, shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15 (som angivet).. (A) Ekspression af Sep15 af real-time RT-PCR (øverste panel) og Western blotting (nederste panel). (B) Ekspression af TR1 af real-time RT-PCR (øverste panel) og Western blotting (nederste panel). (C) Thioredoxin reduktaseaktivitet. Kolonner, betyde (

n

= 3-6); barer, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01 sammenlignet med kontrol).

shSep15 eller shTR1 hæmme celledeling og udvikling af eksperimentelle metastaser

Anchorage-afhængig proliferation af både shSep15 og shTR1 celler var signifikant reduceret (

P

0,001) (figur 2A). I hvert tilfælde var der 60% færre celler på dag 4 sammenlignet med kontroller. Overraskende vækstmønster shTR1 /shSep15 celler svarede til kontrolceller. shSep15 og shTR1-transficerede CT26 celler dannede signifikant (

P

0,001) færre kolonier end kontrol celler i forankringsuafhængige vækst assays (figur 2B). I modsætning hertil TR1 /Sep15 knockdown ikke påvirke koloni vækst i blød agar.

(A) Vækstrater af shSep15, shTR1 og shTR1 /Sep15 celler sammenlignet med kontroller (

n

= 6) . (B) Anchorage-uafhængig vækst i blød agar af shSep15, shTR1 og shTR1 /Sep15 celler i forhold til kontrolgruppen (

n

= 4-8). (C) dannelse af eksperimentelle lungemetastaser efter i.v. injektion af 5 x 10

5 celler (kontrol, shSep15, shTR1 eller shTR1 /shSep15) i BALB /c mus (

n

= 10 /konstruktion). (

*** P

0,001 sammenlignet med kontrol).

Kontrol celler dannet et stort antal (188,6 ± 32,0) af eksperimentelle lungemetastaser i BALB /c mus ( fig 2C), som forventet. Som også tidligere vist [18], lempelse af Sep15 væsentligt (

P

0,001) inhiberede dannelse af sådanne lungemetastaser (0,5 ± 0,2). Tilsvarende shTR1 celler dannet færre eksperimentelle metastaser (2 ± 0,4) sammenlignet med kontroller (

P

0,001). Mus injiceret med shTR1 /shSep15 celler udviklede færre eksperimentelle metastaser end kontroller (100,4 ± 14,1;

P

0,001), men mere end 50 gange mere (

P

0,01) sammenlignet med dem, injiceret med enkelte knockdown celler.

shTR1 /shSep15 vender cellecyklus fænotyper observeret i enkelte knockdown celler

de mest slående cellecyklus ændringer blev observeret i shSep15 celler (fig 3A-3D), og enig med vores tidligere offentliggjorte observationer, at de væsentligste forskelle mellem shSep15 og kontrol celler dukkede omkring 24 timer tidligere frigivelse fra serum sult [18]. shSep15 celler havde en væsentligt højere procentdel af deres befolkning i G2 /M-fase (27,8 ± 0,8%) end kontrol-celler (11,5 ± 2,1%;

P

0,001), og en mindre procentdel i S- fase (25,1 ± 0,9% versus 42,3 ± 1,9%), svarende til tidligere observationer [18]. Men shTR1 og shTR1 /shSep15 celler havde færre celler i G2 /M-fase (15,6 ± 1,2% og 17,7 ± 0,7%) sammenlignet med shSep15 celler (

P

0,001). shTR1 celler, som observeret i fibroblast-afledte DT-celler tidligere [15], manifesteret defekt progression i S-fasen, synlige som en forøget procentdel af cellepopulationen ved 6 og 48 timer. CyclinB1 (CCNB1) mRNA niveauer ikke signifikant forskellig (fig 3E), men mRNA niveauerne af CyclinB1-interagerende-protein-1 (Ccnbip1) var stærkt forhøjet i shTR1 og shSep15 celler (

P

0,01), men ikke i shTR1 /shSep15 celler, sammenlignet med kontroller, henholdsvis (fig 3f)

Procent af celler i hver celle cyklus fase som bestemt ved FACS-analyse ved (A) 0 h.; (B) 6 timer; (C) 24 timer; og (D) 48 timer efter frigivelse fra celle synkronisering. mRNA udtryk for (E) CyclinB1 (

