PLoS ONE: Nye tilgange af PARP-1 hæmmere i Human Lung Cancer Cells og Kræft Stem-lignende celler ved udvalgte Anthraquinon-Afledte små molekyler

Abstrakt

Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) og telomerase, samt DNA skade responset veje er mål for udvikling anticancer narkotika, og specifikke inhibitorer er i øjeblikket under klinisk undersøgelse. Formålet med dette arbejde er at vurdere anticancer aktiviteter af anthraquinon-afledte tricykliske og tetracykliske små molekyler og deres struktur og aktivitet med PARP-1 hæmning i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og NSCLC-overekspression Oct4 og Nanog klon, som viser høj ekspression af PARP-1 og mere modstand til anticancerlægemiddel. Vi anvendte vores bibliotek udvalgte forbindelser til NCI 60 humane cancer cellelinjer (NCI-60) for at generere systematiske profilering data. Baseret på vores analyse, er det en hypotese, at disse stoffer kan være direkte og indirekte, målrette komponenter til at fremkalde mitokondriel permeabilitet overgang og frigivelsen af ​​pro-apoptotiske faktorer som potentielle anti-NSCLC eller PARP inhibitor kandidater. Alt i alt viste den mest aktive NSC747854 sin cytotoksicitet og dosisafhængig PARP inhiberende måde, hvorfor det fremstår som en lovende struktur for anticancerterapi med nogen væsentlig negativ indflydelse på normale celler. Vores undersøgelser nuværende beviser, at der skal tages hensyn til telomer vedligeholdelse i bestræbelserne ikke blot at overvinde resistens, men også for at optimere brugen af ​​telomer-baserede lægemidler. Disse resultater vil være af stor værdi at lette struktur-baseret design af selektive PARP-inhibitorer i almindelighed og telomerase-inhibitorer, i særdeleshed. Sammen data præsenteret her udvide vores indsigt i de PARP-inhibitorer og støtte ressourcekrævende bly optimering af strukturelt beslægtede små molekyler til human cancer terapi

Henvisning:. Lee YR, Yu DS, Liang YC, Huang KF Chou SJ, Chen TC et al. (2013) Nye tilgange af PARP-1 hæmmere i Human Lung Cancer Cells and Cancer Stem-lignende celler ved udvalgte Anthraquinon-Afledt små molekyler. PLoS ONE 8 (2): e56284. doi: 10,1371 /journal.pone.0056284

Redaktør: Ferenc Gallyas, University of Pecs Medical School, Ungarn

Modtaget: 18 juni 2012; Accepteret: 12 januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende undersøgelsen blev støttet af National Science Rådet Grants NSC99-2113-M-016 til 001, NSC100-2113-M-016 til 001 og NSC 97-3111-B-075-001-MY3 hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræfttilfælde generelt kategoriseres som småcellet lungecarcinomer (SCLC) og ikke-småcellede lungecarcinomer (NSCLC), som er yderligere underklassificeres som adenocarcinom (AC), pladecellecarcinom (SCC), og storcellet carcinom (LCC) [1], [2]. Kræft stamceller er små reservoirer af selvbærende celler med den eksklusive evne til selv-fornyelse og tumor vedligeholdelse [3]. Selvom nye kemoterapeutiske stoffer og strålebehandling har forbedret patienternes overlevelse og livskvalitet, den langsigtede overlevelse af patienter med lunge AC fortsat utilfredsstillende. Kemoterapi i det sidste årti har primært været brugt til palliation snarere end reduktion i dødeligheden; Der er stadig et presserende behov for yderligere søge de hidtil ukendte små molekyler for nye kemoterapeutiske stoffer.

