PLoS ONE: honokiol inducerer Calpain-medieret glukose-Reguleret Protein-94 spaltning og apoptose i Human Gastric Cancer Cells og Reducerer Tumor vækst

​​

abstrakt

Baggrund

honokiol, en lille molekylvægt naturligt produkt, har vist sig at besidde potente antineoplastiske og antiangiogene egenskaber. Dets molekylære mekanismer og evnen hos anti-mavekræft fortsat ukendt. Det er blevet vist, at anti-apoptotiske funktion af glucose-regulerede proteiner (GRP) forudsiger, at deres induktion i neoplastiske celler kan føre til kræft progression og medikamentresistens. Vi udforskede virkningerne af honokiol om regulering af GRP og apoptose i humane gastriske cancerceller og tumorvækst.

Metode og vigtigste resultater

Behandling af forskellige humane gastriske cancerceller med honokiol førte til induktion af GRP94 spaltning, men påvirkede ikke GRP78. Silencing af GRP94 af små interfererende RNA (siRNA) kunne inducere celle apoptose. Behandling af celler med honokiol eller kemoterapeutika agent etoposid forbedret stigningen i apoptose og GRP94 nedbrydning. Den calpain aktivitet og calpain-II (m-calpain) protein (men ikke calpain-I (μ-calpain)) niveau kunne også øges ved honokiol. Honokiol-induceret GRP94 nedregulering og apoptose i gastriske cancerceller kunne vendes ved siRNA målrettet calpain-II og calpainhæmmere. Desuden er resultaterne af immunfluorescensfarvning og immunpræcipitering viste en specifik interaktion af GRP94 med calpain-II i celler efter honokiol behandling. Vi næste observeret, at tumor GRP94 overekspression og tumorvækst i Balb /C nøgne mus, som blev inokuleret med humane gastrisk cancerceller MKN45, er markant nedsat ved honokiol behandling.

Konklusioner og Signifikans

Disse resultater tilvejebringer den første dokumentation for, at honokiol-induceret calpain-II-medieret GRP94 spaltning forårsager human gastrisk cancercellelinie apoptose. Vi foreslår endvidere, at honokiol kan være en mulig terapeutisk middel til at forbedre kliniske resultat af mavekræft

Henvisning:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) honokiol inducerer Calpain-medieret glukose-regulerede Protein-94 Spaltning og apoptose i human gastrisk cancer Celler og Reducerer tumorvækst. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Academic Redaktør: Hany El-Shemy, Kairo Universitet, Egypten

Modtaget: Juni 26, 2007; Accepteret: 10. oktober 2007; Udgivet 31. oktober, 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Science Rådet for Taiwan (NSC95-2320-B040-005). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald i verden [1]. Næsten to tredjedele af tilfældene forekommer i udviklingslandene og 42% i Kina alene [1], [2]. De molekylære mål og mekanismer bag dårlig prognose er ikke godt forstået. Behandlingen af ​​lokalt fremskreden mavekræft fortsat en stor udfordring. Trods de seneste fremskridt inden for behandling, det kliniske resultat for mavecancerpatienter forbliver fattige. Bortset fra kirurgi, rolle adjuverende behandling forbliver udokumenterede [2], [3]. Derfor er behovet for at identificere potentielle nye terapeutiske og kemoforebyggende midler er indlysende.

honokiol, en aktiv komponent isoleret og oprenset fra

Magnolia officinalis

, har vist sig at besidde virkningerne af anti-oxidation [4], mod lipidperoxidation [5] og anti-inflammatorisk

in vitro

in vivo

[6], [7]. Honokiol har også vist sig at være en systemisk tilgængeligt og ikke-toksisk inhibitor af angiogenese [8]. De seneste undersøgelser rapporteret, at honokiol inducerer caspase-afhængig apoptose i kronisk lymfatisk leukæmi celler og overvinder konventionelle lægemiddelresistens i human myelomatose ved induktion af caspase-afhængig og -uafhængig apoptose [9], [10]. Selv om en fuldstændig vurdering af den kliniske potentiale af forbindelserne er endnu ikke muligt, har farmakokinetik honokiol blevet grundigt undersøgt, afslører, at honokiol er til rådighed efter den kliniske kræftbehandling. Mere naturlige produkter, der indeholder en række terapeutiske forbindelser, der er nyttige i at forebygge udviklingen af ​​maligniteter fortsat blive opdaget; imidlertid meget lidt om deres underliggende virkningsmekanismer eller deres molekylære mål.

