PLoS ONE: chemokin CXCL16 og dets receptor, CXCR6, som markører og Promoters af inflammationsassocierede Cancers

Abstrakt

Kliniske observationer og musemodeller har antydet, at betændelse kan være pro-tumorigen. Da kemokiner er kritiske i leukocyt menneskehandel, vi hypotese, at kemokiner spiller afgørende roller i inflammationsassocierede kræftformer. Screening for 37 chemokiner i prostatacancercellelinjer og xenotransplantater afslørede CXCL16, liganden for receptoren CXCR6, som mest konsekvent udtrykt chemokin. Immunhistokemi og /eller immunofluorescens og konfokal billeddannelse af 121 humane prostata prøver viste, at CXCL16 og CXCR6 blev co-udtrykt, både på prostatacancerceller og tilstødende T-celler. Ekspressionsniveauer af CXCL16 og CXCR6 på kræftceller korreleret med dårlige prognostiske funktioner, herunder high-scene og høj kvalitet, og udtryk også korreleret med post-inflammatoriske forandringer i kræft stroma som afsløret ved tab af alfa-glatmuskelactin. Desuden CXCL16 øget vækst af CXCR6-udtrykkende cancer og primære CD4 T-celler. Vi studerede ekspression af CXCL16 i yderligere 461 prøver, der dækker 12 tumortyper, og fandt, at CXCL16 blev udtrykt i flere humane cancere forbundet med inflammation. Vores undersøgelse er den første til at beskrive ekspressionen af ​​CXCL16 /CXCR6 på begge kræftceller og tilstødende T-celler i mennesker, og at demonstrere sammenhænge mellem CXCL16 og CXCR6 vs. fattige både prognostiske funktioner og reaktive forandringer i kræft stomi. Tilsammen vore data antyder, at CXCL16 og CXCR6 kan markere cancere opstår i en inflammatorisk miljø og mediere pro-tumorigene virkninger af inflammation gennem direkte indvirkning på væksten af ​​cancerceller og ved at inducere migrationen og proliferationen af ​​tumorassocieret leukocytter.

Henvisning: Darash-Yahana M, Gillespie JW, Hewitt SM, Chen Y-YK, Maeda S, Stein I, et al. (2009) chemokin CXCL16 og dens receptor, CXCR6, som markører og Promotorer af inflammationsassocierede kræftformer. PLoS ONE 4 (8): e6695. doi: 10,1371 /journal.pone.0006695

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA

Modtaget: April 6, 2009; Accepteret: 21 Juli 2009; Udgivet: 19 August, 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural Research Program for National Institute of Health, National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme og National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Seneste musemodeller har lavet en funktionel sammenhæng mellem kræft og inflammation [1] – [3], som bevis for en tumor-fremmende aktivitet for leukocytter, som oprindeligt foreslået af Rudolf Virchow [4], [5]. Human prostatacancer er blevet postuleret at hidrøre fra præcancerøse processer associeret med inflammation, såsom proliferativ inflammatorisk atrofi (PIA) [6], som er fundet læsioner tilstødende til prostatacancer, der er foreslået at føre til prostata intraepitelialneoplasi (PIN) eller cancer [ ,,,0],7]

Blandt de faktorer vigtige for inflammation er chemokiner -. kemotaktiske cytokiner, som medierer leukocytrekruttering [8]. Diverse roller er blevet rapporteret for kemokiner i tumor biologi, herunder direkte effekter på cancerceller, såsom på transformation, overlevelse og spredning, og indirekte virkninger, såsom i angiogenese og rekruttere leukocytter til tumor sites [9] – [11] . I lyset af den nylige beviser for mulig pro-tumorigen aktivitet af leukocytter, vi hypotese, at inflammatoriske chemokiner, enten produceret af tumorcellerne eller af tumorassocieret leukocytter, kan, i modsætning til standard synspunkt, bidrage til malign progression ved at øge leukocytrekruttering .