CCNB1

), og (F) CyclinB1 interagerende-protein-1 (

Ccnb1ip1

), som bestemt af real-time RT-PCR. Kolonner, betyde (

n

= 3-9); barer, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001).

genekspression analyser identificere interferon-γ- og Wnt /β-catenin-regulerede veje i shSep15 og shTR1 /shSep15 celler, henholdsvis

for at belyse de signalveje ramt af Sep15- og TR1-mangel i colon cancerceller, og tilbageførsel af disse virkninger i dobbelt knockdown-celler, blev global genekspression analyseret under anvendelse af mikroarrays (N = 4 /konstrukt). De tyve mest væsentlige ændret gen signaler er anført i S2 tabel. Udvalgte gener blev undersøgt af qPCR forhold til ekspression af en intern kontrol,

GAPDH

, at validere microarray resultater.

De mest stærkt opreguleret gen signaler i shSep15 celler interferon-induceret- protein-44 (

Ifi44

), ubiquitin-specifikke-peptidase-18 (

Usp18

), immunitet-relateret-GTPase familie-M-medlem-2 (

Irgm2

), interferon-regulatorisk-faktor-7 (

Irf7

), interferon-γ-induceret-GTPase

(Igtp

), meget stor interferon-inducerbare-GTPase

(Gvin1

), og guanylat-bindende-proteiner

GBP-1

,

-2

og

-6

. Markant øget mRNA udtryk for

Ifi44 Hotel (

P

0,001, figur 4A, øvre panel),

Irf7 Hotel (

P

0,001, fig 4B), og

Usp18 Hotel (

P

0,05, figur 4C) i shSep15 celler sammenlignet med kontroller blev valideret med qPCR. Protein ekspressionsniveauer af Ifi44 (Fig 4A, nedre panel) blev let forøget i shSep15 celler. De mRNA niveauer af

GBP-6

(

P

0,05, Fig 4D) og interferon-γ (IFN-y) (

P

0,05, Fig 4E) var signifikant højere i shSep15 sammenlignet med shTR1 /shSep15 celler. Niveauerne af GBP-1-mRNA blev tidligere rapporteret at være meget opreguleret i Sep15 knockout-mus [7]. I overensstemmelse med disse iagttagelser, fandt vi, at GBP-1-mRNA (figur 4F, øvre panel) og proteinniveauer (fig 4F, nedre panel) signifikant udelukkende blev forhøjet i shSep15 celler. Ingenuity Pathway Analyser (IPA), at inflammation-relaterede gener opreguleret i shSep15 celler delte en fælles knudepunkt i

Stat-1 Hotel (S3A Fig), og omfattede

GBP-2 Hotel (31.1 fold),

GBP-6

(30,1 gange),

Nmi

(2,8 gange),

Irgm2

(20,7 gange), og

GBP -1

(14,3 gange, indgår i ‘GBP-2 *’). Andre markant opreguleret

Stat-1

associeret gener inkluderet

Usp18 Hotel (65.1 gange),

Irf7 Hotel (9,9 gange) og

Irf9

(3,6 gange).

Stat-1

mRNA blev kvantificeret med qPCR og fundet kun at være steget betydeligt i shSep15 celler i forhold til kontrolgruppen (

P

0,01, Fig 4G, øverste panel), men protein niveauer af phosphoryleret Stat-1 forblev uændret (figur 4G, nedre panel). Stat-1 antages at fremme aktivering af forskellige caspaser, og mRNA-niveauer af caspase 6 (fig 4H) og caspase 12 (fig 4I) blev øget væsentligt kun i shSep15 celler (

P

0,05). Støtte dette mønster af involvering af interferon-γ og Sep15 er yderligere sammenligninger med vores tidligere offentliggjorte microarray data [7], som viste en beskeden, men signifikant (

P

0,05) øget mRNA-ekspression af interferon-γ- reguleret Stat-1, Stat-5A, IRF-2, og IRF-3, i Sep15 knockout-mus (N = 4) sammenlignet med kuld mate kontroller (N = 4). Genet mest markant nedreguleret i shSep15 celler var alfa-føtoprotein (

AFP

). Interessant, mRNA-niveauer af

Afp

blev forøget 1,5 gange i shTR1 /shSep15 celler, som bestemt ved qPCR (Fig 4J), men protein niveauer forblev uændret (S2A Fig).

