PLoS ONE: opregulering af MicroRNA-145 Associates med lymfeknudemetastaser i kolorektal Cancer

Abstrakt

Metastase er den vigtigste årsag til dødelighed hos patienter med solide tumorer. Identificere de nøjagtige molekyler forbundet med CRC metastase kan være afgørende at forstå processen, som også kunne oversættes til diagnose og behandling af CRC. I denne undersøgelse undersøger vi associering af microRNA ekspressionsmønstre med lymfeknudemetastase af colorektal cancer. Blandt disse kandidat miRNA blev ekspressionen af ​​miRNA-145 signifikant relateret til lymfeknude metastaser af CRC. Begge

in vitro

in vivo

undersøgelse viste, at opregulering af miR-145 kunne forbedre muligheden for migration og invasion af kolorektal cancer celle, mens der blev observeret nogen effekt på spredning. Mekanismen for denne kampagne er forbundet med stabilisering af Hsp-27, et protein, der spiller en vigtig rolle i fremme af metastase. Disse resultater kan være afgørende for at forstå CRC metastase og kan oversættes til diagnose og behandling af CRC

Henvisning:. Yuan W, Sui C, Liu Q, Tang W, En H, Ma J (2014) Op -forordning af mikroRNA-145 Associates med lymfeknudemetastaser i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10,1371 /journal.pone.0102017

Redaktør: Rolf Müller, Philipps Universitet, Tyskland

Modtaget: April 10, 2013; Accepteret: 14 Juni 2014; Udgivet: 14 juli 2014

Copyright: © 2014 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Basic Research Program Kina (Grant nr. 2011CB911004), The Beijing Training Project for de førende talenter (Z131107000513001), Beijing Nova Program (Z131107000413066) og Beijing Natural Science Foundation of China (Grant nr. 7.122.150). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) rangerer den tredje mest almindelige tumor og den fjerde hyppigste årsag til dødelighed af kræft på verdensplan [1]. Selvom mange resultater er blevet gjort i behandlingen af ​​CRC i de seneste årtier, har den samlede overlevelsesraten for patienter med CRC marginalt ændret. Dårlig prognose og overlevelsesrate skyldes hovedsagelig metastase, således mere end en tredjedel af patienterne med CRC i sidste ende vil udvikle metastatiske sygdomme [2]. Derfor identificere de præcise molekyler forbundet med CRC metastaser kan være afgørende for at forstå den proces, som kunne også oversættes til diagnosticering og behandling af CRC.

MikroRNA’er (miRNA) er 21- til 25-nukleotid enkelt- strandede, ikke-kodende RNA-molekyler, der udøver deres funktioner ved binding til 3′-utranslaterede regioner af deres tilsvarende mRNA-mål [3]. Det er blevet anslået, at en tredjedel af det samlede humane gener kan reguleres af miRNA, hvilket indikerer, at miRNA har afgørende roller i fysiologiske og patologiske processer [4] – [5]. Et stort antal resultater viser, at miRNA er impliceret i humane cancere. Den uhensigtsmæssige ekspression af miRNA kan føre til afvigende ekspression af genprodukter, som kan bidrage til erhvervelse af kendetegnene ved kræft. Disse observationer foreslog funktion miRNA som tumorsuppressorer eller onkogener [6] – [8].

For nylig viste overbevisende dokumentation for, at en række miRNA spiller afgørende roller i CRC metastaser. F.eks Asangani et al. identificeret mir-21 som metastaser promotor i CRC [9]. Liu et al rapporterede, at MIR-499-5p forstærket cellulær invasion og tumormetastase i CRC ved at målrette FOXO4 og PDCD4 [10]. Okamoto K, viste, at opregulering af miR-493 under carcinogenese kunne forhindre levermetastaser i CRC [11]. Men metastaser følge af en kompliceret kaskade af biologiske processer og de nøjagtige molekylære mekanismer bag CRC metastaser er langt fra fuldt forstået.

