PLoS ONE: Forhøjede Phospholipase A2 Aktiviteter i plasmaprøver fra Multiple Cancers

Abstrakt

Kun i de seneste år har phospholipase

2 enzymer (PLA

2s) opstod som cancer-targets. I dette arbejde rapporterer vi den første påvisning af forhøjede PLA

2 aktiviteter i plasma fra patienter med colorektal, lunge, pancreas, og blære kræft sammenlignet med raske kontroller. Uafhængige sæt af kliniske plasmaprøver blev opnået fra to forskellige steder. Det første sæt var fra patienter med colorektal cancer (CRC; n = 38) og raske kontroller (n = 77). Det andet sæt var fra patienter med lunge (n = 95), blære (n = 31), eller pancreascancer (n = 38), og raske kontroller (n = 79). PLA

2 aktiviteter blev analyseret ved en valideret kvantitativ fluorescenstest fremgangsmåde og undertype PLA

2 aktiviteter blev defineret i nærvær af selektive inhibitorer. Den naturlige PLA

2-aktivitet, såvel som hver undertype af PLA

2-aktivitet var forhøjet i hvert cancer gruppen sammenlignet med raske kontroller. PLA

2 aktiviteter blev forøget i sent stadium vs. sager tidlige fase i CRC. PLA

2 aktiviteter blev ikke påvirket af køn, rygning, alkoholforbrug, eller body mass index (BMI). Prøver fra de to uafhængige steder bekræftede resultaterne. Plasma PLA

2 aktiviteter havde cirka 70% specificitet og følsomhed til påvisning af cancer. Markøren og målretning værdier af PLA

2-aktivitet er blevet foreslået

Henvisning:. Cai H, Chiorean EG, Chiorean MV, Rex DK, Robb BW, Hahn NM, et al. (2013) Forhøjet phospholipase

2 Aktiviteter i plasmaprøver fra flere kræftformer. PLoS ONE 8 (2): e57081. doi: 10,1371 /journal.pone.0057081

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 27. september 2012; Accepteret: 17 Januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Cai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af Cancer Care Engineering Project, Department of Defense, USAMRMC, W81XWH-08-1-0065 og W81XWH-10-1-0540 (https://www.grants.gov/search/search.do?mode = AGENCYSEARCH agentur = DOD), samt National Institutes of Health R21 CA133744 (https://www.cancer.gov/researchandfunding) og Mary Fendrich Hulman Charitable Trust til YX. Finansiering af Hoosier Oncology Group Study blev leveret af Walther Cancer Institute Foundation, Indianapolis, IN. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Forfatterne har fyldt en PCT-patentansøgning “PLA2-aktivitet som en markør for æggestokkene og andre Gynækologiske kræftformer” i 2011. Det ikke ændrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft er en af ​​de store sundhedsmæssige byrder i hele verden. Mere end 1,6 millioner nye kræfttilfælde og over 577 tusind kræftdødsfald forventes at forekomme i USA i 2012 [1]. Lungekræft (LC) og kolorektal cancer (CRC) er blandt de hyppigste kræftformer. Pancreas og blære kræft tæller (3-7% af alle kræfttilfælde), men bugspytkirtelkræft (PC) er en af ​​de deadest kræftformer, med en trist 5-års overlevelse på 6 [1]%. Succesen med de nuværende kræftbehandling afhænger stærkt af diagnosetidspunktet, med tidlig påvisning og identifikation af patientpopulationer højrisiko resulterer i de mest gunstige overordnede overlevelse i disse sygdomme [1], [2]. Det forventes, at tidlig opsporing og screening af patientpopulationer højrisiko kan have den største indvirkning på at ændre den samlede overlevelse i disse sygdomme. Således er der et presserende behov for effektive og følsomme tidlige påvisningsmetoder [3]. Mens imaging-baserede påvisningsfremgangsmåder, herunder spiral edb-aksial tomografi (CT) og koloskopi er effektive tidlige metoder til påvisning af LC og CRC henholdsvis [4], de er temmelig dyre og ubekvemme. Derudover moderne billeddannende teknikker har en høj forekomst af opdagelsen af ​​lungeknuder, hvoraf mange er falsk positive, men stadig kræver yderligere og undertiden smertefulde undersøgelser [5]. Molekylære metoder til kræftdiagnose gennem biomarkører målt ved ikke-invasive midler kunne i betydelig grad forbedre specificitet og følsomhed for kræft afsløring [5]. Især kan serologiske biomarkører være den mest nyttige i tidlig påvisning på grund af den minimale invasiv, omkostningseffektivitet, og bekvemmelighed. Desuden serologiske biomarkører identificerer nye cancer-relaterede gener og /eller molekyler kan give ny indsigt i biologi kræft og kan også blive attraktive mål for behandling [3].