Glucose-reguleret protein (GRP) 94 er en mest rigelige glycoprotein i endoplasmatisk reticulum (ER) og kun identificeres i hvirveldyr. Over-udtryk antisense og ribozym tilgange i væv kultur systemer direkte vist, at GRP78 og GRP94 kunne beskytte celler mod død [11] – [13]. Den beskyttende funktion GRP er også blevet observeret i resistens mod stråling i livmoderhalskræft [14]. Den anti-apoptotiske funktion af GRP forudsiger også, at deres induktion i neoplastiske celler kan føre til kræft progression og medikamentresistens [15] – [18]. Patologiske tilstande, såsom tumorvækst og malignitet er blevet foreslået at korrelere med cytobeskyttende protein GRP94 overekspression [19]. I metastatisk maligniteter model, blev en signifikant effekt af GRP94-baserede gen /immunterapi strategi vises, når det blev kombineret med strålebehandling [20]. ER spiller en direkte rolle i aktivering af en delmængde af caspase under aktivering af apoptose, der opstår under ER stress [21]. På den anden side, calpainer er en familie af Ca

2 + -afhængige intracellulære cysteinproteaser. Ubikvitært calpain-I (μ-calpain) og calpain-II (m-calpain) proteaser er impliceret i udviklingen af ​​apoptose. En nylig undersøgelse har vist, at allestedsnærværende calpainer fremmer caspase-12 og JNK-aktivering i ER stress-induceret apoptose [22]. Det er også blevet anført, at GRP94 med Ca

2 + -bindingssite og anti-apoptotiske egenskaber er et proteolytisk mål for calpain i etoposid-induceret apoptose [23]. Endvidere i flere eksperimentelle modeller af apoptose, er det blevet vist, at det aminoterminale calpain inhiberende enhed Calpastatin kan spaltes af caspaser, hvilket tyder spaltningen er afgørende for reguleringen af ​​calpain aktivitet under celledød [24] – [28] . Caspase-7, som er rekrutteret til skadestuen i stressede celler, kan ligeledes spalte og aktivere caspase-12 [29] – [31]. Virkningerne af honokiol på GRP-signalering og apoptose stadig ukendt. I den foreliggende undersøgelse, vi udforskede de molekylære mekanismer i honokiol på menneskers mavekræft celle apoptose og tumorvækst

in vitro

in vivo

. Uventet fandt vi, at GRP94 gennemgår specifik proteolytisk spaltning med calpain under honokiol-induceret apoptose. Disse observationer kan give beviser, at honokiol er en mulig terapeutisk middel til at forbedre kliniske resultat af mavekræft.

Resultater

Kinetik af GRP94 proteolytisk spaltning i humane gastrisk cancer cellelinjer behandlet med honokiol

Vi først undersøgt virkningerne af honokiol på udtryk for GRP94 og GRP78 i forskellige humane gastrisk cancer cellelinjer. Honokiol markant formindsker niveauerne af GRP94 i en dosis- og tidsafhængig måde, men GRP78 niveauer er ikke påvirket (fig. 1 og 2). Kinetik af honokiol-induceret GRP94 spaltning i forskellige humane gastriske cancerceller blev vist i fig. 2. MKN45 eller SCM-1-celler var mere resistente over for honokiol-inducerede responser end AGS eller N87 celler; niveauerne af GRP94 blev reduceret til ca. 50% for dobbelt så meget tid. Niveauerne af GRP78 proteiner forbliver uændret i alle fire gastrisk cancer cellelinjer. Desuden er der små GRP94 protein udtryk i normal mus gastriske epitel væv og humane endotelceller i sammenligning med gastrisk cancer celler (Fig. 1C).

