PLoS ONE: tumorangiogenese efter Opvarmet Lipiodol Infusion via den hepatiske arterie i en kanin Model of VX2 Liver Cancer

Abstrakt

Målsætninger

Denne undersøgelse havde til formål at observere ændringer i tumorangiogenese efter opvarmet lipiodol (60 ° C) infusion via den hepatiske arterie i en kaninmodel af VX2 leverkræft. Salg

Materialer og metoder Salg

Tyve kaniner med VX2 hepatiske tumorer blev tilfældigt inddelt i 2 grupper (10 kaniner i hver gruppe). Under anæstesi, blev en trans-kateter hepatisk arteriel infusion udført, og lipiodol (37 ° C; kontrolgruppe) eller opvarmet lipiodol (60 ° C; behandlet gruppe) blev injiceret i de hepatiske arterier i dyrene. Derefter blev ændringer i tumorangiogenese vurderes efter følgende markører og metoder. 1. Vaskulær endotelvækstfaktor receptor (VEGFR) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) ekspressionsniveauer i tumoren blev vurderet ved anvendelse western blotting og real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR). 2. prolifererende cellekerneantigen (PCNA) ekspression i tumoren blev bedømt ved immunhistokemisk farvning. 3. blev observeret morfologiske ændringer i tumor vaskulære endotelceller ved hjælp transmissionselektronmikroskopi (TEM).

Resultater

VEGFR og VEGF mRNA og protein ekspressionsniveauer blev reduceret i den behandlede gruppe sammenlignet med den kontrolgruppe. PCNA protein sås lavere ekspressionsniveauer i den behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. TEM indikerede, at endotelceller endoplasmatiske reticulum udvidet, den chondriosome var hævede, og endothelceller mikrovilli blev nedsat efter opvarmet lipiodol infusion.

Konklusioner

tumorangiogenese af kaniner med VX2 kræft blev hæmmet efter arteriel opvarmet lipiodol infusion forhold til lipiodol infusion

Henvisning:. Cao W, Xu X, Zhang J, Duan Y (2013) tumorangiogenese efter opvarmet lipiodol infusion via den hepatiske arterie i en kanin Model of VX2 leverkræft . PLoS ONE 8 (4): e61583. doi: 10,1371 /journal.pone.0061583

Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: December 6, 2012; Accepteret: 11. marts 2013; Udgivet 24. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.170.400, https://www.nsfc.gov.cn) og Shaanxi-provinsen Videnskab og Teknologi Development Projection (No.2011K13-01-16; http: //www.sninfo.gov.cn). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Transkateter chemoembolization (TACE) er blevet accepteret som en af ​​de mest effektive former for palliativ behandling for patienter i midten og sene stadier af hepatocellulært carcinom (HCC) såvel som for dem, der ikke gode kandidater til kirurgi i de asiatiske lande, herunder Kina [1], [2], [3]. Men langsigtede overlevelse efter en TACE procedure ikke er tilfredsstillende; de fem-års overlevelse spænder i øjeblikket fra 9% til 32% [4], [5]. TACE kan reducere tumorstørrelse [6], [7]. Imidlertid har andre undersøgelser vist TACE at være utilfredsstillende, fordi tumor angiogenese kan stige efter TACE, og kun en lille del af HCCs blev komplet [8] nekrose. Derfor hæmme tumorangiogenese efter TACE terapi kan være en lovende strategi for at forbedre behandlingen effektivitet.

For nylig har nogle undersøgelser brugt termoterapi til at undertrykke tumorvækst i leveren [9], og har bekræftet, at behandling med lipiodol ved 60 ° C forlænger overlevelsen af ​​kaniner med VX2 kræft ved at hæmme tumorvækst. Desuden denne behandling påvirker serum AST niveauer svarende til lipiodol ved 37 ° C [10]. In vivo undersøgelser har også påvist, at opvarmet saltvand infusion via den hepatiske arterie kan ændre tumoren vaskulær permeabilitet ved at påvirke ekspressionsniveauerne af VEGF eller VEGFR [11], [12], fordi disse to proteiner er to vigtige faktorer i forbindelse med tumorangiogenese [13 ], [14]. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at observere ændringer i tumor angiogenese og analysere de underliggende årsager efter trans-hepatiske, arterielle, opvarmet (60 ° C) lipiodol embolisering via den hepatiske arterie i en kanin model af VX2 leverkræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af vores institutionelle Dyrepleje og brug udvalg (2.010.038) og i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier.

dyremodeller

Tyve mandlige New Zealand hvide kaniner (vejer 3,0-3,5 kg, gennemsnit 3,2 ± 0,2 kg) blev udvalgt tilfældigt fra den eksperimentelle dyr centrum for vores universitet. VX2 carcinomaceller blev opretholdt som en tumor linje i vores laboratorium.