PARP, som spiller en rolle i reparation af enkeltstrenget DNA (ssDNA) pauser, har en række forskellige biokemiske aktiviteter der har været et attraktivt mål for design af anticancermidler [4] – [6]. Gennem det seneste årti, har mange små molekyler med hæmning af PARP familie blevet syntetiseret og nogle af dem bliver i øjeblikket testet i kliniske forsøg som kræftbehandling [7] – [9]. Selv om de er blevet undersøgt for deres anvendelighed i DNA beskadigelse påvisning og reparation, hvilket omfang PARP kontrol anden specifik udviklingsmæssig proces er ikke klart. Udviklingen af ​​specifikke, potente, effektive og sikre PARP-inhibitorer er blevet et område af aktiv forskning og meget nylige offentliggørelse i PARP feltet. Af denne grund, inhibering PARP-aktivitet, især PARP-1, med små molekyler reducerer reparation af ssDNA pauser, og vil sandsynligvis være nyttige til behandling af cancere, stress, inflammatoriske responser og hjertekarsygdomme [7], [8]. Kliniske forsøg, som nu er i gang, er at undersøge sikkerhed og effekt af PARP-1-inhibitorer som anti-kræft, herunder bryst-, livmoderen, og ovariecancer [9]. Endvidere kan funktionerne af PARP i DNA-skade responser og beskyttelse af telomerer overlappe telomerase [10]. En tidligere rapport foreslået, at telomerase og PARP spille en rolle i kromosom ustabilitet og DNA-skader [11]. I mange tilfælde kan effektiviteten af ​​inhibitorerne skyldes det syntetiske letalitet mellem PARP-inhibering og en genetisk læsion i tumorcellerne [12] – [14].

3-aminobenzamid (3-AB) er en første generation PARP-1-inhibitor [15], [16], men det mangler den fornødne selektivitet og styrke for at være anvendelige i klinikker eller som et forskningsværktøj [9], [17]. Endvidere nikotinamid, jo mindre spaltningsproduktet af NAD

+ udøver også inhiberende virkning på PARP-1 [18]. Veliparib (ABT-888) er også en hidtil ukendt og potentielt anticancerlægemiddel virker som et PARP-1-inhibitor [19]. Olaparib (AZD2281) har vist lovende klinisk effekt i ikke-randomiseret fase II forsøg i patienter med kræft i æggestokkene med BRCA1 eller BRCA2-mangel [20]. Iniparib (BSI-201) er kendt for sin enkle struktur, men det dræber normale og neoplastiske celler ved høje koncentrationer, og bør ikke betragtes som PARP-inhibitor [21]. Andre lægemidler såsom INO-1001, CEP-8933 /CEP-9722 og phenanthren-relaterede derivater PJ-34 er også blevet evalueret i kliniske forsøg hidtil [22]. PJ-34 var også den mest potente forbindelse i dette område [23]. Vi leverer PARP-1 aktiviteter af nogle udvalgte forbindelser, samt en grundig undersøgelse af vores papirer offentliggjort eller ikke-offentliggjorte i de sidste par år, der har leveret ny indsigt i hæmning af PARP-1 i kernen (figur 1) [ ,,,0],24] – [33].

Toward støtte ovennævnte hypotese, har undersøgelser vist, at p53-deficiente brystcancerceller behandlet med en PARP-1-inhibitor taber resistens over for doxorubicin, et klinisk aktiv antitumor antracyklinantibiotikum der fremmer apoptose [34]. Endvidere undersøgelsen viser, at phenanthrener-relaterede PARP-1-inhibitorer har potente cytobeskyttende virkninger

in vitro

in vivo

[35] .En anden undersøgelse viste, at cisplatin-koncentration kan reduceres efter at være blevet fulgt ved behandling med PARP-1-inhibitor, PJ-34, for at opnå den samme cytotoksiske virkning [36]. Som omtalt i artiklen, rettet mod bunden excision reparation vej med potente PARP-1 hæmmere viser sig at være frugtbar vej til udviklingslandene nye stoffer, der kan have aktivitet, ikke kun som kemo- eller radio-forstærkende midler, men også som en aktiv agent i DNA-reparation af mangelfulde nedarvede kræft [37]. I denne undersøgelse fremhæver vi spirende information om inhibering af PARP-1 i anthraquinon-afledte derivater resultater, dens samspil med antitumoraktivitet over i den fulde panel af humane tumorcellelinier og inhiberingen af ​​disse derivater ved PARP-1. Disse og andre relaterede kliniske fund har flyttet PARP-1 fra interessante emner af molekylære analyser til forkant som kliniske mål for kræftbehandling. I vores tilgang til denne forskning, undersøgte vi nyopdagede PARP-inhibitorer, de passende modificerede anthraquinon-afledte små molekyler, for at bestemme deres virkninger på cellelevedygtighed, western blot analyse, kræftceller og deres PARP-1 hæmning.