(A) Western blot-analyser for GRP94 og GRP78 i MKN45 celler behandlet med honokiol i 8 timer i en dosis-respons måde. (B) Western blot analyser for GRP94 og GRP78 i MKN45 celler behandlet med honokiol (a, 20 uM, b, 40 uM) i en tid-respons måde. (C) Sammenligning af GRP94 proteinekspression blandt humane gastrisk cancer cellelinier (SCM-1, AGS, N87, og MKN45), tumor isoleret fra MKN45 celler-podede mus (T), normal mus gastrisk epitel væv (N), og menneskelige navlevene-endotelceller (HUVEC). Alle viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Western blot analyser for GRP94 og GRP78 i celler (N87 (A), AGS (B), MKN45 (C) og SCM-1 ( D)) behandlet med 40 pM honokiol til forskellige tidsforløb som angivet. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 5).

honokiol inducerer GRP94 spaltning-associeret apoptotisk respons

Som vist i fig. 3, honokiol øgede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning og DNA-skader inducerbart gen CHOP /GADD153 (et protein er blevet identificeret til at mediere ER stress-induceret apoptose) niveauer i MKN45 celler på en dosis- og tidsafhængig måde. Honokiol 20 og 40 M udløste også udtryk for kløvet caspase-12 og caspase-7 (p20), som størrelsen af ​​stigningen var proportional med timing (fig. 3B). Desuden at forstå, om GRP94 spaltning var involveret i den humane gastriske cancer celle apoptose, blev apoptose detekteret i GRP94-siRNA-transficerede celler. Silencing af GRP94 af siRNA induceret celle apoptose (fig. 4A) og nedsat GRP94 proteinekspression (fig. 4B-a). Vi sammenlignede også virkningerne af honokiol på apoptose og GRP94 nedbrydning i humane gastriske cancerceller med kemoterapeutika agent etoposid. Resultaterne viste, at behandling af celler med honokiol eller etoposid forbedret stigningen i apoptose (fig. 4A) og GRP94 nedbrydning (fig. 4B-b). Når celler blev samtidig behandlet med 40 M etoposid og 20 M honokiol, en større stigning i GRP94 nedbrydning, end de gjorde blev vist (figur 4B-b.); disse resultater indebærer, at kombinationen af ​​honokiol med andre lægemidler mod cancer kan være en potentiel terapeutisk strategi.

(A) Western blot analyser for PARP og GADD153 i MKN45 celler behandlet med honokiol i 8 timer i en dosis-respons måde . (B) Tidsforløb svar for PARP, GADD153, caspase-7 og caspase-12 i MKN45 celler behandlet med honokiol (20 uM). De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

(A) Apoptose i GRP94-siRNA-transficerede MKN45 celler blev analyseret ved Annexin V /PI-farvning som beskrevet under materialer og metoder, der blev sammenholdt med celler behandlet med honokiol (40 uM) eller etoposid (40 uM). (B-a) Grp94 proteinniveauer blev påvist ved Western blot-analyse i kontrol og GRP94-siRNA-transficerede MKN45 celler. (B-b) honokiol og etoposid inducere GRP94 spaltning i MKN45 celler. Celler blev behandlet med 20 pM honokiol og 40 pM etoposid (Etopo.) Som angivet i 4 timer. De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Calpain er nødvendig for honokiol-medieret celle apoptose

Vi næste afgøres, om aktiviteten af ​​calpain (calcium-afhængige thiolproteaser) ville blive induceret ved honokiol i fire gastriske cancercellelinier. Som vist i fig. 5A, honokiol 20 M øgede calpain-aktivitet i en tidsafhængig måde, som begyndte at stige ved 15 minutter og toppede ved 60 minutter og faldt derefter ned til et lavere niveau ved 4 timer. Celler forblev adhærent over tidsforløbet, uden tab af levedygtighed (data ikke vist). I fig. 5B viste resultaterne, at stigningen af ​​calpain aktivitet som respons på honokiol (20 og 40 M) i 60 minutter i fire gastriske cancercellelinier. Endvidere calpainhæmmere, N-acetyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-acetyl-leu-leu-methioninal (ALLM), og Z-Leu-Leu-CHO, effektivt inhiberede stigningen i calpainaktivitet induceret af honokiol i N87 og SCM-1 celler (fig. 5C).

