PLoS ONE: CDK5 Regulerer Paclitaxel Følsomhed i ovariecancerceller ved Modulerende AKT aktivering, p21Cip1- og p27KIP1-medieret G1 cellecyklusstop og Apoptosis

Abstrakt

cyclin-afhængig kinase 5 (CDK5) er en cytoplasmatisk serin /threoninkinase. Knockdown af CDK5 øger paclitaxel følsomhed i humane ovarie kræftceller. Denne undersøgelse udforsker de mekanismer, som CDK5 regulerer paclitaxel følsomhed i humane ovariecancer. Flere ovarian cancer cellelinjer og xenotransplantater blev behandlet med CDK5 lille interfererende RNA (siRNA) med eller uden paclitaxel at undersøge effekten på kræft cellelevedygtighed, cellecyklusstandsning og tumorvækst. CDK5 protein blev målt ved immunhistokemisk farvning af en kræft i æggestokkene væv microarray at korrelere CDK5 udtryk med samlet patient overlevelse. Knockdown af CDK5 med siRNA’er hæmmer aktiveringen af ​​AKT som i væsentlig grad korrelerer med nedsat cellevækst og forbedret paclitaxel følsomhed i æggestokkene kræftceller. Desuden CDK5 knockdown alene og i kombination med paclitaxel inducerede G1 cellecyklusstandsning og caspase 3 afhængig apoptotisk celledød forbundet med posttranslationel opregulering og nuklear translokation af TP53 og p27

Kip1 samt TP53-afhængig transskriptionel induktion af p21

Cip1 i vildtype TP53 cancerceller. Behandling af HEYA8 og A2780 vildtype TP53 xenografter i nu /nu mus med CDK5 siRNA og paclitaxel produceres betydeligt større væksthæmning end enten behandling alene. Øget ekspression af CDK5 i humane ovariecancer korrelerer omvendt med den samlede overlevelse. CDK5 modulerer paclitaxel følsomhed ved at regulere AKT aktivering, cellecyklussen og caspase-afhængig apoptose. CDK5 hæmning kan forstærke paclitaxel aktivitet i humane ovariecancerceller

Henvisning:. Zhang S, Lu Z, Mao W, Ahmed AA, Yang H, Zhou J, et al. (2015) CDK5 Regulerer Paclitaxel Følsomhed i ovariecancerceller ved Modulerende AKT aktivering, p21Cip1- og p27KIP1-medieret G1 cellecyklusstop og apoptose. PLoS ONE 10 (7): e0131833. doi: 10,1371 /journal.pone.0131833

Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: 2. marts, 2015; Accepteret: 6 juni 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Anne og Henry Zarrow Foundation og venlige gaver fra Stuart og Gayle Lynn Zarrow, samt tilskud fra forebyggelse Cancer og Research Institute Texas RP110-595, National Foundation for Cancer Research, MD Anderson SPORE i kræft i æggestokkene NCI P50 CA83639, U54 CA151668, UH2 TR000943-01, den RGK Foundation, og MD Anderson NCI CCSG P30 CA16672 (flowcytometri og Forskning Animal Support faciliteter). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i USA i 2014 var der ca. 21.980 nye tilfælde af kræft i æggestokkene og 14,270 dødsfald fra denne sygdom, i overensstemmelse med en kur på kun 30% for alle faser. Forbedrede resultater kan opnås, hvis følsomhed over for primær kemoterapi blev forbedret. Der er identificeret to hovedtyper af epitelial ovariecancer. Type I “lav kvalitet” kræft vokser langsomt og er ofte opdages i tidligt stadium. På et molekylært niveau, type I kræftformer har vildtype

TP53

og drives af aktiverende mutationer i Ras og forskellige medlemmer af PI3K signalvejen. Type II “høj kvalitet” kræftformer vokser hurtigere og er ofte diagnosticeres i fremskredent stadium. Høj kvalitet ovariecancer udviser muteret

