PLoS ONE: Zink protoporphyrin Undertrykker β-Catenin Protein Expression i Human Cancer Cells: Potentialet Inddragelse af lysosomer-medieret Nedbrydning

Abstrakt

Zink protoporphyrin (znPP) har vist sig at have anticancer aktivitet både

in vitro

in vivo

. Vi har for nylig vist, at ZNPP formindsker β-catenin proteinekspression i cancerceller. Den foreliggende undersøgelse undersøgte de cellulære mekanismer, der medierer ZNPP undertrykkelse af β-catenin-ekspression. Vi viser, at ZNPP inducerer en hurtig nedbrydning af β-catenin-protein i cancerceller, som er ledsaget af en signifikant inhibering af proteasomaktivitet, hvilket antyder, at proteasom nedbrydning ikke direkte højde for undertrykkelse. Muligheden for, at znPP inducerer β-catenin eksport blev afvist af den observation, at der ikke var nogen påviselig β-catenin protein i konditioneret medium efter znPP behandling af kræftceller. Yderligere forsøg viste, at ZNPP inducerer lysosom membranpermeabilisering, der blev vendt ved forbehandling med et protein transport inhibitor cocktail indeholdende Brefeldin A (BFA) og Monensin. Mere signifikant forbehandling af cancerceller med BFA og Monensin svækkede ZNPP-induceret suppression af β-catenin ekspression i en koncentrations- og tidsafhængig måde, hvilket indikerer, at lysosomet protein nedbrydningsvej sandsynligvis er involveret i ZNPP-induceret suppression af β catenin ekspression. Om der er cross-talk mellem ubiquitin-proteasom systemet og lysosomet vej, der kan tegne sig for znPP-induceret β-catenin proteinnedbrydning er i øjeblikket ukendt. Disse resultater giver en ny mekanisme for znPP s anticancer handling og afslører en potentiel ny strategi for at målrette β-catenin Wnt signalvejen for kræftbehandling

Henvisning:. Wang S, Hannafon BN, Lind SE, Ding WQ (2015 ) Zink protoporphyrin Undertrykker β-Catenin Protein Expression i human Cancer Cells: potentialet Inddragelse af lysosomer-medieret nedbrydning. PLoS ONE 10 (5): e0127413. doi: 10,1371 /journal.pone.0127413

Academic Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, UNITED STATES

Modtaget: 17. december, 2014 Accepteret: April 15, 2015; Udgivet: May 22, 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society (CNE-117.557) til WQD, Susan G. Komen for Cure Foundation (KG081083) til WQD, NIH OK-INBRE programmet ( 3P20RR016478-09S2) til WQD og Oklahoma center for Advancement of Science and Technology (HR14-147) til WQD. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

zink protoporphyrin (ZNPP) tilhører en gruppe af kemiske forbindelser, hvor den centrale ion af frit hæm erstattes af et tungmetal-ion, såsom zink, tin (SnPP) eller kobber (Cupp). Grundet ZNPP har strukturel lighed med den for frit hæm, en etableret substrat af antioxidant enzym hæm oxygenase-1 (HO-1), ZNPP virker som en kompetitiv inhibitor for HO-1 enzymatisk aktivitet [1]. ZnPP har vist sig at have anticancer aktivitet både

in vitro

in vivo

[2-5], og det er den generelle opfattelse, at znPP s anticancer aktivitet tilskrives HO-1 hæmning. Men er ikke blevet tilvejebragt eksperimentelt bevis til støtte for denne antagelse. Tværtimod har nogle undersøgelser antydet, at znPP s anticancer handling kan være uafhængig af HO-1 [5,6]. I vores seneste rapport, viste vi, at hverken overekspression eller knockdown af HO-1 i kræft modelsystemer påvirker znPP s cytotoksicitet, kraftigt indikerer en HO-1-uafhængig virkning af znPP mod kræftceller. Vores mekanistiske undersøgelser viste endvidere, at znPP er i stand til hurtigt og dramatisk undertrykke β-catenin protein-ekspression og aktivitet i cancerceller [7].