i undersøgelserne er beskrevet nedenfor, en screening for ekspression af 37 chemokiner i prostatacancercellelinjer og xenotransplantater viste ekspression på højt niveau af CXCL16, en usædvanlig kemokin, der eksisterer i både transmembrane og opløselige former [12], [13], og det kan også fungere som en scavenger receptor for oxideret lipoprotein og bakterier [14]. CXCL16 ekspression er blevet associeret med en række humane inflammatoriske sygdomme, herunder rheumatoid arthritis [15], [16], interstitiel lungesygdom [17], [18], atherosclerose [19] – [23], koronararteriesygdom [24], [25] og leverskade [26] – [30]. Den CXCL16 receptoren, CXCR6, er blevet rapporteret at blive udtrykt på Th1-celler [31], på tumorinfiltrerende lymfocytter [32], og på en række leukocytter i betændt væv sites [33], [34], og kan tjene som en co-receptor for HIV-1 [32], [35].

Vores undersøgelse tyder på direkte roller for CXCL16-CXCR6 om prostatakræft ved at demonstrere co-lokalisering af CXCL16 og CXCR6 på kræftceller, finde betydelige positive korrelationer mellem udtryk for CXCL16 og CXCR6 vs. scenen og kvalitet af prostatakræft, og viser, at CXCL16 kan stimulere væksten af ​​prostata cancer cellelinjer transficeret til at udtrykke CXCR6.

Vores undersøgelser om forholdet mellem CXCL16 /CXCR6, inflammation og cancer viser, at CXCL16 opreguleres på præ-neoplastiske læsioner associeret med inflammation, at ekspressionen af ​​CXCL16 og CXCR6 kan induceres i prostata epitel af inflammatoriske cytokiner, og at CXCL16 /CXCR6 er højest i de prostatacancerceller omgivet ved reaktiv, dvs. post-inflammatorisk stroma. Vi viste ligeledes, at T-celler tilstødende til cancerceller udtrykker CXCL16 /CXCR6, at CXCL16 produceres fortrinsvis ved CD4

+ CXCR6

+ T-celler, og at CXCL16 kan øge proliferation af T-celler. Endelig demonstrerer vi CXCL16 i flere humane kræftformer forbundet med inflammation. Sammen vores data tyder på, at CXCL16 og CXCR6 kan bidrage til tumor progression direkte gennem effekter på kræft cellevækst, og indirekte ved at øge leukocyt rekruttering og spredning og samspillet mellem leukocytter og præmaligne /maligne celler.

Resultater

Ondartede prostata celler udtrykker CXCL16 og CXCR6

for at undersøge de roller, kemokiner i prostatakræft, vi screenede prostatakræft cellelinjer og xenografter for ekspression af mRNA for 37 kemokiner, og fandt, at mRNA’et for CXCL16 var den mest konsekvent udtrykt (figur 1A, B). Celleoverfladeekspression af CXCL16 blev fundet på PC3, DU145 og 22Rv1 prostata cellelinjer (figur 1C). Immunohistokemisk analyse af prostatavæv viste lav eller ingen farvning for CXCL16 og lav farvning for dets receptor, CXCR6 i normal human prostata epitel, men fremtrædende ekspression i canceren (figur 1D). Desuden blev en korrelation mellem ekspressionsniveauerne af CXCL16 og CXCR6 findes ved at analysere en opstilling af fyrre tilfælde af prostatakræft, og CXCL16 og CXCR6 kan påvises skal co-udtrykkes på individuelle cancerceller ved immunofluorescens konfokal mikroskopi (figur 1E) .

(A) udtrykket af mRNA’er for 37 kemokiner blev undersøgt ved RT-PCR i xenografter (CWR22, WISH PC14) og prostata tumor cellelinier (PC3, DU145, LNCaP). Systematiske og ikke-systematiske navne for chemokiner er vist. Amplikoner blev analyseret ved agarosegelelektroforese og visuel inspektion efter farvning med ethidiumbromid. Sekvenser af primere er tilgængelige på anmodning. Niveauerne af ekspression blev vurderet som følger: ingen ekspression (-), lav ekspression (- +), moderat ekspression (+), og høj ekspression (++). Afhængigt af kemokin blev analysen udført fra én til fire gange. (B) mRNA-ekspression af kemokiner i prostata cancercellelinjer. Udtrykket af mRNA’er for 14 kemokiner blev undersøgt ved real-time RT-PCR på fire prostata tumor cellelinier (PC3, DU145, LNCaP, 22Rv1). Værdien af ​​2