TP53

samt hyppige abnormiteter i homolog rekombination reparation af DNA og er drevet af en række DNA-kopi nummer abnormiteter, men kun meget sjældent ved at aktivere mutationer. Begge typer ovariecancer behandles med cytoreduktive kirurgi og en kombination af lægemidler, der omfatter carboplatin og paclitaxel. At forbedre effektiviteten af ​​paclitaxel til behandling af ovariecancer, udførte vi en kinome siRNA bibliotek skærmen i nærvær og fravær af paclitaxel til at identificere kinaser, der regulerer paclitaxel følsomhed. Knockdown af CDK5 forbedret paclitaxel følsomhed [1]. CDK5 er nødvendig for korrekt neuronal migration, synapsedannelse og overlevelse. Hyperaktivering af CDK5 er forbundet med alvorlige neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom [2-5]. For nylig er dysregulering af CDK5 været forbundet med malignitet, herunder cancere i prostata, bugspytkirtel, skjoldbruskkirtel, lunge, cervix, myelom, og bryst [6-13].

I denne undersøgelse har vi fundet, at CDK5 knockdown hæmmer fosforylering af AKT, og inducerer G1 cellecyklusstop, apoptose og øget følsomhed over for paclitaxel i æggestokkene kræftceller. Hertil kommer, induktion af G1 anholdelse og apoptose ved CDK5 knockdown vedrører induktion af TP53, p21

Cip1 og p27

Kip1 protein. CDK5 hæmning tilvejebringer en ny strategi for forvaltningen af ​​kræft i æggestokkene med og uden vildtype TP53 funktion.

Materialer og metoder

Cellelinjer og kulturer

HEY, A2780, CaOV3, ES-2 og SKOV3 humane ovarie cancer cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). EF021, EF027, OAW42, OC316 og IGROV1 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Gordon Mills ‘laboratorium [14-17], og alle cellelinjer blev bekræftet med STR DNA fingeraftryk, som blev udført af MDACC Karakteriseret Cell Linje kerne (støttet af NCI # CA016672). SKOV3-celler var kultur med Macoy s 5A; OC316, EFO27, EFO21, IGROV1, ES-2, A2780 og Hey celler var kultur med RPMI1640; Caov3 og OAW42 celler blev dyrket med DMEM. Alle medier blev opnået fra Media Forberedelse Core Facility ved M. D. Anderson Cancer Center. SW626-celler blev dyrket med Leibovitz L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Alle cellelinjer blev testet for mycoplasma med en MycoSensor PCR Assay Kit fra Stratagene (La Jolla, CA) og fundet at være fri for urenheder.

siRNA og plasmid transfektion

Alle cellelinjer var transficeret med en negativ kontrol siRNA eller et specifikt siRNA hjælp DharmaFECT 4 reagens (GE Dharmacon, Lafayette, CO). En blanding af siRNA (15 nM slutkoncentration) og DharmaFECT 4 reagens (12,5 nM slutkoncentration) blev inkuberet i 20 minat værelse tempereret før bliver anvendt til cellerne.

cellevækst assays

A krystalviolet assay blev anvendt til at vurdere forankringsafhængige cellevækst som beskrevet tidligere. Kort fortalt HEY (6 × 10

3) eller A2780 (8 × 10

3) celler blev podet tredobbelt i 96-brønds celledyrkningsplader og enten revers transficeret i 24 timer med en negativ kontrol siRNA eller en CDK5 siRNA og inkuberet i yderligere 48 timer med eller uden paclitaxel (3 nM). Cellerne blev vasket med PBS, fikseret i 1% glutaraldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløst i methanol. Farvestoffet, der farves cellerne på pladerne blev elueret med Sorenson-buffer (0,9% natriumcitrat, 0,02 N HCI, og 45% ethanol) og gælder målt med anvendelse af en Vmax-mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved en bølgelængde på 570 nm.

klonogene assays

En klonogene assay blev udført som beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev HEY eller A2780-celler podet ved 500 og 800 celler per brønd i tre eksemplarer efter transficerede i 24 timer med en negativ kontrol siRNA eller en CDK5 siRNA i 14 dage. Celler blev derefter fikseret i 1% glutaraldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet i methanol. Kolonier med mere end 30 celler blev talt.