I denne undersøgelse de miRNA udtryk profiler i primær CRC læsion med eller uden lymfeknude metastaser blev analyseret ved anvendelse af en miRNA microarray og kvantitativ revers-transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR). I den forbindelse blev MIR-145 valgt som det vises dramatiske opregulering i CRC med lymfeknudemetastaser sammenlignet med den uden lymfeknudemetastaser. Begge

in vitro

in vivo

undersøgelse viste, at opregulering af miR-145 kunne forbedre muligheden for migration og invasion af kolorektal cancer celle. Desuden blev iTRAQ (isobarisk tag for relativ og absolut kvantificering) mærkning og 2DLC-ESI-MS /MS (væskekromatografi tandem MS) anvendes til at identificere cellulære proteiner, som var direkte eller indirekte reguleret af MIR-145. Disse resultater antydede, at MIR-145 kan spille en vigtig rolle i metastase af CRC ved stabilisering af Hsp-27.

Resultater

1. Forskellige miRNA udtryk profiler af CRC med eller uden lymfeknude metastaser

For at undersøge sammenslutning af microRNA ekspressionsmønstre med lymfeknude metastaser af kolorektal cancer, otte primære kolorektale cancer væv stammer fra stadie II-III kolorektal cancer patienter med (n = 4) eller uden (n = 4) lymfeknudemetastase blev opsamlet, og de miRNA udtryk profiler af dem blev bestemt ved anvendelse Agilent miRNA microarray. Blandt de unikke 851 menneskelige miRNA sonde, blev 32 miRNA identificerede udtrykkes forskelligt i CRC væv mellem lymfeknude metastaser positive og negative gruppe (

P

0,05). Tyve en af ​​dem blev iagttaget væsentligt forøget ekspression i CRC med lymfeknudemetastaser. På den anden side, 11 af dem blev underexpressed betydeligt i lymfeknudemetastaser positive CRC væv. Unsupervised clustering analyse med disse 32 betydeligt dysreguleret miRNA (21 miRNA med betydelig overekspression og 11 miRNA med betydelig nedregulering) var i stand til at skelne de CRC’er med eller uden lymfeknude metastaser (fig. 1A).

A. Den certificerede resultat af microarray analyse. Hierarkisk gruppering af 32 markant dysreguleret miRNA udtryk profiler i humane primære kolorektale cancer væv afledt af kolorektal cancer patienter med (LNM-P, n = 4) eller uden (LNM-N, n = 4) lymfeknude metastaser. B.Validation af udvalgte miRNA forudsiges at blive dysreguleret i CRC med eller uden lymfeknudemetastaser hjælp QRT-PCR i de samme væv, der anvendes til microarray analyse. Data, der er vist i B er repræsentativ for tre uafhængige forsøg, og præsenteres som fold udtryk normaliseret til U6 ± SD (standardafvigelse) .C. QRT-PCR-analyse af den relative ekspression af MIR-145 i yderligere 202 (LNM-N = 99; LNM-P = 103) tilfælde af humane CRC væv, herunder tumor prøve (T) og matchende vævsprøven ikke-tumor (NT) fra den samme patient. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer og normaliseret til U6. *

P

0,05, **

P

. 0,01

2. Verifikation af miRNA-ekspression ved real-time PCR-analyse

For at validere miRNA microarray data, vi udførte kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) til at analysere ekspressionsniveauet af 11 miRNA som var de mest betydeligt dysreguleret miRNA eller som ikke blev rapporteret sin tilknytning til metastase, herunder miR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5p, -145, -376c, -29b, -95 og -1274a. Vi undersøgte ekspressionen af ​​miRNA i de samme væv, der anvendes til microarray analyse. Efter normalisering med det endogene kontrol U6, QRT-PCR data bekræftede, at ekspressionen af ​​8 miRNA viste at være i overensstemmelse med microarray resultat. Blandt dem, ekspressionen af ​​miRNA-145 vises den væsentligste forskel mellem cancervæv af de to grupper (fig. 1B).

For yderligere at bekræfte MIR-145 ekspressionsprofil blev QRT-PCR-analyse udført i yderligere 202 CRC prøver (99 CRC patienter med lymfeknudemetastaser og 103 CRC patienter uden lymfeknudemetastaser) (se tabel 1 og tabel S1). Som vist i fig. 1C, miR-145 blev underexpressed i tarmkræft prøver med eller uden metastaser i forhold til tilstødende normale væv henholdsvis, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter, som andre [14]. Imidlertid ekspressionen af ​​MIR-145 var signifikant opreguleret i CRC med lymfeknudemetastaser end uden lymfeknudemetastaser. Denne ændring foreslog, at miR-145 kan spille en vigtig rolle i CRC lymfeknude metastaser.