-ΔCT blev beregnet og derefter normaliseret til det højeste tal for en given cellelinie, som fik værdien af ​​100, hvor ACt = CT (chemokin) -CT (GAPDH). Tal er gennemsnit af to bestemmelser fra en repræsentant eksperiment af to udført. (C) Flowcytometrisk analyse af overfladevand udtryk for CXCL16 på prostata cancer cellelinjer. PC3, blev 22Rv1 og DU145 celler inkuberet uden primært antistof (sort skygge), med gede-anti-humant CCL4 som yderligere kontrol (lysegrå linje), eller med gede-anti-human CXCL16 (mørkegrå linje) og derefter farvet med kanin-anti -goat IgG-FITC. Data er fra et repræsentativt eksperiment af tre udførte. (D) Farvning for CXCL16 og CXCR6 i prostatektomerede prøver vha DAB (brun) til detektion er vist for: normal prostata og prostatakræft. Paneler er repræsentative for mere end 80 undersøgte prostatakræft tilfælde. Hvert panel indeholder en H 0,05 og **, p 0,01. (II) Immunofluorescens og konfokal billeddannelse af et afsnit viser prostatacancerceller viser anti-CXCL16 (488 tyramid) som grøn, anti-CXCR6 (594 tyramid) som rød, og nuklear farvning med Hoechst 33258 som blå. Dobbelt farvning i gule shows co-lokalisering. Paneler er repræsentative for mere end 15 tilfælde af prostatacancer. Originale forstørrelser er noteret på disse og alle efterfølgende mikrofotografier.

Angivelse af CXCL16 og CXCR6 korrelerer med kræft scene og kvalitet

Scenen (I-IV) og bedømmelse (Gleason score) af prostatakræft bestemmes ved diagnose, og blev rapporteret af leverandøren i de tilfælde, der anvendes i arrays. Højere stadie svarer til større anatomisk forlængelse af kræft, og Gleason score beskriver histologiske karakteristika, der korrelerer med kliniske resultat. Gleason score på 2-4 er lav kvalitet, scores 5-7 er moderat kvalitet, og scores 8-10 er af høj kvalitet prostatakræft. Analyse af 40-case-array for niveauer af farvning for CXCL16 og CXCR6 afslørede, at deres ekspression af cancercellerne korrelerede med både høj-fase og high-grade prostatacancer (figur 2A). Salg

(A) Arrays indeholder prostatakræft væv fra 40 patienter blev farvet for CXCL16 og CXCR6. Prøver blev bedømt for CXCL16 og CXCR6 ekspression som beskrevet i Materialer og Metoder. Prøverne blev grupperet efter scenen eller Gleason score (X-akse), som bestemt af leverandøren, og betyde scorer for CXCL16 og CXCR6 udtryk blev beregnet. Antallet af prøver (n) i hver fase eller Gleason score gruppen vises. Fejlbjælker viser SEM. Cross-bjælker angiver sammenligninger, der er væsentlige. *, P 0,05 og ***, s 0,001. (B) PC3-celler blev transficeret med CXCR6-YFP plasmid, dyrket i 48 timer uden kemokin (kontrol, ctrl) eller med 0,05-5 ug /ml CXCL16 og antal CXCR6-YFP

+ (R6YFP

+ ) vs. CXCR6YFP

– (R6YFP

-) celler blev talt som beskrevet i Materialer og Metoder. Værdier blev normaliseret til kontrollen, ubehandlede prøve til opnåelse af ganges forskel i celleantal. Søjler viser middel ± SEM kombineret fra tre forsøg. **, P 0,01 og ***, s 0,001 vs. kontrolværdier. (C) Efter transfektion med CXCR6-YFP plasmid, PC3-celler blev dyrket som i (B), uden eller med 5 ug /ml CXCL16. Venstre panel, er gating vist for at adskille ubehandlede og CXCL16-behandlede celler i “lav” (L) eller “høj” (H) for CXCR6-YFP. Procentdele af celler i de høje porte er vist. Et repræsentativt eksperiment er vist ud af tre udførte. Højre panel, CXCR6-YFP

+ lav (CXCR6 + lav) og CXCR6-YFP

+ høj (CXCR6 + høj) celler fra CXCL16-behandlede kulturer og kontrolkulturer blev talt efter 48 timer som i (B). Data blev kombineret fra tre forsøg. *, P 0,05 og ***, s 0,001 vs. ubehandlede celler. (D) Konfokal imaging viser anti-CXCL16 eller anti-CXCR6 (488 tyramid) som grøn, anti-Ki67 (594 tyramid) som rød, og nuklear farvning med Hoechst 33258 som blå. Panel er repræsentativ for mere end 15 sager.