calpain aktivitet blev målt med den fluorescerende calpain substrat Suc-LLVY-AMC i N87, AGS, MKN45 og SCM-1 celler. (A) Tidsforløb svar til honokiol (20 uM) behandling. Data er udtrykt som fold kontrolbetingelser. (B) honokiol (20 og 40 uM) øger calpainaktivitet ved 60 minutters behandling. (C) calpainhæmmere ALLN, ALLM, og Z-Leu-Leu-CHO; 25 og 50 uM) inhiberede honokiol-øget calpainaktivitet betydeligt. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 4).

Vi yderligere testet, om nedsat calpain aktivitet kunne nedsætte evnen af ​​honokiol på apoptose induktion. Som vist i fig. 6A, honokiol (40 M) inducerede celle apoptose i SCM-1-celle, som kunne reverseres ved calpainhæmmere (AllN eller ALLM). Desuden forbedrede honokiol calpain-II-protein, men ikke calpain-I protein udtryk i SCM-1-celler (fig. 7A). Ved hjælp af en siRNA tilgang til knockdown calpain-II-aktivitet ført til en betydelig reduktion af honokiol (20 M) -induceret apoptose i humane gastriske kræftceller efter 4 timer behandling (fig. 6B). SiRNA-calpain-I påvirkede ikke honokiol-induceret apoptose (fig. 6B). Salg

Humane gastriske cancerceller blev analyseret for apoptose ved Annexin V /PI-farvning som beskrevet under materialer og metoder. (A) SCM-1-celler blev behandlet med honokiol (HK, 40 uM) i 4 timer i nærvær eller fravær af calpainhæmmere (ALLN og ALLM, 50 uM). (B) AGS celler transficeret med siRNA-calpain-I- eller siRNA-calpain-II blev behandlet med honokiol (HK, 20 uM) i 4 timer. De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Lokalisering og interaktion af calpain-II og GRP94 efter honokiol behandling

Det næste skridt var at belyse den rolle, calpain-II i honokiol-induceret GRP94 nedbrydning. I laser konfokal mikroskopisk undersøgelse blev lokaliseringen af ​​calpain-II protein bestemmes af grøn fluorescens, mens lokaliseringen af ​​GRP94 blev bestemt ved rød fluorescens. Som vist i fig. 7B, både calpain-II og GRP94 blev påvist i cytoplasma med co-lokalisering i humane gastriske cancerceller. Fluorescensen af ​​calpain-II blev gradvist forøget, men fluorescens GRP94 blev gradvist reduceret i humane gastriske cancerceller under honokiol behandling. For yderligere at bekræfte resultaterne fra immuncytokemisk farvning, at calpain-II vekselvirker med GRP94, blev forsøgene af co-immunpræcipitering og Western blotting i gastriske cancerceller udført. Som vist i fig. 7C, calpain-II blev specifikt forbundet med GRP94 i forskellige gastriske cancerceller i nærvær af honokiol (20 og 40 M) i sammenligning med IgG-kontrol. Desuden har vi testet, om de proteolytiske aktiviteter caspase, proteasom eller cathepsin var involveret i spaltning af GRP94. Vores resultater viste, at behandling af celler med caspaseinhibitorer (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK og Z-DEVD-FMK, 50 m) ved høj dosis delvist blokeret spaltningen af ​​GRP94 under honokiol-induceret apoptose (fig. 8A ) sammenlignet med calpaininhibitor ALLM 25 M, som fuldstændigt kunne blokere GRP94 spaltning. Forbehandling af celler med cathepsin B hæmmer CA-074-Me 25 og 50 M og cathepsin L inhibitor cathepsin L inhibitor II 25 og 50 M og proteasominhibitoren MG132 0,1-10 M ikke var i stand til at blokere GRP94 spaltning (fig. 8B og 8C) . Endvidere kunne den specifikke spaltning af GRP94 ved calpain observeres ved anvendelse cellelysater fremstillet ud fra humane gastriske cancerceller (data ikke vist). Salg