Da β-catenin er en central aktør i den kanoniske Wnt signalvejen, som er et godt værdsat target pathway til cancerterapi [8], den signifikant undertrykkelse af β-catenin-ekspression og aktivitet afslører en vigtig mekanisme af ZNPP s anticanceraktivitet. En yderligere forståelse af, hvordan ZNPP undertrykker β-catenin-ekspression i cancerceller kan ikke kun hjælpe belyse de cellulære mekanismer i ZNPP s anticancer handling, men også give nye cancer terapeutiske strategier til målretning af β-catenin Wnt signalvejen.

i den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt de cellulære mekanismer ZNPP-induceret suppression af β-catenin-ekspression i humane cancerceller. Den hurtige og dramatiske karakter af ZNPP-induceret suppression af β-catenin-proteinekspression antyder kraftigt, at denne undertrykkelse skyldes primært p-catenin proteinnedbrydning. β-catenin-proteinniveauer er velkontrolleret af β-catenin destruktion kompleks, der er tæt koblet til den ubiquitin-proteasom systemet [9]. Det er derfor sandsynligt, at ubiquitin-proteasom systemet medierer ZNPP-induceret β-catenin proteinnedbrydning. Imidlertid kan andre protein nedbrydningsveje, såsom lysosomet-medieret proteinnedbrydning pathway [10], også være involveret i denne proces. Desuden kan den mulighed, at ZNPP inducerer hurtig eksport af β-catenin fra cancerceller ikke udelukkes. Den foreliggende undersøgelse undersøgte disse tre potentielle mekanismer i ZNPP-induceret suppression af β-catenin-ekspression. Til vores overraskelse ZNPP-induceret suppression af β-catenin-ekspression ikke skyldes forøget proteasomaktivitet heller ikke medieret af eksport af β-catenin. Vores resultater støtter inddragelse af lysosomet-medierede nedbrydningsvej i znPP-induceret undertrykkelse af β-catenin udtryk.

Materiale og metoder

Materialer

β-catenin , phospho-β-catenin (Ser33 /37 /Thr41) og K48 (lysin 48)-binding specifikke poly-antistoffer var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). MG132 og Brefeldin A /Monensin cocktail var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Suc-LLVY-AMC var fra Anaspec (Fremont, CA). Z-ARR-AMC og Z-LLE-AMC var fra Millipore (Billerica, MA). Andre fluorescerende prober var fra Life Technologies (Grand Island, NY). Corning Spin-X koncentratorer (6 ml) og monensin natriumsalt var fra VWR International LLC (Radnor, PA). Den β-actin antistof og andre kemiske reagenser var analytisk kvalitet og fås fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell kultur

A2780 cellelinje (human ovariecancer) var en slags gave fra Dr. Stephen Howell (University of California, San Diego). Den DU145 cellelinien (human prostatacancer) og MDA-MB-231-cellelinie (human brystcancer) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A2780 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium, og DU145 og MDA-MB-231-celler blev dyrket i DMEM-medium. Både RPMI 1640 og DMEM medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev rutinemæssigt dyrket i en 75-mm kolbe ved 37 ° C i en fugtig miljø, der indeholder 5% CO

2. Alle celler blev sub-dyrket to gange om ugen, og anvendes på de forskellige eksperimenter, som er beskrevet i resultatafsnittet.

Udarbejdelse og anvendelse af znPP og SnPP

znPP og SnPP blev købt fra Frontier Scientific, Inc. (Logan, UT). Producentens råd og en tidligere rapport [11] blev fulgt i korrekt håndtering af disse forbindelser. En arbejdsgruppe bestand af znPP og SnPP var frisk udarbejdes for hvert enkelt eksperiment. Alle rør anvendes til fremstilling af stamopløsningen var dækket af aluminiumfolie for at undgå lys reaktion med forbindelserne. Forbindelserne blev indledningsvist opløst i komplet DMSO og yderligere fortyndet med 50% DMSO i 1X PBS-puffer forud for tilsætning til celledyrkningsmediet. Den endelige DMSO i celledyrkningsmediet var under 0,5% i alle eksperimenter udført. Køretøjer blev inkluderet som kontroller. Cellerne blev behandlet med forbindelserne i indirekte svagt lys og inkuberes i mørke i forskellige tidsrum forud for de enkelte analyser, svarende til tidligere rapporter [5,11].