En rolle for CXCL16 /CXCR6 i spredning af prostatacancerceller

co-ekspression af CXCL16 og CXCR6 på prostata kræftceller, og deres korrelation med kræft scene og klasse, foreslog, at liganden og receptoren kan øge spredningen gennem en autokrin vej. For at undersøge denne mulighed, transficerede vi PC3-celler med et CXCR6-YFP plasmid, der koder for et CXCR6 C-terminalt fusionsprotein med en forbedret gulgrøn fluorescerende protein (YFP) og inkuberet cellerne med CXCL16. Som vist i figur 2B er antallet af CXCR6-YFP

+ -celler steg, vs. kontrol CXCR6-YFP

– celler, som funktion af koncentrationen af ​​CXCL16. Vi analyserede også forholdet mellem udtryk niveau af CXCR6-YFP og reaktionen på CXCL16. Vi fandt, at mens celler, der udtrykker de højeste niveauer af CXCR6-YFP var de mest lydhøre over for CXCL16, CXCL16 øget spredning af selv de celler, der var CXCR6-YFP

lav (Figur 2C). I overensstemmelse med disse in vitro-data, kræftceller, der udtrykker Ki67, en cellulær markør for proliferation, udtrykte også både CXCL16 og CXCR6 (figur 2D).

Angivelse af CXCL16 /CXCR6 er forbundet med betændelse

immunohistokemisk analyse af flere prøver fra radikale prostatektomi viste fremtrædende ekspression af CXCL16 og CXCR6 i kronisk prostatitis og i atrofi med tilhørende kronisk prostatitis (PIA), såvel som i prostata intraepitelialneoplasi (PIN) og cancer, hvilket antyder, at ekspression af CXCL16 og CXCR6 på prostata epitelceller er relateret til inflammation ud over en eventuel association med malignitet per se (figur 3A). Vi undersøgte dette forhold in vitro ved behandling af kulturer af epitel (Prec) og stromale celler (PRSC) fra normale prostata med inflammatoriske cytokiner. TNF-α og IFN-γ, især i kombination, induceret CXCL16 mRNA og CXCL16 sekretion med Prec (men ikke stromaceller) (figur 3B, C) – og førte til dramatiske opregulering i Prec af mRNA’et for CXCR6 (figur 3D .)

(A) Farvning for CXCL16 og CXCR6 i prostatektomi prøver vha DAB (brun) til påvisning er vist for: kronisk prostatitis, PIA og PIN-kode. Paneler er repræsentative for over 80 prostatakræft tilfælde undersøgte. Hvert panel indeholder en H 0,05 og **, p 0,01 vs. ubehandlede celler. (C) CXCL16 mRNA-ekspression i Prec fra tre donorer og to prostata tumorcellelinjer (DU145 og PC3) behandlet med 5 ng /ml IFN-γ og 0,5 ug /ml TNF-α alene og i kombination blev analyseret under anvendelse real-time RT -PCR. Værdier blev normaliseret ved at sætte kontrolprøven med laveste ekspression lig med 1. Hver bjælke repræsenterer middelværdien ± SEM opnået fra dobbelte brønde fra et repræsentativt eksperiment af tre udførte. **, P 0,01 vs. ubehandlede celler. (D) CXCR6 mRNA-ekspression i Prec fra tre donorer behandlet med 5 ng /ml IFN-γ og 0,5 ug /ml TNF-α alene og i kombination blev analyseret under anvendelse real-time RT-PCR. Værdier blev normaliseret ved at sætte prøven med laveste ekspression lig med 1. **, p 0,01 vs. ubehandlede celler. (E) Hver række indeholder serielle snit fra de samme områder i prostatektomi prøver farvet ved hjælp af DAB (brun) for αSMA, CXCL16, og CXCR6 herunder en H 0,05