Celler blev behandlet med honokiol (20-60 pM) for forskellige tidsforløb som angivet . (A) calpain-I og II-proteinniveauer blev påvist ved Western blot-analyse i honokiol-behandlede SCM-1-celler. (B) primære antistoffer for calpain-II og GRP94 blev påført til cellerne (MKN45 og SCM-1) efterfulgt af sekundære antistoffer koblet med FITC-konjugeret eller TRITC-konjugeret hhv. Co-lokalisering af to mærkede antigener blev påvist som et enkelt billede, når billederne fra begge kanaler blev overlejret. (C) Interaktion af calpain og GRP94 blev påvist i N87, AGS, MKN45 og SCM-1 celler. Immunopræcipiterede proteiner blev opsamlet og udsat for SDS-PAGE og immunoblotting med anti-calpain-II eller anti-Grp94 antistoffer. De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Celler var enten ubehandlede eller forbehandlet med inhibitorer i 1 time efterfulgt af 40 uM honokiol behandling i yderligere 24 timer. (A) caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK, 25 og 50 uM) eller calpaininhibitor (ALLN, 25 uM); (B) cathepsin B-inhibitor (CA-074-Me, 25 og 50 uM) eller cathepsin L inhibitor (cathepsin L inhibitor II, 25 og 50 uM); (C) proteasominhibitor (MG132, 0,1-10 uM) eller calpaininhibitor (ALLN, 25 uM). De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

Derefter undersøgte vi, om aktiveringen calpain er påkrævet for honokiol-induceret celle apoptose. I fig. 9, blev forhøjelserne af calpain-II proteinekspression og GRP94 nedbrydning og caspase-7 og caspase-12-aktivering induceret af honokiol (40 M) forhindres ved farmakologiske calpainhæmmere og forbigående transfektion af siRNA-calpain-II i SCM-1-celler.

Western blotting til bestemmelse af GRP94 nedbrydning og calpain-i og II-ekspression og aktivering af caspase-7 og caspase-12 i SCM-1-celler 24 timer efter honokiol (40 uM) behandling i nærvær eller fravær af calpaininhibitor (ALLN og ALLM, 25 og 50 uM) blev detekteret. I nogle forsøg blev SCM-1-celler transficeret med calpain-II-siRNA eller kontrol-siRNA. De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg.

honokiol dæmper tumor GRP94 overekspression og tumorvækst i nøgne mus

Nøgne mus blev podet med 4 × 10

6 udifferentierede adenocarcinomceller MKN45 og behandlet med honokiol 0,5 og 1,5 mg /kg eller køretøjet, når tumor blev klart. Immunhistologisk og Western blotting-analyse viste, at GRP94 overekspression og akkumuleres i tumor region, men ikke i normalt gastrisk væv (fig. 10A-a og 10A-B). Honokiol markant nedsat akkumulering af GRP94 i tumorer sammenlignet med vehikelkontrol (fig. 10A-a og 10A-B). Ekspressionen af ​​GRP78 blev ikke påvirket (data ikke vist). For at bestemme om honokiol kunne undertrykke tumorvækst

in vivo

, solide tumorer blev etableret i mus og anti-tumor effekt af gentagne gange injiceret honokiol blev undersøgt. Som vist i fig. 10B, administration af honokiol 0,5 og 1,5 mg /kg viste en signifikant antitumoraktivitet.

Tumorer i nøgne mus blev etableret i 14 dage efter MKN45 celler injektion og efterfulgt af behandling med 0,5 og 1,5 mg /kg honokiol hver dag i 10 dage. (A-a) Grp94 udtryk i tumorer eller normale gastriske væv blev bestemt ved immunohistokemi. Snittene blev farvet med GRP94 antistof som beskrevet under materialer og metoder. Udtrykkene for Grp94 proteiner i cytoplasmaet blev farvet i mørkebrun. (A-b) Western blotting til bestemmelse af Grp94 proteiner i tumorer med eller uden honokiol behandling blev påvist. (A-C) Påvisning af GRP94-proteinekspression ved Western blotting i MKN45 celler med eller uden honokiol (40 uM) behandling eller i normale gastriske væv blev vist. De viste resultater er repræsentative for mindst fire uafhængige forsøg. (B) Tumorvolumen blev vurderet. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 7).