Western blot-analyse

Proteinekspression blev analyseret ved Western-blot som vi tidligere beskrevet [12,13]. Celler blev podet i 100-mm dyrkningsskåle og nåede 80% konfluens forud for behandlingen med ZNPP eller SnPP ved angivne koncentrationer og varigheder. For helcellelysat blev celler lyseret og sonikeret på is i 3 slag (10 sekunder hver med 10 sekunders interval i mellem). Uopløselige materialer blev fjernet ved centrifugering ved 15.000 x g i 15 minutter. Supernatanterne blev opsamlet for protein koncentrationsbestemmelse. For ekstracellulært protein isolation blev celler behandlet i Hanks ‘balancerede saltopløsning (HBSS) i 1,5 timer. Efter behandling blev HBSS opsamlet og koncentreret med Corning Spin-X koncentratorer. 25 til 40 ug protein blev påført på hver brønd af en 10% SDS PAGE-gel, overført til en PVDF-membran og blottet med specifikke antistoffer mod β-catenin, phosphoryleret β-catenin, polyubiquitinated proteiner og β-actin.

Co-immunfældning

Co-immunpræcipitering (co-IP) under anvendelse af β-catenin antistof blev udført som tidligere [13] beskrevne. Kort sagt blev celler vokser i 100 mm skåle vasket med PBS og høstet ved tilsætning 150 pi IP-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og 1% Triton X -100). Cellerne blev sonikeret i 1 minut på is, og uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering. Supernatanter blev opsamlet, og proteinkoncentrationer bestemmes. Supernatanter blev præ-væk for agarose-koblet protein A, og agaroseperlerne blev fjernet ved centrifugering. β-catenin antistoffer blev tilsat til supernatanterne (1: 100-forhold), og reaktionen blev inkuberet ved 4 ° C natten over under forsigtig rotation. 50 pi agarose-koblet protein A blev sat til fange antistof-proteinkomplekser ved at dreje i 2 timer ved 4 ° C. Perlerne (IPS) blev derefter opsamlet ved centrifugering ved 2000 x g i 5 minutter. VP blev solubiliseret med 50 pi 2 X SDS-PAGE-buffer ved blanding og inkubering i 1 time ved stuetemperatur. Supernatanten blev opsamlet ved centrifugering ved 2000 x g i 5 minutter. En parallel immunpræcipitering med kanin IgG blev udført som en kontrol. Både IP og inputs blev kogt i 5 minutter og western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer mod K-48 linkage specifikke polyubiquitinated proteiner og β-catenin. β-actin udtryk i materialer der blev blev også bestemt.

Fluorescens mikroskopisk påvisning af intracellulære znPP og lysosomer permeabilitet

lysosomet permeabilitet blev analyseret ved fluorescensmikroskopi hjælp af Content Operette High Imaging System fra PerkinElmer ( Waltham, MA). A2780 celler blev udpladet i Cell Carrier-96-pladen fra PerkinElmer (Waltham, MA) ved en densitet på 10.000 celler per brønd. Otteogfyrre timer efter udpladning blev cellerne behandlet med ZNPP eller SnPP eller forbehandlet med Brefeldin A /Monensin (21,1 pM /4 uM) cocktail i 4 timer efterfulgt af behandling med ZNPP. Mediet blev derefter erstattet med frisk medium indeholdende 2,5 uM acridin orange (AO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Efter 30 minutters inkubation blev cellerne vasket tre gange med HBSS og betragtet under Operette. Lysosom permeabilitet blev målt ved anvendelse af AO-farvning [14]. AO blev opdaget af excitation ved 500 nm, emission ved 526 nm for rød, og excitation ved 460 nm, emission ved 650 nm for grøn.