Flowcytometri

Den procentdel af celler i sub-G1 fasen af ​​cellecyklus (dvs. apoptotiske celler) blev bestemt på grundlag af relativ DNA-koncentration målt med et flowcytometri som tidligere beskrevet [1]. Kort fortalt blev HEY-celler transficeret i 24 timer med en negativ kontrol siRNA eller en CDK5 siRNA og behandlet med eller uden paclitaxel (3 nM) i 24 timer og blev derefter løsgøres ved inkubering med 0,05% trypsin-EDTA, vasket med PBS og fikseret natten over i 70% ethanol. Fikserede celler blev derefter centrifugeret, vasket, resuspenderet i PBS indeholdende RNase A og propidiumiodid (50 ug /ml hver) og inkuberet i 20 minutter ved 37 ° C med forsigtig rystning. Farvede celler blev filtreret gennem nylonnet (41 um porestørrelse) og analyseret på en Coulter flowcytometer XL-MCL (Coulter Corporation, Miami, FL). Procentdelen af ​​sub-G1 befolkning og cellecyklusfordeling blev bestemt ved hjælp af den multicycle software program (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).

QRT-PCR-analyse

Celler blev høstet og total RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse RNA nem kit (Qiagen, Straße 1 Hilden, 40724Germany) ifølge producentens instruktioner. RNA renhed blev vurderet ved at måle absorptionen ved 260 nm (A260) og ved 280 nm (A280). Prøver, der havde A260 /A280-forhold på 1,9-2,1 blev anset for acceptabel. Integritet af RNA blev bestemt ved ethidiumbromidfarvning af 18S og 28S RNA i geler efter elektroforese. RNA-koncentrationer blev bestemt ud fra absorbansen ved 260 nm (A260). QRT-PCR blev udført med anvendelse af en Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems Incorporated, Foster City, CA) og SYBR Green Universal PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), som tidligere beskrevet [1]. Totalt RNA isoleret fra Hey celler transficeret med individuelle siRNA’er blev revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af et cDNA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA’et blev underkastet QRT-PCR for at vurdere mRNA-niveauer af p21Cip, TP53, p27KIP1 Bcl2 og CDK5. TP53 (VHPS-9498) og p21Cip (VHPS-1770) primere blev købt fra Real Time Primere (Elkins, PA). P27KIP1 primere er 5′-GAGTGGCAAGAGGTGGAGAA-3 ‘(F) og 5′-GCGTGTCCTCAGAGTTAGCC-3′ (R), Bcl2 primere er 5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTT-3 ‘(F) og 5′-GCCGTACAGTTCCACAAAGG-3′ (R) og cdk5 primere var 5’-ACTCCTACATGGGCAACGAG-3 ‘(F) og 5′-CGTTCTTCAGGTCGGAGAAG-3’ (R). PCR blev udført i et totalt volumen på 30 pi, der indeholdt 15 pi af 2X universal PCR Master Mix, 3 pi 10 × SYBR Green, 20 pM af hver forward og reverse primer og 50 ng af hver cDNA prøve. Amplifikationer blev udført i triplikat i 96-brønds mikrotiterplader. Termisk cykling var som følger: 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 10 sekunder, og 59 ° C i 40 sekunder. En smeltekurveanalyse blev anvendt til alle primersæt at udelukke ikke-specifik amplifikation og bestod af 95 ° C i 15 sekunder, 59 ° C i 15 sekunder, efterfulgt af forøgelse af temperaturen med 1 ° C hver 2 sekunder, indtil 95 ° C, og derefter 95 ° C i 15 sekunder.

Immunoblot og immunfældning

Celler blev ekstraheret med lysispuffer (50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, pH 4) indeholdende phosphatase og proteasehæmmere. Koncentrationen af ​​lysater protein blev bestemt med et BCA proteinassaykit (Pierce, Rockford, IL). Lige mængder af total protein blev kogt i prøvebuffer og separeret ved SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Membranerne blev inkuberet med specifikke antistoffer mod p-AKT (Cell Signaling, Danvers, MA), p53 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), p27KIP1 (BD transduktion laboratorium, Franklin Lakes, New Jersey), p21Cip (Santa Cruz Biotech , Santa Cruz, CA), caspase 3 (cellesignalering, Danvers, MA). Actin eller GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) blev anvendt som en loading kontrol i forsøgene med cellulære proteiner. HEY-celler (2 x 10

6) blev transficeret med enten siRNA i 72 timer og derefter lyseret i RIPA-buffer (20 mM Tris-HCI [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM b-glycerophosphat, og 1 mM natriumorthovanadat). Kort fortalt blev alikvoter af helcellelysater (~ 500 ug) inkuberet natten over ved 4 ° C med muse-anti-CDK5 antistof (~ 1 ug) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Museserum blev anvendt en negativ immunpræcipitering kontrol. Antistof-antigen-komplekser blev indsamlet ved brug af protein A-agarose-perler (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og vasket tre gange vask med RIPA buffer.