Resultater og diskussion

Antiproliferativ evaluering af de udvalgte små molekyler

En tidligere rapport foreslået, at rhein kunne inducere apoptose i humane promyelocytleukæmi celler (HL-60), kendetegnet ved caspase aktivering, PARP spaltning, og DNA-fragmentering [38]. Da vi kommer til at forstå sammenhængen mellem den epigenetiske status telomerer, vil PARP og små-molekyler åbne nye veje for vores forståelse af ny udvikling lægemidler til kræftbehandling. Forståelse af virkningsmekanismen af ​​anthraquinon-baserede anticancer narkotika er steget i de seneste år, men er stadig ufuldstændig. I de senere år har vi også udnyttes en række familier i telomer målrettet af anthraquinon-baserede farmakofor at generere strukturel nyhed og mangfoldighed for deres biologisk relevante studier. Det blev vist, at de plane anthraquinoner binde på enden af ​​G-quadruplex struktur ved π-Tr stabling interaktioner med guaninrester [39] – [43]. Det blev også vist, at amido-anthraquinoner repræsenterer en af ​​de bedste små molekyler til at modulere DNA rækkehuse og quadruplexes selektivitet [44], [45].

syv anthraquinon-afledte små molekyler (NSC746364, NSC746365, NSC746366, NSC747515, NSC747854, NSC749235, og NSC749232) (figur 2) evalueres heri, blev valgt, fordi de udviste signifikant cytotoksicitet, der fremkalder aktivitet over hele NCI 60 panel af humane tumorcellelinjer afledt af ni cancer celletyper: NSCLC, coloncancer, brystcancer cancer, ovariecancer, leukæmi, nyrecancer, melanom, prostatacancer, og CNS cancer. Der er yderligere bevis på, at disse dosisafhængige hæmmede proliferationer i alle 60 cancer cellelinjer, cytotoksicitet, og PARP-1 blev afledt fra forsøg, der er vist i denne undersøgelse. Desuden blev alle disse syv forbindelser udvalgt til yderligere evaluering på fem dosisniveau screening. I denne undersøgelse de alle viser god aktivitet med GI

50, TGI og LC henholdsvis

50 i NSCLC cellelinjer. Baseret på deres NCI analyse, antages det, at disse lægemidler kan have potentiale til at blive anticancerlægemidler kandidater. Til den ende, valgte vi NSCLC som vores primære fokus. Selv NSC747854 er mere følsom over for bryst-, nyre-, og ovariecancere af NCI 60 cell line skærmen (figur 3). Ved at udnytte de seneste strukturelle indsigt i NSCLC cellelinier fra NCI Drug Screen Program, vi analyserede GI

50, TGI, og LC

50, samt PARP hæmmende aktivitet og IC

50 i lungekræft celle-overudtrykker Oct4, Nanog klon (A3), lungecancer-cellelinie (A549) og normal fibroblast cellelinje (HEL299) hhv. Vores tidligere resultat antydede, at A549-overekspression Oct4 og Nanog klon er mere modstandsdygtige over for anticancerlægemidlet, Cisplatin, sammenlignet med A549 parentale celle [46].

a) En struktur af NSC747854. b) Antitumoraktivitet af NSC747854 i NCI-60 cancer cellelinjer, som blev indgivet til NCI Developmental Therapeutics Program (National Institutes of Health) for at afprøve dens virkning på et panel af 60 cancer cellelinjer afledt af forskellige væv og organer. GI

50 ved logaritmisk skala blev beregnet og er vist i søjlediagrammet. Den midterste linje repræsenterer medianen 50% vækst hæmmende koncentration for NSC747854 (

dvs

6,92 uM).