Diskussion

Vi rapporteret her for første gang, at calpain, en nonlysosomal Ca

2 + -aktiverede cystein protease, især calpain-II, spiller en central rolle i spaltningen af ​​GRP94, men GRP78 påvirkes ikke, og i reguleringen af ​​apoptose induceret af honokiol i humane gastriske kræftceller. Især vi forudsat funktionelle beviser at spaltningen af ​​GRP94 på honokiol behandling fungerer som en terapeutisk fordel, at hæmme tumorvækst i musemodel af human gastrisk karcinom. Til vores viden, er dette den første rapport, der viser, at honokiol kan manipulere calpain-inducerbare chaperone protein GRP94 nedbrydning er målet under apoptose.

Undersøgelser fra flere laboratorier pegede på skadestuen som et mål rummet ved terapeutiske midler impliceret i apoptose udførelse. Cytosolisk Ca

2+ har været impliceret som en anden budbringer af proapoptosis involveret i både udløsende apoptose og regulerer caspaser eller calpainer [32] – [34]. En nylig undersøgelse har vist, at calpain er en vigtig mediator af resveratrol (en naturlig plante polyphenol) -induceret apoptose i brystcancer [35]. De fandt, at resveratrol kan forårsage en stigning i intracellulær Ca

2+, og aktiverer calpain-medieret apoptose, der fører til nedbrydning af plasmamembranen Ca

2 + -ATPase isoform 1 og fodrin i caspase-3 deficient MCF- 7-celler. Honokiol er også rapporteret at inducere Ca

2+ mobilisering i rotte corticale neuroner og humane neuroblastom SH-SY5Y-celler, formodentlig gennem aktivering af phospholipase C og IP

3 receptorer [36]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at honokiol kan øge calpainaktivitet og calpain-II-protein-ekspression, men ikke calpain-I under honokiol-induceret gastrisk cancercellelinie apoptose. Desuden calpainhæmmere og inaktivering af calpain-II fra siRNA betydeligt vendt honokiol apoptose. Disse resultater indebærer, at Ca

2 + -triggered calpain-II aktivering kan spille en potentiel rolle i honokiol-induceret apoptose.

GRP94 /gp96 er ER bosiddende medlem af HSP90 familien. GRP94 spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​cellulær homeostase. Denne konventionelle begreb GRP94 som proteinfoldning chaperone opdateres af de opdagelser, GRPS fremme tumor spredning, metastase, resistens, og immunterapi, som har større kliniske implikationer i prognosen og behandling af kræft [3]. GRP94 er blevet påvist at være forbundet med tumorigenicitet i cancer-cellelinjer, gnaver tumormodeller og human cancer biopsier [37] – [39]. Dette er i overensstemmelse med resultaterne, at induktion af GRP forårsager en beskyttende funktion som overlevelse reaktioner på næringsstof sult, acidose, og hypoxi vilkår, som er almindelige i dårligt vaskulariserede solide tumorer [11], [40]. Det er også blevet vist sig, at de fleste af de GRP i tumorceller er engageret i multi-chaperone-komplekser, mens det ikke er i normale celler [41]. Vaccination af mus med tumorafledte stressproteiner, GRP94, kan fremkalde anti-tumor immunrespons, hvilket gav en markant suppression af tumorvækst og metastase. Aktiviteten af ​​Hsp90-inhibitorer er blevet godt valideret i prækliniske brystkræft modeller, både i undersøgelser enkeltstof og i kombination med konventionel kemoterapi [41]. Desuden er det blevet foreslået, at GRP94 er en fysiologisk substrat for calpain [23]. Calpain er blevet påvist at blive aktiveret på ER-membranen, hvor det interagerer med GRP94, hvilket resulterer i dens specifikke proteolytisk spaltning som cellerne undergår apoptose udløst af etoposid [23]. I aktuelle undersøgelse fandt vi, at honokiol-induceret GRP94 spaltning og apoptose i humane gastriske cancerceller fuldstændig kan vendes ved calpainhæmmere og inaktivering af calpain-II fra siRNA. Caspaseinhibitorer på høj dosis delvist vendt honokiol-induceret GRP94 spaltning. Forbehandling af celler med cathepsin B og L-inhibitorer og proteasominhibitor var ikke i stand til at blokere honokiol-induceret GRP94 spaltning. Vi viste også, at silencing af GRP94 af siRNA kan inducere gastrisk cancercellelinie apoptose. Desuden er resultaterne af immuncytokemisk farvning og immunpræcipitering viste en specifik interaktion af GRP94 med calpain-II i gastriske cancerceller efter honokiol behandling. Den specifikke spaltning af GRP94 ved calpain kunne også observeret ved anvendelse af cellelysater fremstillet ud fra humane gastriske cancerceller. Disse resultater tyder derfor på, at calpain-II-medieret GRP94 spaltning spiller en vigtig rolle i honokiol-udløst gastrisk cancercellelinie apoptose.