Proteasome aktivitet assay

proteasom aktiviteter blev målt som tidligere rapporteret [15]. Kort fortalt blev A2780-celler behandlet med ZNPP, SnPP eller MG132 ved forskellige koncentrationer og varigheder. Efter behandling blev cellerne vasket med PBS og opsamlet i PBS. Cellepellets blev lyseret med 250 pi lysisbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl og 1% Triton X-100) pr 5 × 10

6 celler ved at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter og vortexbehandling hver 10 minutter. Lysaterne blev derefter centrifugeret og supernatanten opsamlet. I alt 10 ug protein for hver prøve blev inkuberet med 20 pM fluorogent substrat (Suc-LLVY-AMC, Z-ARR-AMC eller Z-LLE-AMC) i 100 pi assaypuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5 ) ved 37 ° C i 2 timer. Efter inkubation blev fluorescensen aflæst ved 380 nm excitation og ved 460 nm emission ved anvendelse Molecular Devices Fmax fluorescerende mikropladelæser (Sunnyvale, CA)

Resultater Salg

ZNPP-induceret suppression af β-catenin ekspression er ledsaget af en inhibering af proteasomaktivitet. Vi har tidligere rapporteret, at ZNPP undertrykker β-catenin proteinekspression i humane cancerceller [7]. Dette blev også bekræftet i den foreliggende undersøgelse (figur 1). Behandling med 5 uM ZNPP i 30 minutter til 1 time dramatisk undertrykt β-catenin proteinekspression i A2780 celler, hvilket indikerer, at proteinnedbrydning er involveret. β-catenin-proteinniveauer er stramt reguleret af ubiquitin-proteasom systemet. I mangel af Wnt ligander, kan β-catenin-protein phosphoryleres af CK1 ved Ser 45, efterfulgt af en sekundær phosphorylering ved Ser 33, Ser 37, og Thr 41 af GSK-3β. Phosphoryleret β-catenin vil derefter blive poly-ubiquitineret og målrettet for nedbrydning med proteasomet [9]. For at bestemme om aktivering af proteasomaktivitet er den primære mekanisme for ZNPP-induceret β-catenin-nedbrydning, målte vi niveauet af phosphoryleret β-catenin efter ZNPP behandling i A2780 celler. Fig 2A viser, at niveauet af phosphoryleret β-catenin (Ser 33, Ser 37 og Thr 41) blev reduceret efter behandling med 5 uM ZNPP i 15, 30 eller 60 minutter, hvilket indikerer, at ZNPP ikke forbedre phosphorylering af β-catenin af GSK -3β. Co-immunfældning med et antistof mod β-catenin (kanin IgG anvendt som kontrol til fældning) viste endvidere, at mens niveauerne af hele β-catenin blev undertrykt, K48 binding specifik poly-ubiquitineret β-catenin akkumuleret i β-catenin udfældede prøver efter ZNPP behandling i 30 minutter og 4 timer (fig 2B). Vi målte derefter niveauerne af K48 (lysin 48)-binding specifikke poly-ubiquitineret proteiner for yderligere at bestemme virkningerne af ZNPP på poly-ubiquitineret proteiner. K48-bundet poly-ubiquitin kæde er kendt for at målrette proteiner til proteasomalaktivitet nedbrydning [16]. Som vist i fig 2C, behandling med 10 pM ZNPP i 4 eller 21 timer inducerede akkumulering af K48 specifikke poly-ubiquitineret proteiner, hvilket indikerer, at i stedet for at aktivere proteasomaktivitet, ZNPP faktisk undertrykker proteasomaktivitet i vores model system. Bemærk, at zink bindende forbindelser er tidligere blevet beskrevet at inhibere proteasomaktivitet [17,18].

A2780 celler blev behandlet med 5 pM ZNPP i 0,5 eller 1 time. Cellelysater blev fremstillet og western blot blev udført ved hjælp af antistoffer mod β-catenin og β-actin.

A

. A2780 celler blev behandlet med 5 pM ZNPP i 15, 30 eller 60 minutter. Cellelysater blev fremstillet og western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer mod phosphorylerede β-catenin (Ser 33, Ser 37 og Thr 41) og β-actin.

B

. A2780 celler blev behandlet med 5 pM ZNPP i 0,5 og 4 timer. Cellelysater blev fremstillet og co-IP blev udført under anvendelse β-catenin antistof efterfulgt af western blot analyse af K48 linkage specifikke proteiner, β-catenin (IP’er) eller β-actin (input). Vist er repræsentative billeder af tre individuelle eksperimenter.