Kaninerne blev bedøvet med intravenøs natriumpentobarbital (25 mg /kg). Derefter blev hårene over maveregionen af ​​kaninerne fjernes med 8% natriumsulfid, og regionen blev renset med saltvand. En suspension af VX2 tumorvæv (ca. 1,5-2 × 10

6 celler) blev injiceret via en 18-gauge kanyle i venstre lap af leveren perkutant med ultralyd vejledning. Såret blev holdt sterile, og de vitale kanin tegn (især satsen for respiration) blev nøje overvåget under implantation. Derefter blev antibiotika (gentamicin 2,5 mg /kg) injiceret intramuskulært efter implantationen. Dyrene blev observeret af sonografi (Acuson Corp., USA), indtil tumorerne nåede 2 cm i diameter og blev derefter anvendt til eksperimenter. Ultralyd blev udført af den samme operatør med en 7v3c sonde med en frekvens på 7,0 MHz.

Eksperimentel Gruppering

Tyve tumor-bærende kaniner blev tilfældigt opdelt i 2 grupper (n = 10 pr gruppe) ; hver gruppe fik en af ​​to præparater.

Kontrolgruppen modtog et præparat af lipiodol (Aulnay Sous-Bios, Frankrig) ved fysiologisk temperatur (37 ° C).

Behandlingen gruppe fik et præparat fremstillet ved opvarmning lipiodol til 60 ° C med en konstant temperatur inkubator.

Arterial kateterisation

en indsnit i bedøvede kaniner for at eksponere deres højre femorale arterie. Derefter blev en mikro-kateter (2,7 /2,9 Fr Reshapable Type, Terumo, Japan) blev indsat i den femorale arterie og anbringes i den hepatiske arterie under fluoroskopi.

Dernæst under fluoroskopi, fremstillingen perfusion (1 ml /body) for hver gruppe blev gradvist hånd-injiceres i den hepatiske arterie, med stor omhu for at holde kateterspidsen i den hepatiske arterie og undgå udstrømning af præparatet. Efter intraarteriel injektion blev kateteret fjernet, lårarterien blev ligeret, og operationssår blev lukket. Den kanin vitale tegn, især dens respiration sats, blev nøje overvåget under den angio-procedure. DSA billeder af VX2 levertumor farvning erhvervet før og efter infusionen.

Animal Sacrifice

Ved 24 timer efter fremstillingen infusion, blev dyrene aflivet med en overdosis af chloralhydrat.

Immunhistokemi

Tumor vævsprøver fra hver kanin blev fikseret i 10% neutral bufret formalin og indlejret i paraffin. Derefter blev 3- til 5-um-tykke skiver skåret og behandlet til immunohistokemisk farvning.

For at påvise ekspression og placering af PCNA protein i tumorvæv blev prøven sektioner inkuberet natten over ved 4 ° C med en muse-anti-PCNA (Abcam, Cambridge, UK) monoklonalt antistof og derefter med et anti-muse-sekundært antistof (Dako) i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter de bindende reaktioner blev visualiseret med 3-30-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) substrat . Kernerne blev let modfarvet med hæmatoxylin. Den immunhistokemisk farvning blev evalueret af 2 patologer på en blændet måde. Hele afsnit af hvert dias blev undersøgt under lysmikroskopi. De PCNA-proteinniveauer blev gradueret i fire grupper: 0, ingen farvning; 1+, cytoplasmatisk farvning i mindre end 10% af cellerne; 2+, cytoplasmatisk farvning i 10-50% af cellerne; og 3+, cytoplasmatisk farvning i mere end 50% af cellerne