calpainer og caspaser er to familier af cysteinproteaser, at de er involveret i regulering patologisk celle død [22], [31]. Disse proteaser deler flere død-relaterede substrater, herunder caspaser selv, cytoskeletale proteiner, Bax, og Bud [42]. Calpain-medieret proteolyse foregår på en begrænset måde, men kræver ikke en specifik aminosyrerest ligesom caspaser. Selvom både calpain og caspase er blevet foreslået at spille vigtige roller i reguleringen patologisk celledød, interaktionerne mellem disse to familier af proteaser under patologiske tilstande er ikke klare. I den foreliggende undersøgelse har Knockdown og farmakologiske hæmmere tilgange bidraget betydeligt til vores viden om calpain biologi, især med hensyn til dets specifikke funktion på celle apoptose, hvilket er muligt, at caspaser 7 og 12 er nedstrøms fra calpain i mediering honokiol-induceret gastrisk cancer celle apoptose.

naturprodukt lægemidler er blevet foreslået at spille en dominerende rolle i farmaceutisk omsorg [43]. Naturlige produkter er en af ​​de vigtige kilder til potentiel kræft kemoterapeutiske og kemoforebyggende midler [43]. Honokiol har været meget anvendt i traditionel kinesisk og japansk medicin i flere tusinde år, primært til behandling af anti-trombocytisk, anti-bakteriel, anti-inflammatoriske og anxiolytiske virkninger. Tidligere rapporter har vist, at honokiol også besidder potente antineoplastiske og antiangiogene egenskaber [6], [19], [38]. Imidlertid er den præcise molekylære mekanisme udviste anti-tumor-aktivitet ved honokiol ikke godt forstået. Dermed er resultaterne af denne undersøgelse giver beviser for antitumoraktiviteten af ​​honokiol i gastrisk cancer, og endnu vigtigere, den molekylære basis for dets effekt. Vi fandt, at honokiol inducerer aktiveringen af ​​calpain, GRP94 spaltning, og apoptose i humane gastriske cancerceller. Endvidere efter administration af honokiol i nøgne rart implanteret med MKN45 gastriske tumorceller viste signifikant antitumoraktivitet. Denne præklinisk studie kan tjene som ramme og repræsenterer en lovende roman målrettet tilgang. Desuden har de naturlige forbindelser blevet vist at kombinere med konventionelle cytotoksiske midler kan være klinisk fordelagtig med anticancerlægemidler. Denne fordel plus de nye beviser for sine anti-tumor mekanismer gør honokiol igangværende kliniske program for at være en effektiv og sikker anti-tumor agent.