Ud over den sammenslutning af CXCL16 /CXCR6 med inflammatoriske infiltrater i prostata, vores første indtryk fra at analysere mere end 80 tilfælde af prostatakræft var, at ekspressionen af ​​CXCL16 var højest i cancerceller omgivet af reaktiv stroma. Stroma er beskrevet som “reaktiv”, hvis det viser stigninger i myofibroblasts, at fibroblast glat muskel-forhold og lokal vaskulær densitet [36]. Dette sker følgende inflammation, og identificerer kræftformer, nu relativt fattige i inflammatoriske celler, der er opstået i en inflammatorisk mikro-miljø. Vi bekræftede vores første indtryk ved farvning serielle sektioner for CXCL16, CXCR6 og alfa glatmuskelactin (α-SMA), en markør for glatte muskelceller, som er tabt fra reaktive stroma. Vi fundet en sammenhæng mellem tab af glatte muskelceller og høj ekspression af CXCL16 og CXCR6 (figur 3E), som blev bekræftet ved at lave prøver i 40 tilfælde array til α-SMA, CXCL16, og CXCR6 (figur 3F). Disse data støttede sammenhængen mellem ekspressionen af ​​CXCL16 og CXCR6 og dokumentation for forudgående betændelse i tumoren mikro-miljø. Sammen data i figur 3 tyder på en stærk sammenhæng mellem udtryk for CXCL16 /CXCR6 og inflammation på alle stadier i udviklingen af ​​prostatakræft.

En rolle for CXCL16 /CXCR6 i interaktioner mellem kræftceller og T-celler

De mulige direkte effekter af CXCL16 /CXCR6 om prostatacancerceller trods fordi CXCR6 kan bedst beskrives som en T-kemokinreceptor, undersøgte vi aktiviteter for CXCL16 /CXCR6 om prostata-cancer associeret T-celler, der kan bidrage indirekte til dannelse og vækst af kræft. Immunfluorescensfarvning viste, at både CXCL16 og CXCR6 udtrykkes på CD3

+ -celler støder op til cancerceller (figur 4A). Af interesse, fandt vi, at nogle CD3

+ -celler også farvet for Ki67 (figur 4B), hvilket viser T-celleproliferation på tumorstedet. Endvidere dobbelt farvning for CXCR6 og Ki67 afslørede inflammatoriske celler, der var positive for begge (figur 4C).

(A, B) Konfokal afbildning viser anti-CXCL16 (A, venstre panel) eller anti-CXCR6 (A , højre panel) eller anti-Ki67 (B) som grøn (488 tyramid), anti-CD3 (594 tyramid) som rød, og nuklear farvning med Hoechst 33258 som blå. Dobbelt farvning i gule shows co-lokalisering. I (A), pilene peger på cancerceller og T-celler. Paneler er repræsentative for mere end 15 tilfælde for hver dobbelt-pletten. (C) Farvning for Ki67 og CXCR6 i en region af prostatitis hjælp DAB (brun, to venstre paneler) eller immunofluorescens (højre panel) til detektion. Konfokal imaging viser anti-CXCR6 som grøn (488 tyramid) og anti-Ki67 som rød (594 tyramid), og nuklear farvning med Hoechst 33258 som blå. Panel er repræsentativ for mere end 15 sager.

Vi overvejede, om CXCL16 og CXCR6 kan fungere i en autokrin måde at øge T-celle proliferation analogt med virkninger på kræftceller. For at bestemme hvorvidt CXCL16 kunne fremstilles ved CXCR6

+ celler, som kun findes i effektor /hukommelse delmængde, vi sorteret populationer af perifert blod CD4

+ T-celler baseret på ekspressionen af ​​hukommelses- og naive markører og CXCR6. Efter aktivering

ex vivo

, fandt vi, at mRNA’et for CXCL16 blev induceret fortrinsvis inden for effektor /hukommelse delmængde og inden for dette undersæt, i cellerne, der udtrykker CXCR6 (figur 5A). Vi næste testede potentielle aktiviteter af CXCR6 på T-celler ved transfektion af Jurkat E6.1 T-cellelinie med DNA, der koder CXCR6-YFP eller GFP. CXCR6-YFP