3. Overekspression af miR-145 har ingen virkning på spredning af HCT-8 celler

For at bestemme, om ekspressionen af ​​miR-145 påvirker den biologiske funktion af CRC celler blev miR-145 overudtrykte model skabt i HCT-8 celler ved hjælp af et lentivirus system, som blev omtalt som HCT-8-miR-145 celler i dette papir. MIR-145 niveauer af HCT-8-MIR-145-celler og mock kontrolceller (HCT-8-NC) blev bestemt ved anvendelse QRT-PCR (fig. 2A). En væsentlig opregulering af MIR-145 i HCT-8-MIR-145-celler blev observeret sammenlignet med den i HCT-8-NC-celler. At observere effekten af ​​MIR-145 på HCT-8-celler, blev cellevækst sats eller cellecyklus evalueres ved CCK-8 eller FACS-assay, hhv. Som vist i fig. 2B og 2C, proliferationshastigheden eller cellecyklus af HCT-8-MIR-145-celler ændrede sig ikke sammenlignet med HCT-8-NC. Dette resultat antydede, at overekspression af MIR-145 ikke signifikant indflydelse på proliferation eller cellecyklus af HCT-8-celler.

(A) QRT-PCR-analyse af MIR-145-ekspression i HCT-8-celler transficeret med Lenti-mIR-145 ekspressionsvektor eller miRNA negativ kontrol vektor under anvendelse af et lentivirus system. (B) proliferationshastigheder af HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC-celler detekteres af CCK-8 assay. (C) Cellecyklusanalyse af HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC-celler ved flowcytometri. Dataene repræsenterer gennemsnit + SD af tre uafhængige forsøg.

4. miR-145 fremmes CRC migration og invasion

in vitro

in vivo

Vi analyserede derefter, om miR-145 bidrog til at ændre den vandrende mobilitet CRC celler. Sammenlignet med den mock gruppe blev cellemigrering signifikant forøget i HCT-8-MIR-145-celler i et transwell cellemigrationsassay (fig. 3A). Et lignende resultat blev også observeret i en celle invasion assay (fig. 3B). Vi bestemt også mulighed for miR-145 for at fremme migration i andre CRC cellelinier (SW480 og SW620). Som vist i fig. S1 i File S1, overekspression af miR-145 signifikant øget vandrende evne SW620 celler, mens nogen tilsyneladende ændring i SW480-celler (data ikke vist). Kollektivt, disse resultater giver stærke beviser for, at opregulering af miR-145 kan fremme celle migration og invasion

in vitro

. Fordi ekspressionen af ​​MIR-145 i HCT-8-celler udviste den laveste ekspression sammenlignes med den i andre CRC-celler, blev resten af ​​arbejdet fokuseret på dette CRC cellelinie at illustrere typiske validering.

(A) migration og invasion (B) assay af HCT-8-mIR-145 eller HCT-8-NC-celler. Billederne var repræsentanter for mindst tre uafhængige forsøg. Gennemsnitligt antal migration celleantal pr felt fra mindst tre uafhængige forsøg ± SD er vist ved søjle- figur. **

P

0,01. (C) Photo-billeder af mesenteriske lymfeknudemetastase fra nøgne mus, som blev injiceret i leveren med HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC celler efterfulgt af kirurgisk sutur. Dyr blev dræbt 2 uger efter intrahepatisk celleinokulering. (D) Forekomsten af ​​mesenterisk lymfeknude-metastase i mus (tabel) og gennemsnitlig antal synlige metastatiske knuder i mesenteriet (kolonne figur). **

P

. 0,01

For yderligere at bekræfte dette begreb blev en ortotropisk transplantation nøgen musemodel etableret for at undersøge, om overekspression af miR-145 kan fremme tumormetastaser

in vivo

. Vi fandt ingen signifikant forskel i vægt eller volumen af ​​de primære tumorer i leveren transplanteret af både HCT-8-miR-145 celler og HCT-8-NC celler. Vi fandt også, at 100% af mus i HCT-8-MIR-145 gruppe havde mesenteriske lymfeknude metastaser og middelantallet af metastatiske knuder nåede 149 ± 15. Men der var ingen af ​​musene i HCT-8-NC kontrolgruppen viser mesenterisk lymfeknude metastaser (fig. 3C, 3D). Tilsammen disse resultater bekræftede, at højt niveau af miR-145 kunne fremme CRC migration og invasion

in vitro

in vivo.