Angivelse af ( A) Ifi44 mRNA (øverste panel) og protein (nederste panel); (B) IRF-7 mRNA; (C) Usp18 mRNA; (D) GBP-6-mRNA; (E) IFNy mRNA; (F) GBP-1-mRNA (øverste panel) og protein (nederste panel); (G) Stat-1-mRNA (øverste panel) og protein (nederste panel); (H), Casp6 mRNA; (I) Casp12 mRNA; og (J) Afp mRNA. Ekspression af mRNA i kontrol, shSep15, shTR1, og shTR1 /Sep15 celler blev bestemt ved real-time RT-PCR, og udtrykt i forhold til

GAPDH

. Kolonner, betyde (

n

= 3-6); barer, SE; (

* P

0,05,

** P

0,01,

*** P

0,001). Proteinekspression blev bestemt ved Western blotting, og udtrykt i forhold til p-actin eller α-tubulin, som angivet.

I microarray analyser, gener med væsentligt ændret ekspression i shTR1 celler sammenlignet med kontroller (S2 tabel) inkluderet chemokinreceptor-typen-1 (

CCR1

, 9,0-fold), som også blev forøget i shTR1 /shSep15 celler (5,1 gange), og det stribede fortrinsvis udtrykt-genet (

SPEG

5,8 gange), som er kendt for at inhibere celleproliferation [26]. Efterfølgende qPCR analyser viste en omkring to gange stigning i SPEG mRNA-ekspression i shTR1 celler i forhold til kontrolgruppen (

P

= 0,09, figur 5A), og kun signifikante stigninger i CCR1 mRNA-ekspression i shTR1 /Sep15 celler sammenlignet med kontroller (

P

0,001, figur 5B). MRNA niveauer af cellecyklus regulator

Ccnb1ip1

, som også tidligere er rapporteret som dramatisk forøget i shSep15 CT26 celler [18], blev også forøget i shTR1 celler (

P

0,01, fig 3F). Usp18 mRNA udtryk, som microarray analyser identificeret som 16 gange højere (

P

= 0,09) i shTR1 celler, blev også signifikant forøget (

P

0,05) som valideret af qPCR (Fig 4C). Væsentlige gen ændringer i shTR1 celler indeholdt de involverede i DNA-reparation, redox regulering, ATP-bindende kassette transport, ubiquitinering og kræftrelaterede veje

mRNA niveauer af (A) SPEG.; (B) CCR1; og (C) Tnc; og (D) APC i kontrol, shSep15, shTR1, og shTR1 /Sep15 celler, som bestemt ved real-time RT-PCR, og udtrykkes i forhold til

GAPDH

. Kolonner, betyde (

n

= 3-6); barer, SE; (

** P

0,01,

*** P

0,001).

Kombineret nedregulering af Sep15 og TR1 resulterede i temmelig uventet ændringer. Microarray analyser viste, at den mest up-regulerede gener, der udelukkende blev ændret i shTR1 /shSep15 celler (S2 tabel) sammenlignet med kontroller blev tenascin (

Tnc

, 9,0-fold) og mitogen-regulerede prolactin-familie -2 underfamilie-c-medlem-2 (

Prl2c2

, 7,5 gange). Væsentlige opregulering af tenascin mRNA (

P

0,01) blev efterfølgende verificeret af qPCR (figur 5C). IPA blev udført for de 984 gen signaler, der var signifikant forskellig mellem shTR1 /shSep15 og kontroller, men var ikke anderledes i nogen af ​​de enkelte-knockdown celler versus kontroller. To netværk involveret i

Apc /Wnt /β-catenin

veje blev identificeret (S3B og S3C Fig), som kan kompensere for samlet underskud på Sep15 og TR1. Interessant, tenascin blev indirekte netværk med