+, men ikke CXCR6-YFP

– celler, migreret til CXCL16 i en G

i /o-protein afhængig måde (figur 5B), og viste en gradvis stigning i celletal med stigende doser af CXCL16, men ikke med en kontrol kemokin (figur 5C). CXCL16 havde ingen virkning på celler transfekteret til at udtrykke GFP som en yderligere kontrol (data ikke vist). CXCL16 /CXCR6 forøget proliferation per se, eftersom vi oplevede ingen effekter på celledød (figur 5D) og fundet en stigning specifikt i populationen af ​​celler, som blev delende (figur 5E).

(A) CD4

+ T-celler blev sorteret i naiv (CD45RO), total effektor /hukommelse (CD45RO +), CD45RO

+ CXCR6

– (CXCR6-) og CD45RO

+ CXCR6

+ (CXCR6 +) delmængder og stimuleret med PMA og ionomycin i 4 timer før måling niveauer af CXCL16 mRNA ved real-time RT-PCR. Værdier blev normaliseret ved at sætte prøven med laveste ekspression lig med 1. Dataene er gennemsnit fra dobbelte prøver fra et repræsentativt eksperiment ud af tre udført. (B) Jurkat E6.1 T-celler transficeret med CXCR6-YFP plasmid blev analyseret for migration til CXCL16. Nogle prøver blev præinkuberet i to timer med 400 ng /ml pertussis toksin som angivet. Antal YFP + og YFP- migrerende celler blev analyseret ved flowcytometri. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM opnået fra tredobbelte brønde fra et repræsentativt eksperiment af tre udførte. ***, P 0,001 vs. den tilsvarende kontrol værdi. (C) Efter transfektion med CXCR6-YFP plasmid, Jurkat E6.1 T-celler blev dyrket i 48 timer uden chemokin (kontrol, ctrl) eller med 1 pg /ml CXCL8 som en ekstra kontrol, eller med 0,05-5 mg /ml CXCL16 før tælle antal CXCR6-YFP

+ vs. CXCR6-YFP

– celler. Søjler viser middel ± SEM kombineret fra tre forskellige eksperimenter. *, P 0,05 og ***, s 0,001. (D) Transficerede celler blev behandlet som i (C) og farvet med Annexin V og propidiumiodid (PI) før tælling antal CXCR6-YFP

+ -celler inden undergrupperne som bemærket. Søjler viser middel ± SEM kombineret fra tre forsøg. **, P 0,01 og ***, s 0,001 vs. kontrol ubehandlede celler. (E) Efter transfektioner med CXCR6-YFP plasmid blev Jurkat E6.1 T-celler fyldt med 2 uM Far Red DDAO farvestof og dyrket uden chemokin (kontrol, ctrl) eller med 0,05-5 mg /ml CXCL16 eller 1 pg /ml CXCL8 . Antal CXCR6YFP

+ vs CXCR6YFP

+ DDAO

– (spredt) og CXCR6YFP

+ DDAO

+ (ikke-spredt) blev bestemt celler efter 48 timer ved hjælp af optælling perler og flowcytometri . Søjler viser middel ± SEM fra tredobbelte brønde fra et repræsentativt eksperiment af tre udførte. ***, P 0,001 og *, p 0,05 vs. kontrol ubehandlede celler

Desuden, når vi undersøgte effekten af ​​pladen-bundne CXCL16 om spredning af CD3-aktiverede primære CD4 T. celler, fandt vi en signifikant stimulerende virkning på proliferation, der blev inhiberet ved behandling med pertussis toksin eller antistoffer mod CXCR6 eller CXCL16 (figur 6A). Det er bemærkelsesværdigt, eftersom CXCL16 syntetiseres som et transmembran chemokin, at selv pladebundet CXCL16 var stimulerende, opløselig CXCL16 havde ingen effekt (data ikke vist). Salg