Subcellulær fraktionering

HEY celler blev transficeret med negativ kontrol og CDK5 siRNA og derefter fraktioneres ved anvendelse af en nuklear og cytoplasmiske Extraction Kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Lige store mængder af protein fra de cytoplasmatiske og nukleare ekstrakter (10 ug) blev underkastet immunoblotanalyse med antistoffer mod p21Cip1 (1: 300), p27KIP1 (1: 1500), PARP (1: 1000 fortynding; BD, Franklin Lakes, New Jersey ), og a-tubulin (1: 1000 fortynding; Sigma, St. Louis, MO)

Kinaseassays

in vitro kinaseassay blev udført ved EnzyChrom kinase assay Kit (MEDIBENA Life. Science Diagnostiske Solutions, Wien, Østrig) i henhold til fremstiller ‘instruktion. Kort fortalt er nedsat 75 pi reaktionsblanding indeholdende rekombinant CDK5 /p25 (Invitrogen) som kinase ATP og rekombinant p53 (Millipore, Billerica, MA), p27KIP1 (Abcam, Cambridge, MA), p21Cip1 (Abcam, Cambridge, MA), Histione H1 (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) og Arhi NTD (OriGene, Rockville, MD) som substrat i assaybuffer hhv. Der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Aliquot 20 pi blandingen i 3 separate brønde på 96-brønds plade tilsættes 40 pi arbejder reagens til hver assaybrønd. Der inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter og læse fluorescensintensitet (excitation = 530 nm og emission = 590 nm). Beregn kinase aktivitet som nedenstående formel.

δFluorescence = (fluorescensintensitet af prøve godt Brønd) og hældning er hældningen af ​​ADP standardkurven.

Luciferase promoter analyser

luciferaseaktivitet blev udført som følger. Celler blev podet i plader med 6 brønde, cotransficeret med siRNA eller dens negative kontrol og Renilla luciferase vektor (pRL-TK) tjente som en intern kontrol. Efter transfektion i 16 timer blev cellerne delt i 12-brønds plader, høstet efter 24 timer og Firefly og Renilla luciferase-aktiviteter blev målt sekventielt ved anvendelse af dual luciferase (Promega, Madison, WI) og et luminometer (BD Parmingene, Sparks, MD). WWP-Luc 9p21 /WAF1 promotoren blev indkøbt fra Addgene (16451, Cambridge, MA). Resultaterne blev udtrykt som relativ luciferaseaktivitet efter normalisering med Renilla luciferaseaktivitet. Relative luminescensenheder (RLU) blev normaliseret med protein koncentrationer i hver prøve, og de endelige værdier af RLU blev udtrykt som RLU pr mikro-gram protein per milliliter.

Apoptose blokering med caspase hæmning

HEY-celler blev behandlet i 2 timer med 20 uM af en pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK, Promega, Madison, WI), eller en negativ kontrol (Z-FA-FMK, Promega, Madison, WI), efter transficeret med en negativ kontrol siRNA eller en CDK5 siRNA i 24 timer. Cellerne blev derefter fikseret i 70% ethanol, farvet med propidiumiodid, og underkastet analyse ved flowcytometri. fraktion sub-G1 celle anses den apoptotiske cellepopulation.

Protein halveringstid assay

HEY-celler blev transficeret med en negativ kontrol siRNA eller en CDK5 siRNA i 24 timer, vasket og behandlet med 5 ug /ml cycloheximid (CHX) i de angivne tidsrum. Cellerne blev høstet og bruge til tilberedte helcellelysater, der har gennemgået immunoblotanalyse med antistoffer mod p27KIP1 og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH).