C

. A2780 celler blev behandlet med 10 pM ZNPP i 4 og 21 timer, eller 10 uM MG132 i 21 timer. Cellelysater blev fremstillet og western blot blev udført ved anvendelse af antistoffer mod K48-linkage specifikke polyubiquitinated proteiner og β-actin.

ZNPP inhibering af proteasomaktivitet blev yderligere bekræftet ved direkte målinger af 20S proteasom chymotryptisk aktivitet, som blev analyseret under anvendelse af fluorofor bundet peptid Suc-LLVY-AMC [19]. Den eukaryote 20S proteasomet er kendt for at have aktiviteter tilskrives dens forskellige proteinunderenheder, der henvises til som caspase-lignende aktivitet (spalter efter glutamin og asparaginsyrerester), trypsin-lignende aktivitet (spalter efter de basiske aminosyrer lysin og arginin) og chymotrypsin-lignende aktivitet (spalter efter hydrofobe aminosyrer) [20]. Som vist i figur 3, behandling af A2780 (Fig 3A og 3C) og MDA-MB-231 (Fig 3B og 3C) celler med ZNPP eller MG132, men ikke SnPP, undertrykt chymotryptisk aktivitet på en tids- og koncentrationsafhængig måde. IC

50 for ZNPP s inhibering af proteasom-aktiviteten blev bestemt til at være 6,2 pM i A2780 celler og 4,2 uM i MDA-MB-231-celler (Fig 3D). ZNPP, men ikke SnPP, undertrykte også den tryptiske og caspase-lignende proteasomaktivitet i A2780-celler som analyseret ved anvendelse fluoroforen bundet peptider Z-ARR-AMC eller Z-LLE-AMC, henholdsvis [19] (figur 4). Bemærk, at MG132 var mere effektive til at undertrykke den chymotryptisk aktivitet, snarere end caspase-lignende aktivitet og påvirkede ikke tryptiske aktivitet, resultater, som er i overensstemmelse med tidligere rapporter [21,22].

A2780

(A)

eller MDA-MB-231

(B)

celler blev behandlet med 10 pM ZNPP, SnPP eller MG132 i 4 eller 21 timer. Helcellelysater blev fremstillet og inkuberet med Suc-LLVY-AMC i 2 timer ved 37 ° C, og fluorescens blev registreret ved 380 nm excitation og 460 nm emission.

C

,

D

. A2780 og MDA-MB-231-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af ZNPP som angivet i 21 timer. Helcellelysater blev fremstillet og inkuberet med Suc-LLVY-AMC i 2 timer ved 37 ° C, og fluorescens blev registreret ved 380 nm excitation og 460 nm emission. IC

50 blev beregnet med en ikke-lineær regression kurve (sigmoidal dosis-respons ligning). Data (middelværdi ± SE, n = 3) er udtrykt som procentdele af ubehandlet kontrol. **,

P

0,01, sammenlignet med ubehandlede kontrolceller ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni-analyse.

A2780 celler blev behandlet med 10 pM ZNPP, SnPP eller MG132 i 4 eller 21 timer. Helcellelysater blev fremstillet og inkuberet med Z-ARR-AMC (tryptisk aktivitet)

(A)

eller Z-LLE-AMC (chymotryptisk aktivitet)

(B)

i 2 timer ved 37 ° C, og fluorescens blev registreret ved 380 nm excitation og 460 nm emission. Data (middelværdi ± SE, n = 3) er udtrykt som procentdele af ubehandlet kontrol. *,

P

0,05, **,

P

0,01, sammenlignet med ubehandlede kontroller under anvendelse envejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni-analyse.