5. Analyse af differentielt udtrykte proteiner

Ovenstående resultater viste, at miR-145 fungerer som en prometastatic miRNA i CRC. At sigte mod at opnå en bedre forståelse af proteiner, der er berørt, enten direkte eller indirekte af miR-145 overekspression, HCT-8-miR-145 og HCT-8-NC-celler blev lyseret, og udsat for iTRAQ mærkning, 2DLC-ESI-MS /MS analyse. I alt 1117 forskellige proteiner blev identificeret og kvantificeret, som efterfølgende blev filtreret med manuelt udvalgte filter udelukkelse parametre. Vi tog en 1,3 gange ændring cut-off for iTRAQ forholdet til at klassificere proteiner som op eller nedregulering. Denne cut-off blev anvendt, fordi flere tidligere iTRAQ undersøgelser i vores laboratorium viste, at den tekniske variation var konsekvent under 30%, at kriteriet om cutoff blev også accepteret af tidligere forskning [12]. Proteinerne blev betragtet op eller kun nedreguleres, når ekspressionsprodukterne forhold (HCT-8-MIR-145-celler vs. HCT-8-NC-celler) var 1.3 (1 × 1.3) eller 0,77 (1 × 1.3) oG viste statistisk signifikans.

13 proteiner blev således screenet som differentielt udtrykte proteiner, herunder 7 betydeligt opreguleret proteiner og 6 bemærkelsesværdigt nedreguleret proteiner (tabel S2, S3). Blandt 13 differentielt udtrykte proteiner blev den opregulering af varmechokprotein 27 (Hsp-27) valideret ved anvendelse western blotting (fig. 4A). Vi valgte derfor Hsp-27 for yderligere undersøgelse.

(A) Ekspressionsniveauerne for Hsp-27 blev undersøgt i HCT-8-miR-145 eller HCT-8-NC celler ved western blotting analyse. (B) Ekspressionen af ​​Hsp-27-protein blev påvist i CRC og tilstødende normale væv ved Western blot-assay. De relative Hsp27 /actin forhold af individuelle bånd er vist som middelværdien + SD af værdier for alle patientprøver (Ikke-tumorvæv, n = 47; LNM-P tumorvæv, n = 41; LNM-N tumorvæv, n = 43). (C-D) MIR-145 Enhanced Hsp-27 Stabilitet i CRC Cells.HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC-celler blev inkuberet med proteinsynteseinhibitoren cycloheximid (CHX, 0.5 ng /nl) (C) eller proteasominhibitor MG-132 (5 uM) (D) i 24 timer. Niveauet af total Hsp-27 blev påvist ved western blotting-analyse. De relative Hsp27 /actin forhold mellem de enkelte bands er vist som gennemsnit ± SD af værdier normaliseret til beta-actin.

For yderligere at validere sammenhængen mellem Hsp-27 protein og miR-145-ekspression i CRC vi analyserede deres udtryk profil i primære humane vævsprøver (herunder 41 CRC med LNM, 43 CRC uden LNM, 47 tilstødende ikke-tumorvæv) ved hjælp af western blotting eller QRT-PCR hhv. Blandt 131 humane vævsprøver de, ekspressionen af ​​Hsp-27 var signifikant opreguleret i CRC med lymfeknudemetastaser sammenlignet med uden lymfeknudemetastaser. Denne tendens er i overensstemmelse med MIR-145 ekspressionsprofil. Der var en stærk, positiv korrelation (Spearman) mellem Hsp-27 protein og miR-145-ekspression (

r

= 0,402;

P

0,0001). (Fig.4B, Fig S2 og S3 i File S1). Disse resultater indikerede, at MIR-145 er involveret, i det mindste delvist, i opregulering af Hsp-27-proteinekspression.