Humane ovariecancer xenotransplantater i nøgne mus

Forsøg med Nu /Nu mus blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC ID: 00.001.052-RN00) (MD Anderson Cancer center). 60 kvindelige nøgne mus blev injiceret intraperitonealt (i.p.) med 1×106 A2780 celler. På dag 7 efter injektion blev musene tilfældigt inddelt i følgende behandlingsgrupper (n = 10 mus per gruppe for hver cellelinie): 1) i.p. injektion med PBS (to gange om ugen, 100 ul /mus), 2) i.p. injektion med paclitaxel (en gang om ugen, 30 ug /mus), 3) i.p. injektion med kontrol siRNA-DOPC (to gange om ugen), 4) i.p. injektion af CDK5 siRNA-DOPC (to gange om ugen, 5 ug /mus), 5) i.p. injektion med en kombination af kontrol siRNA-DOPC (to gange om ugen) plus paclitaxel (en gang om ugen, 30 ug /mus), og 6) i.p. injektion med en kombination af CDK5 siRNA-DOPC (to gange om ugen, 5 ug /mus) plus paclitaxel (en gang om ugen, 30 ug /mus). Alle mus blev behandlet i 3 uger og aflivet ved CO2 og cervikal dislokation ved slutningen af ​​studiet. Alle tumorer blev opsamlet umiddelbart efter døden og vejet.

Immunhistokemi

A formalin-fikserede, paraffinindlejrede væv microarray (TMA) prøver af primære ovariecancere (215 patientprøver) blev opnået fra MD Anderson Pathology afdeling. Protokollerne for håndtering paraffinindstøbte ovariecancer prøver og analysere patientdata blev godkendt af de etiske udvalg i MDACC Institutional Review Boards. Prøver og tilhørende kliniske oplysninger blev indsamlet under skriftlige informerede samtykke, som blev underskrevet af hver tilmeldt patient, under etiske retningslinjer og godkendelse af MDACC Institutional Review Boards. Til denne undersøgelse blev væv microarray konstruktion udført som tidligere beskrevet [19]. Tissue microarray objektglas blev underkastet immunhistokemisk farvning ifølge fabrikantens protokol (Biocare Medical, Concord, CA, USA). Seks mikron snit blev skåret fra hver TMA. Inkubation ved 60 ° C i 20 min blev anvendt til at genoprette antigene reaktivitet efterfulgt af to 20 min inkubationer i xylen. Efter objektglas blev rehydreret, blev antigen-genvinding udført i 6,5 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter. 3% bovint serumalbumin i 0,1 M Tris-bufret saltvand blev anvendt til blokering. Snit blev inkuberet ved 4 ° C natten over med anti-CDK5 antistof (1: 100, Sigma HPA018977). Anti-kanin immunoglobulin sekundære antistoffer blev derefter påført i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af vask 3 gange i PBS i 10 min. DAB chromagen blev tilsat i 1 min pr objektglas efterfulgt af 3 yderligere vaske i PBS i 10 minutter og derefter hæmatoxylin-farvning blev udført i 1 min pr objektglas efterfulgt af 3 yderligere vaske i PBS i 10 min. To gynækologiske patologer (J.L, R.M.) uafhængigt analyserede immuno-histokemisk farvede objektglas for CDK5 ekspression.

Statistisk analyse

Data er repræsenteret som betyder +/- standardafvigelser medmindre andet er angivet. Statistisk signifikans blev bestemt ved uafhængig prøve Mann-Whitney U test. Overlevelse analyse blev udført ved Kaplan-Meier-metoden. Den minimale signifikansniveau var P = 0,05.

Resultater

CDK5 knockdown hæmmer cellevækst og øger paclitaxel følsomhed i æggestokkene cancerceller

Mens knockdown af CDK5 med siRNA kunne ændre cellevækst og paclitaxel følsomhed i æggestokkene kræft cellelinjer med mutant TP53 (EFO21, EFO27, IGROV1, CaOV3, OAW42 og ES-2, SKOV3 og OC316) (fig 1A), blev de mest markante effekter observeret i to æggestokkene kræft cellelinjer med vildtype TP53 (HEY og A2780) (fig 1A og 1B). Silencing CDK5 reducerede signifikant IC50 af paclitaxel i Hey og A2780-celler (Fig 1B). Tvungen ekspression af CDK5 øget vækst og nedsat følsomhed ved paclitaxel i HEY-celler (S1 Fig). Den CDK inhibitor roscovitin hæmmede også CDK5 aktivitet og cellevækst i Hey celler som gjorde CDK5 siRNA i HEY og A2780-celler (S1 Fig). Ud over at hæmme væksten i kortsigtede analyser, knockdown af CDK5 signifikant hæmmede koloni dannelse og forbedret følsomhed over for paclitaxel i HEY og A2780-celler (Fig 1B og S2 Fig).