Disse resultater indikerer, at ZNPP-induceret β-catenin proteinnedbrydning er ledsaget af en signifikant undertrykkelse af ubiquitin-proteasomaktivitet, hvilket tyder at proteasom nedbrydning ikke direkte udgør znPP-induceret undertrykkelse af β-catenin udtryk.

znPP fremmer ikke β-catenin protein eksport. En nylig rapport vist, at β-catenin protein udskilles i exosomer fra HEK293-celler, hvilket fører til en signifikant undertrykkelse af den kanoniske Wnt signalvejen [23]. For at bestemme om ZNPP-inducerer β-catenin proteinsekretion, A2780 celler blev dyrket i HBSS og behandlet med 5 pM eller 10 pM af ZNPP i 1,5 timer. Hele cellelysater og koncentrerede ekstracellulære proteiner blev fremstillet. Ca. 20-30 ug totalt cellelysat og ekstracellulære proteiner blev påsat en SDS-polyacrylamidgel. Western blot-analyse (figur 5 øverst) viser, at β-catenin-protein-ekspression blev undertrykt af ZNPP i cellelysatet og ikke påvises i det ekstracellulære proteinfraktion, hvilket indikerer, at ZNPP ikke inducerer β-catenin proteinsekretion. Nogle lavmolekylære bånd blev kun fundet i ekstracellulære proteiner, ikke i helcellelysater, hvilket antyder, at disse er ikke-specifikke. Denne konklusion blev yderligere støttet af Coomassie blue gel-farvning (Fig 5 lavere), der viser, at ZNPP behandling ikke ændrede de ekstracellulære proteinprofiler. Vi har også behandlet A2780 celler med 5 uM znPP i 72 timer og isolerede exosomer fra mediet. β-catenin var ikke påviselig i exosom proteiner ekstrakter (data ikke vist), yderligere at udelukke den mulighed, at β-catenin protein udskilles i exosomer upon ZNPP behandling.

A2780 celler blev dyrket i HBSS og behandlet med ZNPP ved de angivne koncentrationer i 1,5 timer. Det konditionerede HBSS blev opsamlet, og proteinerne blev koncentreret. Western-blot blev udført ved anvendelse af antistoffer mod β-catenin

(Top)

. Cellelysater og koncentrerede proteinprøver blev også adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie blue-farvning

(nederst)

. Vist er repræsentative billeder af tre individuelle eksperimenter.

lysosomer vej er sandsynligvis involveret i znPP-induceret β-catenin protein nedbrydning. Vi har tidligere vist, at lysosomale enzymer kan frigives ved forøget lysosom membranpermeabilitet, hvilket fører til spaltning af cellulære proteiner [14]. For at bestemme hvorvidt lysosomet protein nedbrydningsvej er involveret i ZNPP-induceret suppression af β-catenin-proteinekspression, undersøgte vi lysosom membranpermeabilitet efter ZNPP behandling. AO blev anvendt til at undersøge lysosom membranpermeabilitet den [14,24]. AO fortrinsvis akkumuleres i lysosomerne og udsender rød fluorescens ved excitation under sure betingelser. Når lysosomet permeabiliseres, vil AO flytte til cytosolen, hvor den udsender en grøn fluorescens ved excitation. Skiftet fra rød til grøn fluorescens indikerer en stigning i lysosom membranpermeabilitet [25]. Som vist i figur 6A, behandling med 5 uM ZNPP for 1, 4 eller 21 timer inducerede en tidsafhængig skift i AO-farvning fra rødt til grønt, hvilket indikerer, at ZNPP forøger lysosom membranpermeabilitet i A2780 celler. I modsætning hertil behandling med SnPP ikke medfører væsentlige ændringer i membranpermeabilitet (Fig 6C), i overensstemmelse med vores tidligere observation, at SnPP ikke inducerer suppression af β-catenin proteinekspression.

A2780 celler blev behandlet med 5 uM znPP (

A

) eller 5 uM SnPP (

B

) i 1, 4 eller 21 timer. Celler blev derefter inkuberet med 2,5 uM AO i 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange med HBSS. Billeder blev taget med et fluorescerende mikroskop (60X) med excitation ved 500 nm, emission ved 526 nm for AO grøn, excitation ved 460 nm, emission ved 650 nm for AO rød.

C

. A2780 celler blev forbehandlet med 21,2 uM Brefeldin A og 4 pM monensin i 4 timer. Cellerne blev derefter behandlet med 5 pM ZNPP i 1 time efterfulgt af inkubation med 2,5 pM AO i 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange med HBSS. Billeder blev taget med et fluorescerende mikroskop (60X) med excitation ved 500 nm, emission ved 526 nm for AO grøn og excitation ved 460 nm, emission ved 650 nm for AO rød. Vist er repræsentative billeder af tre individuelle eksperimenter.