Real Time kvantitativ polymerasekædereaktion

tumor prøver blev opsamlet og opbevaret i RNAwait (Applygen, Beijin, Kina) på. – 70 ° C efter kaninerne blev aflivet. Totalt RNA blev isoleret fra prøverne med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA med First-Strand cDNA Synthesis Kit (Toyobo, Osaka, Japan). Oligonukleotidprimerne til polymerasekædereaktion (PCR) blev udformet som følger: VEGF, 5′-GCAGAAGAAGGAGACAATAAACC-3 ‘og 5′-GCACGCAGGAAGGCTTGAATA-3′; VEGFR 5’-CCAGGGAGAAGCAGAGCCAC-3 ‘og 5′-TGCCAATACCAGCGGATGTG-3′; og β-actin, 5’-CGAGATCGTGCGGGACAT-3 ‘og 5′-CAGGAAGGAGGGCTGGAAC-3’. PCR-reaktionerne blev udført tredobbelt under anvendelse af SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Toyobo). De relative ekspressionsniveauer af VEGF-mRNA blev kvantificeret under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode [15].

Western Blotting

Prøverne blev lyseret i iskold lyseringsbuffer (2 mM EDTA , 10 mM EGTA, 0,4% NaF, 20 mM Tris-HCI, 1% NP-40, 1% Triton X-100, proteaseinhibitorer, pH 7,5) under anvendelse af en glashomogenisator. Protein- koncentrationer blev målt under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) protein-assay (Pierce, Rockford, IL). Proteinerne blev separeret ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og overført til Hybond ECL nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Western blot analyser blev udført ved anvendelse af et anti-VEGFR-antistof (Abcam, Cambridge, UK) og et anti-VEGF-antistof (Santa Cruz, CA, USA), og et anti-β-actin-antistof blev anvendt som intern kontrol. Derefter blev prøverne inkuberet med en art-matchede peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof. Blottene blev fremkaldt med en chemiluminescens substratopløsning (Pierce, Rockford, IL) og eksponeret for røntgenfilm. De IDVs blev beregnet ved hjælp af et edb-billede-analysesystem (Fluor Chen 2.0) og normaliseret til ekspressionen af ​​β-actin.

Transmission Electron Microscopy (TEM)

Efter tumorvæv blev opnået , rå mikrokarrør fraktioner isoleret fra tumorvævet blev udvalgt og inddelt i 1 mm

3 stykker og fikseret med 2,5% glutaraldehyd-4% paraformaldehyd i adskillige dage ved 4 ° C. Derefter anvendelse af standardprocedurer blev semi-tynde og ultratynde snit fremstillet og farvet med uranylacetat og bly citrat og ændringer i tumoren vaskulære endotelceller blev observeret ved anvendelse af TEM (JEM-1200EX, Jeol, Tokyo, Japan).

statistiske analyser

Alle resultater er angivet som gennemsnit ± SD for hver gruppe. Den t-test blev udført for at sammenligne de to grupper, og Mann-Whitneys U-test blev anvendt til at sammenligne PCNA-proteinniveauer mellem grupperne. En P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 16,0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

DSA billede

Efter embolisering, leveren DSA billeder af kaninerne i lipiodol (60 ° C) gruppe viste konturerede opacitet i tumoren region, et tegn på fuldstændig okklusion af tumorvaskulatur, de proximale normale kar af kaniner stadig patent (fig. 1).

tumorerne viste hypervaskularitet i leveren som bestemt med DSA billeddannelse (A, sort pil). Efter lipiodol (60 ° C) injektion, tumorer er helt eller stort set de-vaskulariseret og vise på DSA som en lipiodol fylder defekt (B, sort pil).

Immunohistokemiske Fund

Immunohistokemisk analyser afslørede, at PCNA-proteinekspression blev påvist primært i levedygtige VX2 tumorceller (fig. 2). Vi fandt, at PCNA ekspressionsniveauer i den behandlede gruppe var lavere end i kontrolgruppen (tabel 1)

Som påvist gennem immunhistokemi blev PCNA proteinekspression påvist primært i levedygtige VX2 tumorceller (brun;. A, kontrol 400 ×;.. B, behandlet 400 ×)

real-time kvantitativ PCR og Western Blot Resultater

som påvist ved real-time kvantitativ PCR (figur 3) VEGF og VEGFR-mRNA-niveauer i den behandlede gruppe var signifikant lavere end i kontrolgruppen. Western blot analyserne viste, at ekspressionsniveauerne af VEGFR og VEGF-protein i den behandlede gruppe var også signifikant lavere end i kontrolgruppen (fig. 3).