6. Forøgelse af Hsp-27 stabilitet ved MIR-145 i CRC-celler

Der var ingen påviselig ændring af Hsp-27 transkriptionel niveau efter MIR-145 opregulering (data ikke vist). Kun protein, men ikke mRNA af Hsp-27 blev moduleret af miR-145, hvilket tyder på denne forordning er post- transkriptionelle. For yderligere at undersøge protein opregulering af Hsp-27 påvirket af MIR-145, vi har registreret, om MIR-145 forbedret stabiliteten af ​​Hsp-27-protein. HCT-8-MIR-145-celler og HCT-8-NC-celler blev behandlet med enten proteinsynteseinhibitoren, cycloheximid (CHX) eller proteasominhibitor, MG-132, hhv. Som illustreret i Fig.4C og 4D, den forøgede ekspressionen af ​​Hsp-27 i miR-145 overudtrykte celler blev afskaffet, når de inkuberes med MG132. En sådan fænomen blev ikke fundet, når de inkuberes med CHX. Disse resultater viste, at miR-145 ikke kunne påvirke proteinsyntesen af ​​Hsp-27, men kunne reducere antallet af Hsp-27 nedbrydning, som forbedret dets stabilitet.

7. Nedregulering af Hsp-27 svækket den onkogene effekt af miR-145

For at kontrollere, om opregulering af Hsp-27 bidrager til miR-145-induceret motilitet i CRC-celle, en række analyser var udført

in vitro

. Hsp-27 siRNA eller kontrol siRNA blev oprindeligt transficeret i HCT-8-MIR-145-celler. Reduktionen af ​​proteinekspression af Hsp-27 bekræftedes via Western blotting (fig. 5A). Cellemigration blev derefter observeret ved anvendelse af sårheling assay (fig. 5B). Disse resultater viste, at mobiliteten for HCT-8-MIR-145-celler transficeret med hsp-27 siRNA var bemærkelsesværdigt langsommere end den for celler transficeret med kontrol siRNA. Et lignende resultat blev også opnået i en celle invasion assay. Transwell-Matrigel penetration assay blev udført med HCT-8-MIR-145-celler transficeret med hsp-27 siRNA eller kontrol siRNA. I sammenligning med kontrollen, vælte af Hsp-27 inhiberede invasion evne HCT-8-MIR-145-celler (fig. 5C). De andre tre forskellige siRNA oligoer af Hsp-27 var i stand til at rekapitulere lignende fænotyper (fig. S4 i File S1). Disse resultater manifesteret, at Hsp-27 var en vigtig nedstrøms mediator under prometastasis relateret til miR-145.

(A) HCT-8-mir-145 (mir-145) eller HCT-8-NC (NC ) -celler blev transficeret med Hsp-27 siRNA (mir-145 + si-HSP27) eller en negativ kontrol siRNA (mir-145 + mock). Ekspressionen af ​​Hsp-27-protein blev påvist ved western blot-assay. (B) sårheling assay til at evaluere effekten af ​​Hsp-27 siRNA i HCT-8-MIR-145-celler. (C) Knockdown af Hsp-27 af siRNA i HCT-8-MIR-145-celler signifikant inhiberet celleinvasion. Billederne var repræsentanter for mindst tre uafhængige forsøg. Gennemsnitligt antal invasion celleantal pr felt fra mindst tre uafhængige forsøg ± SD er vist ved søjle- figur. **