Wnt

(S3C Fig). Ekspressionsniveauer af den adenomatøs polypose coli-gen (

APC

, S3B Fig) og den negative regulator af wingless-typen (

Wnt Salg) gener,

Axin1

, var signifikant men kun i beskedent omfang reduceret (1,4 gange henholdsvis) i microarray analyser. Efterfølgende qPCR ikke afsløre eventuelle forskelle i

Apc

mRNA-ekspression blandt konstruktioner (Fig 5D). Andet

Wnt

-type gener (

e

.

g

.,

Wnt10a

) og β-catenin-interagerende protein-1 (

Ctnnbip1

) var signifikant opreguleret (1,9 gange og 1,6 gange henholdsvis) i microarray-analyser. Men protein niveauer af sig selv phosphoryleret β-catenin, som analyseret gennem Western blotting, dukkede op, uændret (S2B Fig).

Sep15 udtryk er negativt korreleret med Stat-1 /Stat-2 og Usp18 i NCI-60 celle linjer

i de NCI-60 cellelinjer, CellMiner negativt korreleret (

P

0,05) mRNA ekspressionen af ​​Sep15, men ikke TR1, med Stat-2 (Pearsons koefficient: -0,29) og med Usp18 (Pearsons koefficient: -0,43), den næsthøjeste opreguleret gen signal i celler, der mangler Sep15. Sammenligning af cellelinje underskrifter viste, at de modsatrettede retninger af mRNA udskrift intensitet score (z-scores) for Sep15 og Stat-1 (figur 6) var særligt signifikant (r = -0,65,

P

0,01) for humane cancercellelinier afledt fra centralnervesystemet, leukæmi og ovariecancere. Stat-1 protein niveauer i NIC-60 cellelinjer støttede den negative korrelation med Sep15 mRNA-ekspression (figur 6).

modsatte retninger af udskrift intensitet score (z-scores) for Sep15 og Stat-1 mRNA var meget signifikant (r = -0,646,

P

0,01) til human centralnervesystemet (CNS), leukæmi og æggestokkene kræft cellelinjer. Mean centreret gennemsnitlige protein aktivitet mønstre for Stat-1 (Stat-1_20 antistof) signifikant korreleret (r = 0,661,

P

0,01). Med Stat-1 mRNA-ekspression

Diskussion

Vores mål har været at forstå roller selenoproteiner Sep15 og TR1 i kræft initiering og udvikling [8,11,17-19,27]. Den aktuelle undersøgelse udsatte uventede kompleksitet og samspillet mellem disse to selenoproteiner i deres regulering af tyktarmskræft. I lyset af fordelene ved øget selen indtag findes i forebyggelse tyktarmskræft [28,29], og de kontroversielle resultater i den seneste humane kliniske forsøg SELECT [30], hvor ingen fordele blev fundet, vores resultater er særligt relevante som kosten selen kræft -preventive egenskaber primært medieret gennem selenoproteiner [31].

selenoproteiner Sep15 og TR1 har vigtige roller i cellulær redox-homeostase. Forskellene mellem disse to systemer er klart af

in vivo

undersøgelser. En fuldstændig mangel på cytosolisk TR1 er embryonale dødbringende [12], mens en systemisk Sep15 mangel ikke resulterer i en indlysende fænotype i andre end dannelsen af ​​grå stær [32] mus. Målrettet nedregulering af disse to gener indeholder effektive midler til at undersøge deres funktion, regulering og interaktioner. Vores resultater i mus kolon kræftceller viser, at forskelle i cellecyklus regulering kan have delvist bidraget til tilbageførsler af de observerede kræft fænotyper. den underliggende mekanisme fremkalde denne fænotype synes imidlertid at variere mellem celler, der mangler Sep15 versus dem mangler TR1. Sep15 manglen er tidligere fundet at inhibere celleproliferation i mus [18] og humane coloncancer-celler [19], men ikke i muse lungecancerceller [18]. I modsætning hertil manglende TR1 reducerede signifikant væksten af ​​muse lungecancerceller [17]. (

P

0.05).

doi:10.1371/journal.pone.0124487.s005

(DOCX)

Acknowledgments

We