BFA er kendt for at blokere intracellulær transport af lysosomale enzymer [26] og Monensin kan blokere forsuring af lysosomer [27,28]. testede vi derfor, om en BFA /Monensin cocktail kunne vende den lysosomet membranpermeabilitet induceret af znPP. Efter forbehandling af cellerne med en BFA /Monensin cocktail (slutkoncentration på 21,2 pM BFA og 4 pM monensin) natten over (fig 6B), en vending i ZNPP-induceret lysomal membranpermeabilitet blev observeret. Disse resultater understøtter involveringen af ​​lysosomet nedbrydningsvej i ZNPP-induceret suppression af β-catenin proteinekspression. For at bekræfte denne antagelse blev A2780 og DU145 celler behandlet med BFA /monensin cocktail natten over og behandlet med ZNPP i de angivne koncentrationer og varigheder (Fig 7). ZNPP-induceret suppression af β-catenin-protein-ekspression blev signifikant svækket ved forbehandling med BFA /Monensin cocktail. Virkningen af ​​ZNPP på β-catenin var både dramatisk og signifikant og tilbageførsel af BFA /Monensin blev kun observeret efter 0,5 og 1 times ZNPP behandling (data ikke vist). Imidlertid dæmpningen korreleret med koncentrationen og varigheden af ​​ZNPP behandling. Disse observationer viser yderligere, at lysosomet nedbrydningsvej sandsynligvis er involveret i ZNPP-induceret suppression af β-catenin proteinekspression.

A2780

(A)

eller DU145

(B)

celler blev forbehandlet med eller uden 21,2 uM BFA og 4 pM monensin natten over efterfulgt af behandling med 5 uM ZNPP i 0,5 eller 1 time.

C

. A2780 celler blev forbehandlet med 21,2 uM BFA og 4 um Monensin natten over efterfulgt af behandling med ZNPP i 1 time ved angivne koncentrationer. Celler blev høstet og lyseret. Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af antistoffer mod β-catenin og β-actin. Vist er repræsentative billeder af tre individuelle eksperimenter.

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse er designet til at udforske de potentielle cellulære mekanismer, der medierer znPP-induceret undertrykkelse af β-catenin udtryk ved hjælp kræftcelle modelsystemer. Det mest interessante fund fra denne undersøgelse er, at ZNPP-induceret β-catenin proteinnedbrydning er ledsaget af en signifikant inhibering af den ubiquitin-proteasom nedbrydningsvej; og lysosomer-medieret proteinnedbrydning synes at mægle denne begivenhed. Disse resultater belyse yderligere de cellulære mekanismer i znPP s anticancer aktivitet, og angive en potentiel ny strategi rettet mod β-catenin Wnt signalvejen for kræftbehandling.

β-catenin protein niveauer er velkontrolleret med phosphorylering og ubiquitin-proteasom nedbrydning [9]. Derfor vi oprindeligt troede, at ZNPP ville aktivere proteasomet nedbrydningsvej, hvilket fører til hurtig β-catenin proteinnedbrydning. Men flere linjer af eksperimentelle beviser viste, at proteasom nedbrydning ikke direkte medierer znPP-induceret β-catenin protein nedbrydning. Først blev β-catenin proteinphosphorylering, en begivenhed, der fører til ubiquitinering og efterfølgende proteasom nedbrydning af β-catenin, ikke induceret af ZNPP i cancerceller. Tværtimod ZNPP behandling mindskedes hurtigt phosphorylerede β-catenin-proteinniveauer, hvilket sandsynligvis skyldes den hurtige nedbrydning af det totale cellulære β-catenin-protein. For det andet, western blot-analyse af poly-ubiquitineret proteiner viste, at ZNPP inducerer akkumulering af poly-ubiquitineret proteiner, hvilket antyder, at ZNPP fungerer som en proteasominhibitor snarere end en aktivator. Tredje, co-IP med en β-catenin antistof og western blot analyse af K48-linkage specifikke poly-ubiquitineret proteiner viste, at poly-ubiquitineret β-catenin akkumuleret efter ZNPP behandling, i overensstemmelse med dets inhibering af proteasomaktivitet. Endelig en direkte måling af proteasomet chymotryptisk, tryptiske og caspase-lignende aktiviteter bekræftede, at ZNPP signifikant undertrykker proteasom aktiviteter på en tids- og koncentrationsafhængig måde i cancerceller. Så vidt vi ved, er dette den første påvisning af, at ZNPP er en proteasominhibitor. Bemærk, at ZNPP s proteasom inhiberende aktivitet er forskellig fra de tidligere fastsatte proteasom inhibitorer, såsom MG132 [21,22], idet ZNPP synes at have et bredere spektrum af proteasom inhiberende aktivitet (fig 3 og 4).