(A) CD4

+ T-celler oprenset fra elutrierede lymfocytter fra raske donorer blev stimuleret i 3 dage med pladebundet anti-CD3 (OKT3, 10 ug /ml) med eller uden 5 ug /ml pladebundet CXCL16 (bL16). Behandlinger af anti-CD3-aktiverede celler med PTX, anti-CXCR6 (AR6) og anti-CXCL16 (aL16) uden bL16 blev udført som kontroller. Muse IgG (mIgG) og rotte IgG (Rigg) blev anvendt som kontroller for anti-CXCR6-antistof og anti-CXCL16 antistof hhv. Barer viser middel ± SEM fra en repræsentativt forsøg ud af fem, at bruge fem donorer. Anti-CXCL16 blev anvendt i alt fire, og anti-CXCR6 i to forsøg. ns, ikke signifikant og ***, s 0,001. (B) CXCR6 og CXCL16 mRNA’er blev målt ved real-time RT-PCR i CD3-aktiverede og ikke-aktiverede CD4

+ T-celler efter 3 dage. Værdier blev normaliseret ved at sætte ikke-aktiveret prøve med laveste ekspression lig med 1. søjler viser middelværdier ± SEM kombineret fra dobbelte brønde fra syv forskellige donorer. **, P 0,01 og ***, s 0,001 vs. ikke-aktiverede celler. (C) Anti-CD3-aktiverede eller ikke-aktiverede CD4

+ T-celler blev analyseret for migration til CXCL16, udtrykt i procent af input celler migrerer. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM opnået fra tredobbelte brønde fra i alt tre eksperimenter udført. ***, P 0,001 om tværstænger er angivet for sammenligninger mellem aktiverede celler – 0 vs. 50 ng /ml CXCL16 og 50 ng /ml vs. 500 ng /ml CXCL16

På trods af den. data for effekter af CXCL16 på aktiverede CD4

+ T-celler, kunne vi ikke påvise farvning for CXCR6 anvendelse af flowcytometri på en stor eller større procentdel af disse celler efter aktivering. Men til støtte for funktionel CXCR6 på disse celler, fandt vi en signifikant stigning i mRNA-ekspression af CXCR6 og (i mindre grad) af CXCL16 i CD3-aktiverede celler (figur 6B), og en stigning i migrationen af ​​de CD3-aktiverede celler til CXCL16 (figur 6C). Dosis respons i figur 6C har klokkeformet mønster typisk for kemotaksi.

CXCL16 og /eller CXCR6 er bredt udtrykt i inflammationsassocierede kræftformer

For at undersøge muligheden for en mere generel forbindelse mellem CXCL16 og inflammation-associeret cancer, studerede vi ekspressionen af ​​CXCL16 i 582 tilfælde af kræft, der dækker 12 tumortyper (figur 7). Vi fandt en bias for høj CXCL16 ekspression i cancere forbundet med inflammation:. Ovarie, bryst, prostata, tyktarm og leverkræft

(A) * Intensiteten af ​​CXCL16 farvning blev bedømt som beskrevet i Materialer og Metoder. Den% af tilfældene farvning høj er vist for hver cancertype. ** RCC, nyrecellecarcinom; GBM, glioblastoma multiforme. (B) CXCL16 ekspression i arrays af multiple humane cancere ved immunohistokemi under anvendelse af AEC (rød) eller DAB (brun) til detektion. Paneler er repræsentative for antallet af prøver på de forskellige kræftformer som anført i (A).

Diskussion

Kræft skyldes genetiske mutationer og epigenetiske begivenheder i de prolifererende celler og ændringer i tumorens mikromiljø, der omfatter kapillærer, glatte muskelceller, fibroblaster og inflammatoriske celler [4]. I 1863, den tyske læge Rudolf Virchow bemærkede leukocytter i neoplastiske væv og hypotese, at kræft begynder på steder af kronisk inflammation [37]. Ikke desto mindre har kræft immunologer generelt betragtet leukocytter som agenter med potentiale til at begrænse eller eliminere kræft [38]. Tilsvarende i deres rolle som mediatorer af leukocytrekruttering, chemokiner er blevet undersøgt som stimulatorer af immunitet mod cancer og inflammation [11], [39], [40].