Undersøgelsen omfattede fremskridt i vores grupper og forudsat diskussioner på nogle udvalgte anthraquinone- afledte små molekyler, der under forskellige overskrifter dækker struktur og aktivitet (SAR), biologiske aktiviteter og information vedrørende biokemiske veje. Men når de spændende profiler af tumorcellevækst hæmning, cytotoksicitet, telomeraseaktivitet inhibitorisk aktivitet og PARP inhiberende aktivitet blev indledningsvis afdækket, blev det konstateret, at et molekylært mål skal ryddes: Disse små molekyler-designet telomer-rettet inhibitorer inddrev antitumoraktivitet og PARP hæmning via ukendte virkningsmekanismer. I denne undersøgelse beskriver vi de tværfaglige beviser, tilgange og eksperimenter gennemføres for at belyse SAR i PARP hæmmende aktivitet af flere anthraquinon-afledte forbindelser som potentielle antitumor mål. Den molekylære tilgang, bevis for antitumoraktivitet og telomeraseaktivitet er også blevet opnået og diskuteret. Som opsummeret i tabel 1, blev syv syntetiske små molekyler undersøgt for antiproliferativ aktivitet mod humane NSCLC cellelinier i NCI Drug Screen Program. Et fælles strukturelle kendetegn ved PARP-1-inhibitorer er tilstedeværelsen af ​​en carboxamid bundet til en poly-cyklisk skelet. Oxygenatomet fra carbonylgruppen kan fungerer som en hydrogenbindingsacceptor, og den hydrogenatom fra amidgruppen fungerer som en hydrogenbindingsdonor i hydrogenbinding interaktion med PARP-1 [45]. Det er for nylig blevet rapporteret, at en nyligt majs-formet hydrofobe underordnet websted fremgår det aktive sted på PARP-1, når PARP-1-kompleks kombineres med PARP-1-inhibitorer [47]. De fleste af de udvalgte testforbindelser blev tilsat til NSCLC linjer; måske de var på mikro-molære niveau. Alle syv udvalgte forbindelser næsten udstillet bemærkelsesværdige antiproliferative virkninger på A549 celler, med GI

50 værdier i det lave område (tabel 2). I forbindelse med undersøgelserne, planlagde vi at bruge disse syv forbindelser til yderligere at undersøge en

in vitro

PARP-1 inhiberingsassay. Forståelse af celledød veje for selektiv aflivning af kemo-resistente NSCLC tumorer ville føre til mere effektive strategier. Hidtil har ingen kemoterapeutiske midler blevet udviklet, som udnytter PARP-1 hyper-aktivering for NSCLC terapi. Det er derfor blevet foreslået, at inhibering af PARP-1 kan øge effektiviteten af ​​DNA-skadelige anticancerterapi. Som nævnt i disse følgesvend små molekyler, NSC747854 er kemisk nye og biologisk enestående i sin virkningsmekanisme og

in vitro

mønster af aktivitet. I denne forskning, præsenterer vi beviser for, at NSC747854 besidder en række farmakologisk ønskværdige egenskaber, som det har en multi-log forskellen mønster af aktivitet og unikke virkningsmekanismer i NCI 60 celle skærm linjer (figur 3).

In vitro cytotoksicitet evaluering

for yderligere og detaljeret evaluering af disse syv forbindelser, bruger vi MTT assay på A549 celler til at sammenligne disse forbindelser til 3-AB og PJ-34, som dataene er vist i figur 4. IC

50 af fire forbindelser (NSC746364, NSC746365, NSC746366 og NSC749232) var mellem 1 og 10 uM i A549 celler. Interessant cytotoksicitet syv forbindelser til A3-cellelinien var bedre end det var til A549-cellelinien. Generelt begge af de to lægemidler, 3-AB og PJ-34, viser dårligere cytotoksicitet end de udvalgte forbindelser (tabel 3). Sammenlignet med A549-cellelinien, vi fandt ud af, at mængderne af PARP-1-ekspression markant blev forhøjet i A3-cellelinien i figur 6A. Tog således vi A3-cellelinje til at være vores cellelinje-baserede drug screening platform. Resultaterne indikerede, at A3 celler til seks forbindelser (undtagen NSC746364) var mere følsomme end A549-celler. Dette interessante fænomen optrådte også i PARP-1-inhibitorer (3-AB og PJ-34) (tabel 3). Base på en række tilfælde af denne form for forskning, vi håbede, at udviklingen af ​​nye lægemidler ikke blot lover at levere god cytotoksicitet, men også lover at resultere i nogen væsentlig indflydelse på normale celler. Derfor brugte vi HEL299 celler som vores normale cellelinjer; vi behandlet denne normale cellelinie med syv forbindelser og to PARP-1-inhibitorer for at teste cytotoksiciteten af ​​disse udvalgte forbindelser og to PARP-1-inhibitorer upon normale celler. IC