De relative ændringer i VEGFR eller VEGF protein og mRNA-niveauer i tumorvæv blev påvist efter behandling i hver gruppe (n = 10). A og B. VEGFR og VEGF mRNA ekspressionsniveauer blev vurderet ved anvendelse real-time kvantitativ PCR som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. C og D. VEGFR og VEGF proteinniveauer blev påvist under anvendelse af Western blot-analyse (øvre panel). β-actin blev detekteret som en loading kontrol. VEGFR og VEGF ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved densitometri og plottet som fold-change (nederste panel). Værdierne præsenteres som gennemsnit ± SD af 3 uafhængige forsøg (*

P

. 0,05

vs kontrolgruppe

).

TEM Resultater

TEM resultaterne viste, at den opvarmede lipiodol perfusion inducerede vaskulære endotelcelle endoplasmatisk reticulum at udvide og chondriosome at svulme op, og endothelceller mikrovilli blev reduceret (fig. 4).

Stimuleret af opvarmet ( 60 ° C) lipiodol perfusion, TEM resultaterne viste, at tumoren endotelcelle mikrovilli faldt (A, 5000 ×), den vaskulære endotelcelle endoplasmatisk reticulum ekspanderet, og chondriosome blev kvældet (B, 10000 ×).

diskussion

TACE for tumor de-vaskularisering blev udviklet i 1970’erne [16]. I øjeblikket TACE er den mest udbredte primære behandling for inoperabel HCCs og er også den mest flittigt brugt terapi for patienter på venteliste til levertransplantation. TACE forsinker væsentligt tumor progression [17], men et par undersøgelser har rapporteret en stigning i serum VEGF niveauer efter TACE [18]. De høje VEGF-niveauer 1-2 dage efter TACE i HCC patienter er forbundet med fjernmetastaser og ugunstige resultater [19].

Lipiodol er blevet anvendt som en bærer af antitumormidler i målrettet kemoterapi for hepatocellulært carcinom, og lipiodol er ikke kun bruges til at emulgere lægemidler til TACE, men også som et embolisering agent for trans-hepatisk arteriel embolisering og for tumor de-vaskularisering [17]. Fordi VEGF proteinekspression i tumorer kan reagere på varme [11] og de levedygtige tumorceller vaskulære endotelceller er følsomme over for varme skade [20], og massespektrometrisk analyse af lægemiddel viste at cisplatin ikke påvirkes af varme [21], og doxorubicin og mitomycin-C er heller ikke nedbrydes ved temperaturer på 60 grader C [21], opvarmet lipiodol som en ny embolisk middel via hepatisk arterie administration kan fordele varmen og emulgere konventionelle TACE lægemidler (doxorubicin, mitomycin-C, cisplatin) til hele tumor og kan påvirke VEGF protein ekspressionsniveauerne i tumoren eller tumorvaskulaturen.

Forebyggelse tumorangiogenese Efter opvarmet lipiodol Injection

Efter opvarmet lipiodol injektion, TEM afslørede, at tumoren endotelceller endoplasmatiske reticulum udvidet, den chondriosome var opsvulmet, og endothelceller mikrovilli var nedsat, hvilket er tegn på endotelcelle beskadigelse. Disse tegn, selv om indirekte støtter varmen virkning på endotelceller i VX2 tumorer; intra-arteriel lipiodol (60 ° C) injektioner syntes at resultere i tumor kapillærbane ødelæggelse.

Faktisk, selvom varme er toksisk for tumorvaskulære endotelceller, den præcise virkning af varme på cellerne varierer med varme omfang og varighed. Alvorlig eller langvarig varme kan ændre intracellulære proteiner (såsom collagen denaturering og lipiddobbeltlag optøning) og inducerer celledød; hvis varmen er mild eller kort varighed, kan det forårsage en række adaptive genetiske ændringer i cellerne [22].