P

. 0,01

Diskussion

Metastase er nøglen kendetegnende for malignance. Selvom der er mange rapporter om ekspression af miR-145 i kræft, rapporten af ​​funktionen af ​​miR-145 i metastaser udviklingen af ​​CRC er sjældent få. I aktuelle undersøgelse, undersøgte vi ekspressionen af ​​MIR-145 i den primære cancervæv af CRC patienter med eller uden lymfeknudemetastaser. MIR-145 blev identificeret til at blive underexpressed i CRC prøver med eller uden lymfeknude metastaser sammenlignet med tilstødende normale væv henholdsvis, hvilket stemmer overens med tidligere rapporter af andre [14] – [16]. Imidlertid ekspressionen af ​​MIR-145 viste en dramatisk opregulering i CRC med lymfeknudemetastaser, der var ude af vores forventning. Fordi vores viden, ekspressionen tendens tumorassocierede gener normalt bevæge sig mod én retning langs udviklingen af ​​tumoren. For at bekræfte resultatet af vores indledende bemærkning, blev den præcise udtryk for miR-145 i den primære CRC væv af 103 patienter med lymfeknude metastaser og 99 patienter uden lymfeknude metastaser bestemmes ved hjælp af QRT-PCR. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer og normaliseret mod en endogen kontrol U6. Strenge kalibreringsstandarder og stor mængde tumorprøver anvendt i denne undersøgelse sikrede troværdigheden af ​​vores resultater. Vi fandt ingen signifikant forskel i sammenligning af MIR-145 ekspressionsniveau i tilstødende normale væv mellem CRC med eller uden lymfeknudemetastaser. Imidlertid blev en klar sammenhæng mellem miR-145 udtryk og lymfe metastaser observeret. I disse CRC patientprøver, miR-145 viste signifikant højere ekspression i kræft med lymfeknude metastaser end dem uden lymfeknude metastaser, hvilket yderligere bekræftet vores vifte resultat. Som vi analyserede data fra flere andre miRNA, vi også observeret lignende ekspressionsprofil af nedgang, restaurering, men ikke yderligere nedregulering, sammen med udviklingen af ​​CRC (upublicerede data). Disse observationer af andre CRC relaterede miRNA bekræftet rigtigheden af ​​vores resultater, som antydede, at en miRNA måske vise forskellige udtryk profil i forskellige stadier af kræft. Udover fase forskel, ekspressionen af ​​MIR-145 synes at være afhængig af typen af ​​væv. F.eks Sachdeva et al fandt, at nedregulering af MIR-145 var mere fremtrædende i CRC end i brystcancer [17]. Alle disse observationer, at nogle miRNA kan multitasking ved at interagere med forskellige målgrupper gener i forskellige celler og væv [18].

For at undersøge forholdet mellem opregulering af miR-145 med metastaser af kolorektal cancer, mIR-145 gain-of-funktion blev udført i humane CRC-celler under anvendelse af lentivirus system. Vores resultater viste, at opregulering af miR-145 kunne fremme CRC migration og invasion

in vitro

in vivo,

mens blev observeret nogen virkning på cellevækst. Disse data var uforenelig med nogle andre rapporter, som viste anti-onkogen rolle miR-145 i metastaser. Men data fra disse observationer var enten fra andre end kolon [17] væv, [19] – [20]. Arndt et al rapporterede en onkogen rolle miR-145 i CRC, hvilket er i god overensstemmelse med vores resultater [21]. Disse opdagelser yderligere bekræftet, at funktionen af ​​miR-145 i forbindelse med udvikling af kræft er vævstype specifik.

Denne undersøgelse giver det første bevis på, at miR-145 fungerer primært som en prometastatic miRNA i avanceret CRC. Det er generelt, at enkelte specifikke miRNA kan regulere flere målgener, hvilket tyder på, at enkelt miRNA kunne udføre en række funktioner ved at målrette forskellige gener i forskellige cellulære sammenhænge [22]. På det tidlige stadium af CRC, er MIR-145 nedreguleret, hvilket indikerer sit mål relateret til celleproliferation. På det fremskredent stadium, kan høj ekspression af miR-145 forbindelsen til mål mod metastaser. MIR-17-5p, en godt undersøgt miRNA, kunne målrette pro- og anti-proliferative gener og fungere som både et onkogen og et tumor suppressor i forskellige cancere [13], [23] – [24]. MIR-143, en anden cancer associeret miRNA, dens udtryk er altid i overensstemmelse med miR-145 (vi ikke eksamen sin co-ekspression med miR-145 i vores undersøgelse) viste multifunktion i kræft metastaser [25]. Tilsammen disse resultater understøtter den hypotese, at MIR-145 kan spille en kompleks funktion i udviklingen af ​​CRC.