50 data for MTT-assays af disse forbindelser er vist i figur 5. De cytotoksiske virkninger af syv forbindelser var lidt bedre i okt-4- og Nanog-overudtrykt A549 klon (A3) og cancerceller end i normale celler. Vores tidligere undersøgelse havde etableret Oct-4 og Nanog-overudtrykt A549-klon (klon # 3; A3), og dette A3 adenocarcinomal cellelinie præsenterede egenskaber cancer stamceller-lignende celler og epitelial-mesenkymale transdifferentiering samt metastatisk evne [46 ], [48]. Resultaterne af western blot viste, at denne A3 cellelinje blev højt udtrykt PARP-1, men ikke i parentale A549 og HEL299 celler (fig. 6B). Vigtigere, endvidere A3-A549-cellelinje endogent præsenterer de høje ekspressionsniveauer af CD133 (kræft stamcellemarkør) og ABCB1 samt ABCG5 (lægemiddelresistente gener), sammenlignet med parentale A549-celler [46], [48]. I denne undersøgelse af resultaterne af western blot viste, at denne A3 cellelinje blev højt udtrykt PARP-1, men ikke i parentale A549 og HEL299 celler (figur 6). I figur 6C, viste data, at A3 klon væsentligt kan danne det tumor-sfærer i serumfrit medium med bFGF og EGF (10 ng /ml). Desuden kan resultaterne af kugle-dannelse og celleviabilitetstest demonstrerede, at forbindelserne ifølge NSC747854, NSC749232, og NSC749235 i behandlet A3 klon effektivt kan blokere kuglen dannelse og inhiberer cellevækst in vitro (figur 6D og 6E). Især ved anvendelse af kvantitativ RT-PCR, demonstrerede vi, at forbindelserne ifølge NSC747854, NSC749232, og NSC749235 kan inhibere ekspressionsniveauerne af PARP-1 i behandlede A3 celler (figur 6F). Efter A3, A549 og HEL299 celler blev behandlet med forbindelser, sammenlignede vi overlevelsesraten henholdsvis mellem A549-cellelinien og HEL299 cellelinje ved anvendelse af en uparret to-halet t-test, som NSC749232 havde en signifikant forskel. Sammenlignet med A3 cellelinje, NSC747854, NSC749232 og NSC749235 havde en markant anderledes overlevelsesrate til HEL299 cellelinje. Mærkbart, vil 3-AB og PJ-34 også være relativt skadeligt for normal fibroblast cellelinje (HEL299) i denne undersøgelse. Resultaterne betyder, at NSC747854 ikke påvirker vækst og generel transkription af normale celler. Derudover NSC747854 og andre udvalgte anthraquinon-afledte små molekyler er generelt mere potente end 3-AB og PJ-34. Det blev først rapporteret, at anthraquinon-analoger er potente humane PARP-inhibitorer. Sammen data præsenteret her udvide vores indsigt i de PARP-inhibitorer og støtte ressourcekrævende bly optimering af strukturelt beslægtede små molekyler til human cancer terapi. IC

50 data for MTT-assays af disse forbindelser er vist i figur 5.

Cell levedygtighed værdier udtrykkes i forhold til de brønde, hvor forskellige forbindelser ikke blev tilsat (100% bekæmpelse værdi). Hvert punkt repræsenterer en middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Værdier repræsenterer et gennemsnit af mindst tre uafhængige forsøg.

a) I forhold til den ekspression af et husholdning protein β-tubulin, blev omfanget af PARP-1 i A3-celler vurderet til at være mere end i A549 og HEL299 celler. b) Morfologien af ​​A3-celler dyrket på 10% serum-indeholdte medium. c) Under serumfrit med bFGF og EGF (10 ng /ml) kultur, blev tumoren sfære formation (pile) af A3-celler observeret (bar = 60 um). Forbindelserne med NSC747854, NSC749232, og NSC749235 faldt d) cellelevedygtigheden, e) blokerer sfære dannelse, og f) inhiberer mRNA ekspressionsniveauer af Parp1 i behandlede A3 celler. Hvert punkt repræsenterer en middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Også den nuværende arbejde viser, at IC