(A) Kortsigtet cellevækst assay. Hey og A2780-celler i 96-brønds plader blev revers transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA (Dhamarcon) i 24 timer og behandlet med 5 nM paclitaxel (Pac) eller fortyndingsmiddel (Control) i yderligere 48 timer. En krystalviolet celleproliferation assay blev anvendt til at måle væksten af ​​celler. (B) Klonogene og cellevækstfaktorer assays. HEY og A2780-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer, og derefter blev cellerne behandlet med fortyndingsmiddel (kontrol) eller 3 nM paclitaxel (Pac) i 14 dage (klonogene assay) eller celler blev behandlet med flere koncentrationer af paclitaxel ( Pac) eller fortyndingsmiddel (Control) i yderligere 48 timer (celle vækstassays). De IC50’er af paclitaxel med eller med CDK5 siRNA behandling i Hey og A2780 celler blev beregnet i GraphPad.

CDK5 knockdown hæmmer aktiveringen af ​​AKT

phosphatidyinositol-3-kinase (PI3K ) -Akt overlevelse kaskade menes at være forbundet med følsomheden over for anticancerlægemidler. At udforske den mekanisme, som CDK5 tavshed hæmmet vækst æggestokkene kræftcelle og forbedret paclitaxel følsomhed, vi først undersøgt effekten af ​​CDK5 knockdown på aktivering af AKT ved at registrere Ser473 fosforylering af AKT. Efter behandling med CDK5 siRNA eller kontrol siRNA, udførtes Western analyse. Silencing CDK5 signifikant inhiberede aktivering af AKT i 2 vildtype TP53 (figur 2) samt i 4 ud af 8 mutante TP53 æggestokkene cancercellelinier (fig 2). siRNA’er inhibering af AKT aktivering i 6 ovariecancer linjer korrelerer signifikant med nedsat cellevækst og forøget paclitaxel følsomhed (fig 1A og 2).

Western-analyse til måling inhibering af AKT-phosphorylering (Ser473) under anvendelse af specifikke anti-p- AKT antistof. HEY-celler blev behandlet med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 72 timer. Cellelysater blev udsat for immunoblotanalyse.

CDK5 knockdown øger apoptose og G1 cellecyklusstop i nærvær og fravær af paclitaxel

At udforske de ekstra mekanismer, som CDK5 lyddæmpning hæmmer wild skrive TP53 æggestokkene vækst cancercellen og forbedret paclitaxel følsomhed, undersøgte vi virkningen af ​​CDK5 knockdown med eller uden paclitaxel behandling på induktion af apoptose og standsning af cellecyklus i Hey celler, som er TP53 vildtype. Efter behandling med CDK5 siRNA eller kontrol siRNA, flowcytometrisk analyse blev udført. Silencing CDK5 induceret G1 anholdelse og produceret apoptotisk celledød med en øget brøkdel af celler i sub-G1 (Fig 3A og 3B). CDK5 silencing også forbedret paclitaxel-induceret apoptose (fig 3B).

(A, B) Knockdown af p53 reduceret CDK5 knockdown-induceret apoptose (A) og G1 arrest (B). HEY-celler blev revers transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer og behandlet med 5 nM paclitaxel (Pac) eller fortyndingsmiddel (Control) i yderligere 48 timer, og derefter cellecyklus analyseret ved flowcytometri. De viste data er middelværdier fra tre uafhængige forsøg. (C) CDK5 knockdown forøget ekspression af p21

Cip1, p53, og p27

Kip1. HEY-celler blev behandlet med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer og derefter med paclitaxel (3 nM) eller diluent i 48 timer. Immunoblotanalyse blev udført med antistoffer mod p21

Cip1, p53, og P27

Kip. (D) Knockdown af p53-ekspression reduceret CDK5 siRNA-induceret vækstinhibering og reduceret forøgelsen af ​​paclitaxel følsomhed. Celler blev co-transficeret med CDK5 siRNA og p53 siRNA i 24 timer og behandlet med paclitaxel (Pac) eller fortyndingsmiddel. Proliferation af celler blev målt med et krystalviolet celleproliferationsassay. (E, F) Knockdown af p53 reduceret CDK5 knockdown-induceret apoptose (E) og G1 arrest (F). HEY-celler blev behandlet som i (A) og cellecyklus analyseret ved flowcytometri. De viste data er middelværdier fra tre uafhængige forsøg. (G) Western-analyse bekræftede stigende af TP53 ekspression ved silencing CDK5. HEY-celler blev behandlet med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer og derefter med paclitaxel (3 nM) eller diluent i 48 timer. Celler lysater blev udsat for immunoblotanalyse med p53, CDK5 og actin antistof.