For at afsløre eventuelle effektor-gener, der deltager i denne funktion, identificerede vi cellulære proteiner, som var direkte eller indirekte reguleret af miR-145 ved hjælp iTRAQ mærkning og 2DLC-ESI-MS /MS. Vores analyser viser, at Hsp-27 var opreguleret i miR-145 overudtrykt CRC celler. Varmechokprotein 27 (Hsp-27), et vigtigt medlem af den lille Hsp familien, udtrykkes ubikvitært i forskellige celletyper og er involveret i cellulære responser til forskellige belastninger såsom varmechok, hypertonisk stress, oxidativt stress [26] – [27]. Høje niveauer af Hsp-27 har vist sig at være forbundet med metastase af flere tumortyper herunder CRC, prostatacancer, gastrisk cancer, hepatocellulært cancer, hoved- og hals pladecellekræft [28] – [30]. Især er det blevet bevist, at forøget ekspressionsniveau af Hsp-27 i CRC var relateret til lymfeknudemetastase [31] – [32]. Vores resultater viste, at der var en stærk, positiv sammenhæng mellem Hsp-27-protein og MIR-145-ekspression i primære humane vævsprøver, som viste, at MIR-145 var involveret, i det mindste delvist, i opregulering af Hsp-27-proteinekspression .

Knockdown af Hsp-27 genekspression ved siRNA viste sig at vende mIR-145-medieret induktion af CRC cellemigrering i vores undersøgelse. Rolle MIR-145 i opretholdelsen af ​​høje Hsp-27 var ikke gennem direkte gen-targeting men stabilisering af Hsp-27. Selv rolle og kliniske resultat af Hsp-27 i primære tumorer er blevet godt undersøgt og dokumenteret [33], dens funktion i metastase invasion er stadig uklart. Yderligere undersøgelser for at identificere den mekanisme af Hsp-27 involveret i CRC metastaser vil yderligere berige vores forståelse på opregulering af miR-145 i CRC.

Sammenfattende den aktuelle undersøgelse viste, at opregulering af miR -145 bidrog til lymfeknudemetastaser af CRC. Mekanismen for dette bidrag i forbindelse med stabiliseringen af ​​Hsp-27, et protein, der spiller en vigtig rolle i fremme af metastase. Fremtidige retning for evaluering af miR-145 bør fokusere på mekanismen undersøgelse, som kunne føre til dens anvendelse i metastaser diagnosticering og behandling af CRC.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

De vævsprøver analyseret i denne undersøgelse blev indhentet fra 202 patienter (117 mænd og 85 kvinder), der gennemgår kirurgisk resektion for CRC på Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. Prøverne blev anvendt med de skriftlige informerede samtykke fra patienterne og med godkendelse af det kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Hospital. Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi eller strålebehandling inden kirurgisk resektion. Hele prøver afspejler den naturlige fordeling af klinisk-patologiske karakteristika CRC patienter. Operativt fjernede prøver blev histologisk undersøgt af hematoxylin og eosin-farvning. Primære tumorvæv og tilsvarende hosliggende ikke-tumorvæv blev indsamlet umiddelbart efter kirurgisk fjernelse og lynfrosset i flydende nitrogen til videre anvendelse. Vi delte denne patient kohorte i to grupper. Dem med bekræftet LNM blev betegnet som lymfeknude positive (LNP) gruppe og dem uden påviselig LNM blev kaldt lymfeknude negative (LNN) gruppe. Alle sager blev gennemgået og bekræftet af to erfarne patologer. De kliniske karakteristika for disse prøver er vist i tabel 1.

Cell kultur

Den humane CRC cellelinje HCT-8 blev købt fra Institut for Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences ‘cellekultur center (Beijing, Kina). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco, CA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C og suppleret med 5% CO

2 i et fugtigt kammer.

microarray analyse

Otte primære kolorektale cancer væv afledt af fase II-III kolorektal cancer patienter med (n = 4) eller uden (n = 4) lymfeknudemetastase blev opsamlet og ekspressionen profiler af miRNA blev bestemt under anvendelse Agilent miRNA microarray. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra tumorprøver under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion Inc., TX, USA). Kvaliteten og mængden af ​​RNA-prøver blev vurderet af en 2100 Bioanalyzer hjælp af RNA 6000 Pico LabChip kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Den microarray indeholder prober til 851 menneskelige miRNA fra Sanger database v.12.0. De microarray eksperimenter blev udført ved ShanghaiBio Corporation hjælp Agilent miRNA mærkningsreagens og hybridisering Kits, Agilent human miRNA array (V2) og Agilent microarray scanner. Alle originale microarray data er deponeret i NCBI GEO-databasen [GSE48074].