Kroniske inflammatoriske tilstande har dog været vist at prædisponere til flere typer cancer og tilbagevendende eller kronisk inflammation er blevet impliceret i en række forskellige humane cancere [5]. Nylige musemodeller har lavet en funktionel sammenhæng mellem kræft og inflammation, der viser, at sletning af immunceller eller immunregulerende gener reducere kræft progression [1] – [3]. Tilsammen udgør disse data hæve mulighed for en ekstra rolle for proinflammatoriske chemokiner i cancer, nemlig som tumorpromotorer.

Vi undersøgte prostatacancer, der beskrives som opstår i forbindelse med inflammation. Vores indledende screening for chemokinekspression foreslået en rolle for CXCL16, og vi fandt, at både CXCL16 og CXCR6 blev co-udtrykt på cancerceller, at deres ekspressionsniveauer korreleret med hinanden, og at disse niveauer også korrelerede med høj fase og høj -Grade prostatacancer. Desuden CXCL16 forøget proliferation af prostatakræft-cellelinier, der udtrykker CXCR6. Vore data tyder på mulige direkte effekter af CXCL16 /CXCR6 på cancercellevækst og dermed på tumorudvikling.

I et andet aspekt af vores undersøgelse undersøgte vi potentielle roller for CXCL16 /CXCR6 inden for rammerne af den postulerede bidrag inflammation til præmaligne og maligne sygdomme i prostata. Vi fandt høj ekspression for CXCL16 i kronisk prostatitis, præneoplastiske læsioner, og primær prostatacancer omgivet af reaktiv, dvs. post-inflammatorisk stroma. Endvidere TNF-α og IFN-γ induceret ekspression af CXCL16 og CXCR6 på primær prostata epitelceller. Desuden fandt vi signifikante korrelationer mellem tilstedeværelsen af ​​reaktive stroma og høj-niveau ekspression af CXCL16 og CXCR6 i cancerceller. Disse resultater antydede, at opregulering af CXCL16 /CXCR6 i prostata epitel er stærkt forbundet med både nuværende og tidligere betændelse i prostata stroma.

I en tredje del af vores undersøgelse, vi undersøgte potentielle roller for CXCL16 og CXCR6 på tumorassocierede lymfocytter. Vi fandt, at CXCL16 og CXCR6 udtrykkes på T-celler der støder op til prostatacancerceller. Vi viste, at CXCL16 kan induceres fortrinsvis i CXCR6

+ CD4

+ primære T-celler, og at Jurkat T-celler transficeret til at udtrykke CXCR6 samt aktiveret, primær CD4

+ T-celler prolifererede i nærvær af CXCL16. Disse data tyder på potentiale for både autokrine og parakrine virkninger af CXCL16 på infiltrerende T-celler samt på præmaligne og /eller maligne prostata celler.

Endelig, for at undersøge en mere generel sammenhæng mellem CXCL16 og inflammation- tilknyttede kræftformer, studerede vi udtryk for dette chemokin i prøver fra flere typer af humane kræftformer. Vi fandt høje ekspressionsniveauer af CXCL16 i kræft i æggestokkene, brysterne, prostata, colon og lever -. Alle cancere beskrevet som opstår i forbindelse med inflammation

CXCL16 er tidligere blevet beskrevet på humane gliomer, tyktarm og bryst kræft, og CXCR6 blev rapporteret i nasopharyngeale kræft og melanom [41] – [46]. Adskillige yderligere papirer har for nylig dukkede undersøge CXCL16 og /eller CXCR6 i kræft [45] – [50]. Flere af disse rapporter med fokus på CXCR6 i prostatakræft, og som vores viste høj ekspression af CXCR6 i prostata kræftceller [47] – [49]. Et papir, også som vores, viste en positiv korrelation mellem CXCR6 niveauer og Gleason score, rapporterede CXCL16 udtryk i prostatakræft, og viste forøget sekretion af CXCL16 fra prostata cellelinier efter behandling med TNF-α [47]. En anden papir viste effekter på invasion af prostata linjer til opløselige CXCL16 [48]. En tredje papir demonstreret virkninger CXCR6 på væksten af ​​prostatakræft-cellelinier i mus [49]. Samlet set vores resultater tyder pro-tumorigene roller for CXCL16 og CXCR6 i prostatakræft er i overensstemmelse med disse offentliggjorte rapporter.