CDK5 knockdown inducerer TP53-afhængig væksthæmning apoptose og G1 anholde

For at teste effekten af ​​CDK5 lyddæmpning på proteiner, som regulerer cellecyklus og apoptose, udførte vi Western analyse af TP53, p21Cip1 og p27KIP1 efter behandling af HEY-celler med kontrol siRNA og CDK5 siRNA i nærvær og fravær af paclitaxel. Knockdown af CDK5 signifikant øget TP53, p21

Cip1 og p27

Kip1 (Fig 3C). Behandling med paclitaxel yderligere øget niveauer af disse tre proteiner (fig 3C). Desuden Knockdown af CDK5 induceret vækstinhibering og knockdown af TP53 reduceret silencing CDK5-medieret vækstinhibering i nærvær eller fravær af paclitaxel (figur 3D). I tråd med dette, CDK5 siRNA øgede cancercelle G1 cellecyklusstop og apoptose dog knockdown af TP53 reducerede CDK5 siRNA-induceret G1 cellecyklusstop i nærvær eller fravær af paclitaxel (fig 3E og 3G) og reducerede CDK5 siRNA -induceret apoptose (fig 3F og 3G) i HEY-celler. I SKOV3-celler, der er TP53 null, knockdown af CDK5 øget fraktionen af ​​celler i G2 /M efter behandling med paclitaxel (S3 Fig). Tvungen ekspression af vildtype TP53 i SKOV3-celler steg den del af cellerne i G1 (S3 Fig).

CDK5 knockdown producerer posttranslationel opregulering og nuklear translokation af TP53 og p27

Kip1 og inducerer TP53-afhængig transskription af p21

Cip1

CDK5 knockdown i HEY celler forlængede signifikant halveringstiden af ​​TP53 og p27

Kip1 proteiner (figur 4A). Silencing af CDK5 øget nuklear lokalisering af TP53 og P27

Kip1 proteiner og cytoplasmiske niveauer af p21

Cip1 (Fig 4B). Den p27

Kip1 proteinniveau er primært reguleret post-transkriptionelt [20, 21]. CDK5 siRNA nedsatte phosphorylering af p27KIP1 på Thr187 (Fig 4C), som er nødvendig for binding til ubiquitin ligase og fører til 26S proteasom nedbrydning. TP53 er blevet rapporteret at være en direkte substrat af CDK5 [22-24]. Anvendelse af renset CDK5 protein og et fluorescens-baseret in vitro kinaseassay observerede vi phosphorylering af TP53 og p27

Kip1 (Fig 4D), ved anvendelse af et ubeslægtet protein, Arhi-NTD, som en negativ kontrol og histon H1 som en positiv kontrol (S4 fig) [25, 26]. Fordi p21

Cip1 kan reguleres ved TP53 på det transskriptionelle niveau og CDK5 lyddæmpning kan også opregulere TP53 ekspression, testede vi virkningen af ​​CDK5 knockdown og TP53 knockdown på p21

Cip1 promotoraktivitet. Sammenlignet med kontrolpatienter siRNA, CDK5 siRNA signifikant forøget promotoraktivitet af p21

Cip1, som blev ophævet ved co-transfektion med TP53 siRNA (Fig 4E). Endvidere knockdown af p21

Cip1 og p27

Kip1 samtidigt (fig 4F) reducerede CDK5 siRNA-inducerede stigning i apoptose (fig 4G) og reducerede CDK5 siRNA-induceret G1 cellecyklusstop i nærvær eller fravær af paclitaxel (fig 4H) i HEY-celler. Således silencing af CDK5 produceret posttranslationel opregulering af TP53 og p27

Kip1 forbundet med TP53-afhængig transskriptionel induktion af p21

Cip1.