Opvarmet lipiodol perfusion er muligvis ikke tilstrækkeligt til at inducere tumor vaskulær endotel celledød men kan forårsage en serie af adaptive genetiske eller intracellulære proteiner ændringer såsom ændring af VEGFR-ekspression i tumorceller vaskulære endotelceller. Fordi ændringen af ​​VEGFR-ekspression er nært relateret til ændringer af endotelcelle morfologi [23], vi observerede morfologiske ændringer i tumor vaskulære endotelceller ved TEM efter opvarmet lipiodol infusion. Vi observerede faldet i VEGF og VEGFR-mRNA og protein ekspressionsniveauer resulterede fra tumoren og endotelcelle reaktioner på den opvarmede lipiodol perfusion procedure hhv. Den faldt VEGF og VEGFR protein niveauer kan skyldes tumor angiogenese hæmning.

Forebyggelse Tumor vækst efter Opvarmet Lipiodol Perfusion

Temperaturer over 42,5 ° C er effektive til at undertrykke tumorcellevækst [24], men hvis temperaturen hæves over 45 ° C, beskadigelse normale leverceller bliver irreversibel [24]. Ved at forstå den ikke-homogen fordeling af blodkar, afkølingen af ​​tumor blodgennemstrømning og tumor størrelsesforskelle, konkluderer vi, at temperaturen af ​​den opvarmede lipiodol inde tumorerne skal være mindst 43 ° C. I denne undersøgelse, for det første vi gradvist hånd-injiceres under fluoroskopi at undgå reflux under perfusion, for det andet brugte vi perkutan matematiske temperatur optager til overvågning af perfusion temperatur, så temperaturen af ​​den opvarmede lipiodol inde i levervæv var ikke mere end 45 ° C under den opvarmede perfusion, og i vores undersøgelse de proksimale normale fartøjer kaniner stadig patent observeret af DSA efter opvarmet perfusion.

Brug immunhistokemi, observerede vi lave PCNA proteinekspression i tumorceller efter opvarmet lipiodol perfusion. Ifølge vores PCNA data, behandling med 60 ° C lipiodol markant hæmmet tumorvækst i kaniner med VX2 carcinomer forhold til gruppen behandlet med 37 ° C lipiodol.

Det er blevet rapporteret, at tumor angiogenese hæmning forbedrer anti-tumor effekt [25]. Fordi anoxemic tumorceller har vist sig at være mere følsomme over for varme end normale celler [26], [27] og den opvarmede lipiodol kan ødelægge tumoren kapillære leje, kan den opvarmede lipiodol tilbageholdes i tumoren, og varme kan distribueres til de neogenetic kapillærer hele tumoren. Teoretisk kan mere varme trænge ind i ekstracellulære rum af tumorceller for at opnå en forøget terapeutisk virkning. De længere tumorkapillærer forblev i området fra 43 ° C til 45 ° C, den mere helbredende virkning varmen havde på tumorvæv, og derefter resultere i hæmning af væksten tumorangiogenese og tumorceller «.

Begrænsninger

Selvom vi har forsøgt at anvende en perkutan matematisk temperatur optager til overvågning, vi var i stand til præcist at måle temperaturen af ​​den opvarmede lipiodol i hele tumor. Viskositeten skift af lipiodol med øget temperatur og virkningen af ​​viskositeten ændring på tumor såsom biodistribution ændre ikke evalueret i vores undersøgelse, men vil blive behandlet i fremtidige studier.

VX2 tumor er kendt for at udvikle nekrose som kan ændre neovaskularisering sats, så i denne undersøgelse udvalgte vi VX2 tumorer (14 dage efter implantation) til eksperimentel behandling, fordi de VX2 tumorer i denne fase har en forholdsvis stor tumorvolumen men små tumor nekrose og derfor har mindre effekt på neovaskularisering sats [10], [28].

konklusioner

effektivt hæmme tumorangiogenese efter TACE har været et forskningsemne i nogen tid. I denne undersøgelse fandt vi, at faldet VEGF og VEGFR protein niveauer kan skyldes tumor angiogenese hæmning i kaniner med VX2 kræft efter arteriel opvarmet lipiodol infusion, men de kliniske fordele ved denne tilgang har brug for yderligere evaluering, såsom lipiodol viskositet forandring og biodistribution forandring med forøget temperatur og så videre, bør overvejes. Således kunne denne undersøgelse i sidste ende lette præklinisk forskning, og vi mener, at opvarmet lipiodol injektion effektivt kan behandle avancerede eller tilbagevendende HCCs.