50 af disse udvalgte syv forbindelser mod to cancerceller var mindre end den for PARP-1-inhibitor. De fleste af disse udvalgte forbindelser var blottet for enhver toksicitet over for normale fibroblaster. For at belyse SAR og

in vitro

anticancer aktivitet vi korreleret deres aktivitet profil (GI

50, TGI og LC

50) i screeningen, og også deres virkninger på celleproliferation, cytotoksicitet og PARP-1 hæmmende effekt.

PARP hæmmende vurdering af de udvalgte små molekyler

til dato har en række familier af forbindelser blevet udviklet og deres PARP aktivitet og cytotoksicitet er blevet grundigt undersøgt. Samlet set viser disse resultater antydede, at anti-cancer potentialer anthraquinon-afledte små molekyler mod cellebaseret er, i det mindste delvist, tilskrives dens anti-cancer effekter og PARP inhiberende aktivitet. De unikke molekylære karakterisering, cytotoksicitet og telomerase aktivitet profiler garanterer yderligere undersøgelser og indikere en potentiel ny anticancer mekanisme involveret. Små molekyler, der modulerer PARP-1 hæmmende vil sandsynligvis give ny indsigt i reguleringen af ​​denne nøgle udviklingsmæssige vej og i sidste ende give vores felt med potentielle nye farmakologiske midler, såsom anti-cancer medicin. Selvom mange forskningsprogrammer screene for hidtil ukendte små molekyler PARP-1-inhibitorer, har ingen passende kandidat endnu vist sig at have nok potente og specifikke inhibitorer. Som et resultat, fandt vi, at dosisafhængig potentiel PARP-1 hæmmer NSC747854 var den eneste forbindelse, som fulgte alle de ovennævnte kriterier.

Vi brugte histon-coatede 96-brønds plade behandlet med syv formodede PARP- 1-inhibitorer eller velkendte PARP-1-inhibitorer (3-AB), og derefter tilsættes PARP enzym til hver brønd. PARP-enzymet katalyserer NAD-afhængig tilsætning af poly (ADP-ribose) til histon og fortyndet Strp-HRP kunne binde til PARylation histon. TAC-Sapphire ™ gav blå under HRP eksistens. For systematisk at vurdere den potentielle anticancer-aktivitet blev forbindelserne testet for deres cytotoksicitet