(A) Transfektion med CDK5 siRNA forøgede halveringstiden p53 og p27

Kip1 protein. HEY-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer og derefter behandlet med 5 ug /ml cycloheximid (CHX) for de angivne intervaller. Cellelysater blev underkastet Western-analyse med antistofferne angivet. (B) CDK5 siRNA øgede nukleare lokalisering af p53 og p27

Kip1. HEY celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer og underkastet fraktionering i cytoplasmatiske og nukleare komponenter. Cytoplasmatisk (CE) og nukleare (NE) ekstrakter blev analyseret ved immunblotting. (C) CDK5 siRNA formindskede phosphorylering af p27KIP1 på T187. Cellen Immunblotanalyse udførtes med antistoffer mod phosphoryleret og total p27KIP1. (D) CDK5 forbedret fosforylering af TP53 og p27

Kip. En fluorescens baseret in vitro kinase-assay blev anvendt til at evaluere interaktionen af ​​CDK5 med TP53 og p27

Kip1. (E) CDK5 siRNA transkriptionelt reguleret ekspression af p21

Cip1. HEY-celler blev transficeret med CDK5 siRNA alene eller i kombination med TP53 siRNA og en luciferase reporter assay blev anvendt til måling p21

Cip1 promotoraktivitet. (F) CDK5, p21

Cip1 og p27

Kip1 knockdown faldt udtryk for CDK5, p21

Cip1 og p27

Kip1. HEY-celler blev behandlet med kontrol siRNA eller CDK5 eller /og p21 plus p27 siRNA i 48 timer og derefter med paclitaxel (6 nM) eller diluent i 24 timer. Immunoblotanalyse udførtes med antistoffer angivet. (G, H) Knockdown af p21and p27 reduceret CDK5 knockdown-induceret apoptose (G) og G1 arrest (H). HEY-celler blev behandlet som i (F) og cellecyklus analyseret ved flowcytometri efter siRNA transfektion. SubG1 celler blev anset apoptotiske celler. De viste data er middelværdier fra tre uafhængige forsøg.

CDK5 knockdown-inducerer apoptose, der afhænger af caspase-3-aktivering og er forbundet med Bcl-2 nedregulering

For at belyse den mekanisme, som CDK5 knockdown induceret apoptose, vi spurgte, om CDK5 knockdown og paclitaxel behandling aktiveret caspase-3. Western-analyse viste, at CDK5 knockdown kunne inducere aktiveringen af ​​caspase-3, og dette blev yderligere øget ved behandling med paclitaxel (Fig 5A). Z-VAD-FMK, en pan-caspaseinhibitor, blokerede apoptose i celler transficeret CDK5 siRNA (Fig 5B). Følgelig den apoptotiske celledød induceret af CDK5 lyddæmpning var caspase afhængig. Bcl-2 er en vigtig inhibitor af apoptose. CDK5 silencing fandtes at formindske ekspressionen af ​​Bcl-2-mRNA-niveau ved QRT-PCR (Fig 5C), hvilket kan forklares opregulering af p27KIP1, som vi tidligere rapporteret [1]. Kombinationen af ​​CDK5 siRNA og paclitaxel udviste større hæmning af Bcl-2-mRNA end gjorde CDK5 siRNA alene.

(A) CDK5 knockdown induceret caspase-3-aktivering i nærvær og fravær af paclitaxel. HEY-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller CDK5 siRNA i 24 timer, behandlet med paclitaxel (3 nM) eller diluent i 48 timer, lyseret og totalt protein analyseret ved immunblot under anvendelse af antistoffer mod aktiverede caspase-3 og GAPDH. (B) En pan-caspaseinhibitor blokeret CDK5 knockdown-induceret apoptose. HEY-celler blev forbehandlet i 2 timer med 20 uM af en pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK), eller negativ kontrol (Z-FA-FMK), efterfulgt af behandling i 24 timer med eller uden paclitaxel (3 nM). Cellerne blev derefter fikseret i 70% ethanol, farvet med propidiumiodid og underkastet cellecyklusanalyse ved flowcytometri. Sub-G1 cellepopulation blev anset apoptotiske og udtrykt som en procentdel af den hel-celle population. (C) CDK5 knockdown faldt ekspressionen af ​​Bcl-2 mRNA.