Den mulighed, at znPP kunne fremkalde β-catenin protein eksport gennem exosomer [23] og derved mindske cellulære β-catenin proteinekspression blev også ikke understøttes af vores eksperimentelle resultater. β-catenin-protein kunne ikke påvises ved Western blot-analyse af de ekstracellulære proteiner opsamlet fra de konditionerede medier af ZNPP-behandlede celler. Desuden har de exosomer isoleret fra medierne ikke indeholde p-catenin proteiner. Disse observationer indikerer, at ZNPP ikke inducerer β-catenin proteinsekretion fra cancerceller.

Vi har for nylig rapporteret, at zink ionoforer forbedre lysosom membranpermeabilitet fører til frigivelse af lysosomale enzymer og spaltning af cellulære proteiner [14]. I den foreliggende undersøgelse, anvendelse af AO tilladt os at påvise, at ZNPP forøger lysosom membranpermeabilitet i vores cancercelle modelsystem, hvilket antyder, at ZNPP undertrykkelse β-catenin-proteinekspression er et resultat af lysosomale enzym spaltning af cellulære proteiner. Vigtigere, ZNPP-induceret lysosom membranpermeabilitet effektivt kunne dæmpes ved forbehandling af cellerne med proteinet transport inhiberende cocktail BFA /Monensin [29], som er kendt for at blokere cellulær transport af lysosomer enzymer (BFA, [26]) og inhiberer lysosomer forsuring (Monensin, [27]). Mens denne hæmmende cocktail er ikke specifikke for lysosomerne, at brugen af ​​monensin og BFA ændre lysosom struktur og aktivitet er blevet veldokumenteret [30-32]. Disse observationer støtter konceptet, at lysosomet-medieret proteinnedbrydning pathway er involveret i ZNPP-induceret suppression af β-catenin-ekspression. Forbehandling af cancerceller med BFA /Monensin cocktail betydeligt svækket undertrykkelse af β-catenin-protein ekspression ved ZNPP hvilket yderligere bekræfter involveringen af ​​det lysosomale protein nedbrydningsvej i denne proces. Det er endnu ikke afgjort, om specifikke lysosomale enzymer er ansvarlige for znPP-induceret β-catenin protein nedbrydning eller om en udvalgt gruppe af proteiner nedbrydes gennem denne proces i kræftceller. Potentielle interaktion ubiquitin-proteasom systemet med lysosomet nedbrydningsvej [33,34], der kan tegne sig for ZNPP-induceret β-catenin proteinnedbrydning er under aktiv efterforskning. I betragtning af, at der ikke er nogen tidligere rapporter om lysosomer-medieret hæmning af β-catenin udtryk, resultaterne fra denne undersøgelse giver ny indsigt i znPP s anticancer aktivitet og afsløre potentielle nye strategier i at undertrykke den kanoniske Wnt signalvejen.

sammenfattende har vi undersøgt cellulære mekanismer som medierer ZNPP-induceret suppression af β-catenin-ekspression i cancerceller. Vores resultater viser, at lysosomet nedbrydningsvej sandsynligvis er involveret i ZNPP undertrykkelse af β-catenin-ekspression, og at denne proces ledsages af en inhibering af proteasomaktivitet. Disse resultater giver en hidtil ukendt cellulære mekanisme af ZNPP s anticanceraktivitet og implicere en ny strategi for målretning den kanoniske Wnt signalvejen.