in vitro

mod 60 human cancer linjer i skærmen anticancerlægemiddel NCI samt for dosis-respons kurver og telomeraseaktivitet. Cellevækst blev analyseret ved MTT-assayet, med forskelle mellem dosisresponskurver analyserede ikke-parametrisk. Telomeraseaktivitet blev detekteret ved en modificeret version af PCR-baseret assay og TRAP-assay [31]. NSC746364, NSC746365 og NSC746366 strukturelt 2,7- diamidoanthraquinone derivater; NSC747515, NSC747854 og NSC749235 er 1,2-heteroannelated anthraquinonderivater, NSC749232 er en asymmetrisk 1,2-diamidoanthraquinone derivat, sammenlignet med andre klinisk anvendte anticancerlægemidler og har udstillet et enestående cytotoksicitet ved PARP-1 high-udtrykte cellelinie, A3 . Da PARP er en vigtig del af kræft, er vi interesseret i at undersøge virkningerne af disse forbindelser på PARP aktivitet, så vi afslørede en potentiel PARP hæmmer gennem forskellige test tilgange. Som vist i figur 7, 3-AB, PARP inhiberende virkning opførte sig på en dosis-afhængig måde. PARP hæmmende effekter af syv forbindelser afslørede, at NSC746364, NSC746366 og NSC749232 hæmme funktion af PARP enzym stigning sammen med koncentrationen stigning på 0,1 og 1 pM. Imidlertid PARP inhiberende virkninger havde ingen forskel ved 1 og 10 uM. Som beskrevet ovenfor NSC746364, NSC746366 og NSC749232 viser dosisafhængighed kun ved lave koncentrationer. NSC746364 og NSC746366 viste en PARP inhiberende virkning på 56% og 47%, hhv. NSC747515 havde en lignende PARP hæmmende virkning på 0,1, 1 og 10 uM. NSC747854 havde dosis-afhængige PARP hæmmende manerer tre forskellige koncentrationer, og nået det maksimale hæmmende effekt på 86% ved 10 uM (tabel 4). Farmakodynamiske studier af PARP-1-inhibitor, såsom 3-AB, udviste dosisafhængig hæmning af PARP-aktivitet i perifere mononukleære blodceller. Til den ende, viste NSC747854 den maksimale inhiberende virkning i en dosisafhængig PARP inhiberende måde. Derfor kan NSC747854 være den mest potente PARP hæmmer kandidat, der fulgte alle de ovennævnte kriterier. I denne undersøgelse, vi fortsatte med at fokusere vores opmærksomhed på den rolle, NSC747854 og at forstå grundlaget for farmacophor selektivitet. Af særlig note er den væsentlige forskel med disse udvalgte forbindelser, sammenlignet med 3-AB og PJ-34. Interessant, de fleste af disse udvalgte forbindelser indeholder en unik amin med et til tre kulstof plads linker dele, som kan give et strukturelt grundlag for forskellene i styrken mellem disse og andre PARP-1 hæmmere. Fra en generel struktur-aktivitet synspunkt, tricykliske plane anthraquinon viste, at de strukturelle variationer kan medføre betydelige ændringer i specificitet og styrke med hensyn til anticancer aktivitet. En elektron-rige aromatisk ringsystem, herunder en carboxamidgruppe, skal have mindst et hydrogenatom på amidnitrogenet [47]. Den amidinium delen er kendt for at bidrage til at stabilisere DNA-genkendelse element gennem elektrostatiske og hydrogenbindende interaktioner [49]. Derfor er hydrogenbindinger ofte som genkendelseselementer på grund af deres retningsvirkning og også grundet bliver attraktive faktorer til den biologiske aktivitet (figur 1) [50]. Mange klasser af lægemidler har væsentlig krumning, høj DNA affinitet binding til minor-groove eller større groove, interferens med DNA-associerede enzymer (f.eks telomerase) og poly (ADP-ribose) polymerase, PARP. Bindingsaffiniteterne og særlige observerede tyder på, at indarbejdelsen af ​​en række forskellige dele vil føre til stoffer, der interagerer med PARP mål. Denne fremgangsmåde i høj grad udvider anvendeligheden af ​​substituenterne og relaterede farmakofor til opførelse af lægemidler i almindelighed. Derfor er det ønskeligt at udforme PARP-inhibitorer i overensstemmelse med forskellige anticancer parametre. Det blev først rapporteret, at anthraquinon analoger er potente menneskelige PARP-inhibitorer.

3-AB havde dosis-afhængige PARP hæmmende effekter, og den mest oplagte dosisafhængig PARP hæmmende virkning på de syv PARP inhibitor kandidater var NSC747854. Ved 0,1 og 1 uM, PARP hæmmende effekt af NSC746364, NSC746366 og NSC749232 steget sammen med koncentrationen steget, men på en og 10 uM, PARP hæmmende effekt havde ingen signifikant forskel.

Efter viser håbefulde resultater i flere prækliniske undersøgelser, to benzo [c] phenanthridin derivater: har dihydronitidine (DHN), nitidin (NTD) blevet vist selektiv cytotoksicitet [51], [52]. PJ-34, var den mest lovende molekyle og også effektivt forhindrede udviklingen af ​​MDA-231 og lungekræft celler H1299 uden at inducere påviselige toksiske virkninger i normale humane proliferative celler [23]. Vi kunne vide, at phenanthren-relaterede derivater spiller en vigtig rolle med hensyn til PARP-inhibitorer og vælg på humane cancerceller. Som konklusion, dataene i denne artikel indikerer, at forbindelserne udviser potent og differentieret

in vitro

aktivitet mod NSCLC celler og især PARP-1 høj udtrykte cancerceller sammenlignet med normale fibroblastceller i løbet af disse forsøg. På grundlag af disse farmakologisk ønskelige egenskaber og det brede spektrum