Materialer og metoder

Celler, kultur Betingelser og reagenser

Humane cellelinjer, herunder kaukasiske gastrisk kræft cellelinier (AGS, et moderat dårligt differentieret adenocarcinom cellelinje og N87, en godt differentieret carcinom cellelinje) og asiatiske gastrisk cancer cellelinjer (MKN45 og SCM-1, den udifferentierede adenocarcinomceller) blev opnået fra celle bank i kræft centrum af Taipei veteraner hospital (Taiwan). Celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 10% varmeinaktiveret FCS (Life Technologies) og streptomycin /penicillin (Life Technologies) i en befugtet 5% CO

2 atmosfære. Honokiol blev opnået fra Wako Chemical Company (Japan), og renheden blev bestemt til at være mindst 99% ved højtydende væskekromatografi. Salg

Western blot analyse og immunbundfældninger

Hele cellelysater blev fremstillet som tidligere [44] beskrevne. Proteiner blev separeret ved forstøbte 8-20% SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og derefter elektroforetisk overført fra gelen over på polyvinylidendifluorid-membraner. Efter blokering blev blots inkuberet med anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspase 12, anti-caspase 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-calpain-I (μ-calpain), anti-calpain-II (m-calpain) (Santa Cruz Biotechnology), og anti-β-actin (Sigma) antistoffer i PBS inden 0,1% Tween 20 i 1 time efterfulgt af tre 10 minutters vaske i PBS inden 0,1% Tween 20. Den membraner blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer i 60 min. I immunopræcipitation blev proteiner (500 g) inkuberet med specifikke antistoffer og immobiliseres på protein A-Sepharose-perler. Perler blev vasket grundigt med Bacco s immunoprecipitative buffer, kogt, og mikrocentrifugeret. Input 10% af cellelysatet til IP og 50 g proteiner blev analyseret ved Western blotting. Detektion blev udført med Western blotting reagens ECL (Amersham), og kemiluminescens blev afsløret af de Kodak X-Omat film.

calpainaktivitet Analyser

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC er en calpain proteasesubstrat. Kvantificering af 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) fluorescens tillader overvågning af enzym hydrolyse af peptid-AMC konjugat og kan anvendes til at måle enzymaktiviteten. Celler blev fremstillet og behandlet på 24-brønds Corning /Costar-plader. Før tilsætning af inhibitorer celler blev fyldt med 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) og behandlet med honokiol for angivne timing ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. Proteolyse af den fluorescerende probe blev overvåget ved hjælp af en fluorescerende plade læsesystem (HTS-7000 Plus Series bioassay, Perkin Elmer) med filterindstillinger på 360 ± 20 nm for excitation og 460 ± 20 nm for emission.

SiRNA og transfektionsassays

siRNA-duplexer specifik til inhibering af calpain-i (μ-calpain) og calpain-II (m-calpain) udtryk i humane celler blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology: calpain-i, katalognr . sc-29.885, en pulje af 3 målspecifik 20-25 nt siRNAs; calpain-II, katalognr. sc-41.459, en målspecifik 20-25 nt siRNA. Kontrolsekvenserne siRNA (katalog nr. Sc-37007) er en ikke-targeting 20-25 nt siRNA udformet som en negativ kontrol. Desuden siRNA-duplexer specifikke for inhibering af GRP94 ekspression blev syntetiseret kommercielt af MWG Biotech (Tyskland). Sense (top) og antisense (bund) sekvenser af GRP94 siRNA duplex var som følger: 5′-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 ‘; 3’-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 ‘. Som uspecifik kontrol, en NC siRNA duplex med vilkårlige sekvenser blev konstrueret som følger: 5’-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 ‘; 3’-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 ‘. De siRNA’er blev anvendt ved en koncentration på 100-200 nM for transient transfektion af celler med Lipofectin (Invitrogen) per brønd i en 6-brønds plade med frisk medium. Efter 24 timer fra den indledende transfektion og 24-36 h behandling blev celler eller cellelysater indsamlet og analyseret for apoptose eller protein ekspression hhv.

Immunofluorescens og Laser Scanning konfokal mikroskopi

Celler blev vasket to gange med PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd i 30 minutter og derefter blokeret ved inkubering i 1% bovint serumalbumin i PBS. Primære antistoffer som indikeret blev anvendt til objektglassene ved en fortynding på 1:500 og inkuberet ved 4 ° C natten over. Prøverne blev behandlet med FITC-konjugerede eller TRITC-konjugerede sekundære antistoffer (Sigma).