RNA ekstraktion og real-time kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion

miRNA blev oprenset fra dyrkede celler eller væv ved hjælp af Qiagen miRNeasy Mini Kit. Revers-transkriptionsreaktioner blev udført ved anvendelse MiScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Tyskland.). MiScript SYBR Green PCR Kit i kombination med miRNA-specifikke primere (mir-29b-1 * Kat MS00009289, mir-95 kat.nr. MS00010906, mir-100 kat.nr. MS00003388, mir-125b Kat MS00006629, mir-152 kat.nr. MS00003591, mir-376c kat MS00004046, mir-199B kat MS00003731, mir-145 kat.nr. MS00003528, mir-99a kat MS00003374, mir-1274a Kat MS00014420, mir-99b kat.nr. MS00032165, Qiagen, Tyskland.) blev anvendt til at detektere modne miRNA på LightCycler 480 (Roche, Basel, Schweiz). Den relative ekspression af miRNA forhold til U6 (kat. Nr. MS00033740, Qiagen, Tyskland.) Blev beregnet ved anvendelse af -ΔCt metode. Alle QRT-PCR-reaktioner blev udført tre gange.

Generering af lentivirus at opnå forstærkning af MIR-145 funktion

Lentiviral pGCsil-GFP-vektoren blev anvendt til at bære human pre-MIR-145 (MIR -145) eller ikke-funktionel kontrol (NC). Lentivirale vektor konstruktion og produktion af høj titer lentiviral partikler blev foretaget af Genechem biologi selskab. De dannede lentivira blev anvendt til at inficere HCT-8 i 24-48 timer ved 1-5 MOI, og ekspressionsniveauerne af MIR-145 blev bestemt ved QRT-PCR-assays. Inficerede populationer udviser mellem 70-90% grønne fluorescerende celler blev anvendt til senere forsøg.

Proliferationsassay

Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% føtalt serum. 1 × 10

3-celler blev podet i fladbundede 96 brønds plader og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO2. Cellernes levedygtighed blev målt ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) ved day1, Day3 og day5. For cellecyklusanalyse blev cellerne vasket og fikseret med iskold 75% (v /v) ethanol ved -20 ° C i 2 timer, derefter farvet med PI i en koncentration på 50 ug /ml i nærvær af RNase A ( 100 ug /ml). DNA-indhold blev analyseret ved flowcytometri analyse (Beckman Coulter, USA)

cellemigration /invasion assays

Cell motilitet og invasionsevne blev bestemt ved en 24 brønd transwell plade (8 uM porestørrelse.; Costar), som beskrevet tidligere.

10 Kort beskrevet for Transwell migration assays, 1 x 10

4-celler blev anbragt på den øverste kammer foret med noncoated membran. For invasion analyser, 3 × 10

4 celler blev placeret på den øverste kammer i hver indsats belagt med 200 mg /ml Matrigel (BD Biosciences, CA, USA).

In vivo

metastase assays

i

in vivo

metastase assays, 5 × 10

4 HCT-8-mIR-145 celler eller HCT-8-NC-celler blev injiceret i leveren af nøgne mus efterfulgt af kirurgisk sutur (tre i hver gruppe, female nu /nu). Efter 2 uger blev musene aflivet, deres lever blev dissekeret, og de mesenteriske lymfeknude metastaser blev talt. De nøgne mus blev købt fra Vital River (Beijing, Kina) og opvokset i en SPF (SPF) dyr laboratorium. Alle forsøg med dyr blev godkendt af kinesiske Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College Komité og udført i overensstemmelse med de lovmæssige krav.

iTRAQ mærkning og LC-ESI-MS /MS-analyse