in vitro

indeks for aktivitet (GI

50, TGI, og LC

50) rapporterede, NSC747854 undergår i øjeblikket mere detaljeret prækliniske farmakologi og toksikologiske undersøgelser gennem vores laboratorium. Tilsammen viser disse undersøgelser, at anthraquinon-afledte små molekyler kan inducere farmakologiske og biokemiske træk ved PARP-1-inhibering. Vores data tydeligt udvider de biologiske dokumentation, der anvendes af de syv udvalgte forbindelser. Så vidt vi ved, har anthraquinoner aldrig blevet rapporteret at forårsage PARP-1 hæmning. I det hele taget støtte vores undersøgelser den konklusion, at de testede molekyler NSC747854 delte et fælles mål i telomerase og PARP der kan være en roman mindre giftigt modalitet af cancerbehandling. PARP-1-inhibitor brug i behandling af kræft er en højt profileret emne i dag. High-udtrykte PARP-1 er en import-resistent mekanisme. I vores undersøgelse fandt vi ud af, at der er en høj PARP-1-ekspression i A3-cellelinien, som også kan udnyttes til lægemiddelscreening af PARP-1-inhibitorer. Som en del af vores fortsatte søgen efter nye, potente og celle-gennemtrængelige hæmmere af dette enzym, blev yderligere anthraquinon-afledte analoger af NSC747854 også undersøgt. Foreløbige mekanistiske undersøgelser, herunder indflydelse på PARP-1 hæmning veje og cytotoksicitet, blev således udført for at afsløre en mere detaljeret billede af de mulige mål. Yderligere evaluering vil blive rapporteret i den nærmeste fremtid.

Materialer og metoder

Design og syntese af kemiske forbindelser

Vi har tidligere rapporteret nogle af potentialet i nye små molekyler som anticancer midler [17] – [26]. Detaljerne i syntese og kemisk karakterisering af NSC746364, NSC746365, NSC746366, NSC747515, NSC747854, NSC749235, og NSC749232 er blevet beskrevet tidligere i en separat rapport og så har nogle nye syntetiske derivater fra vores laboratorium. Forbindelser, såsom de her beskrevne, som interagerer selektivt med NCI Developmental Therapeutics Programs

in vitro

60 cellelinier screene og inhiberer telomerase, er potentielt anvendelige som inhibitorer af proliferation af celler, der kræver telomerase at opretholde telomerlængde for fortsat vækst.

Evaluering af anthraquinon-afledte små molekyler mod NCI-60 panel tumorcellelinjer in vitro og resumé af forundersøgelsen

Som en primær screening, syv udvalgte forbindelser blev indsendt til National Cancer Institute (NCI) cellelinier screene for evaluering af deres anticanceraktivitet [53]. Fra dataanalyse, følger det, at der kan identificeres ca. 95% af de aktive fra 60 celle skærmen linjer. De detaljerede metoder til 60 cellepanel linjer er blevet beskrevet andetsteds [54] – [59]. Kort fortalt blev bestemt cellulære protein niveauer efter 48 timers eksponering narkotika ved SRB kolorimetri. Gennem brug af en tid nul cellekontrol, kan bestemmes cellevæksten for hver cellelinje således tillader beregninger af GI

50, TGI, og LC

50. Sammenligning med plader ikke er udsat for narkotika tillader bestemmelse af koncentration og tidspunkter for eksponering der giver GI

50, TGI, og LC

50. Disse data bliver derefter afbildet som gennemsnitlig søjlediagrammer og som dosisresponskurver. Med disse kriterier, syv forbindelser rapporteret fra vores forbindelser bank blev alle aktive og videregivet til evaluering i den fulde panel af 60 humane tumorcellelinier. Panelet er organiseret i ni underpaneler repræsenterer forskelligartede histologi:. Leukæmi, melanom, og kræft i lunge, tyktarm, nyre, ovarie, bryst, prostata, og det centrale nervesystem

Cell kultur

Ikke-småcellet kræftceller A549 og Oct-4 og Nanog-overudtrykt A549-klon (klon # 3; A3), præsenterede egenskaberne for kræft stamceller-lignende celler, samt epitel-mesenchymal transdifferentiering, ifølge vores tidligere undersøgelse [46].