phospholipase

2 enzymer (PLA

2s) er de store enzymer, der producerer cyclooxygenase-2 (COX-2) substrat, arachidonsyre (AA) samt lysophospholipider. Begge disse klasser af produkter signalmolekyler involveret i cancertyper. Men kun i de seneste år har PLA

2s opstået som cancer-targets [6]. Mere end 30 enzymer, der besidder PLA

2 eller beslægtet aktivitet, er blevet identificeret i pattedyr [7]. De er inddelt i fire grupper baseret på deres cellulære lokalisering, substratspecificitet, og calcium-afhængighed [8], herunder cytosol (CPLA ​​

2), calcium-uafhængig (IPLA

2), udskilt (SPLA

2), og lipoprotein-associeret PLA

2 (Lp-PLA

2). I kræft, har det meste af opmærksomheden været fokuseret på SPLA

2 og CPLA

2 [8]. Vi og andre har vist, at IPLA

2 er funktionelt involveret i at fremme udviklingen af ​​kræft i æggestokkene (OC) og andre kræftformer,

in vitro

in vivo

[9] – [ ,,,0],13]. SPLA

2 og Lp-PLA

2 udskilles enzymer. I modsætning hertil både CPLA

2 og IPLA

2 er cytosoliske enzymer og deres ekstracellulære eksistens er kun blevet vist at være relateret til exosomer fra RBL-2H3-celler (en mast og basofil cellelinie) [14]. Exosomer er 40-100 nm diameter membranvesikler frigivet fra multivesikulære organer ved intakte celler og vides at deltage i intercellulær signalering [15]. Vi har for nylig opdaget extracellular- og exosom-fri IPLA

2 og CPLA

2 aktiviteter i ascites og væv fra OC patienter [16].

I den nuværende arbejde, vi har fokuseret på PLA

2 aktiviteter snarere end udtryk for individuelle PLA

2 enzymer og undersøgt PLA

2 aktiviteter i blodplasma prøver fra patienter med forskellige kræftformer, sammenlignet med dem fra raske kontrolpersoner. Vi brugte vores nyligt valideret kvantitativ, praktisk, meget reproducerbar PLA

2 assay metoden [16] og viste for første gang, at plasma PLA

2 aktiviteter fra patienter med CRC, LC, PC, og blærekræft (BC) var betydeligt højere end hos raske kontroller. Desuden blev PLA

2 aktiviteter korreleret med tumor stadier i CRC. Andre potentielle indflydelsesrige faktorer, herunder køn, alder, rygning og alkoholforbrug blev også undersøgt i denne undersøgelse.

Materialer og metoder

Menneskelig prøve indsamling og behandling

To sæt uafhængigt opsamlede kliniske plasmaprøver blev opnået for denne undersøgelse. Det første sæt fra Indiana University School of Medicine (IUSM) fokuserede på CRC patienter og raske kontrolpersoner screenet af koloskopi og fundet negative for adenomatøs polypper og CRC. Blodprøver indsamles i nærvær af EDTA blev centrifugeret ved 1.750 g i 15 minutter ved 15-24 ° C, alikvoteret i silikonebelagte Eppendorf-rør og opbevaret ved -80 ° C. Det andet sæt prøver var fra patienter med lunge, blære, eller pancreascancer, samt raske kontroller. Disse prøver blev indsamlet af Hoosier Oncology Group (HOG) i Indianapolis, IN som en del af undersøgelsen med titlen, “en biologisk prøve Collection protokollen af ​​patienter med og uden metastatisk Solid Organ Maligniteter: Hoosier Oncology Group Study BANK09-138”. Blodprøver blev centrifugeret ved 3.500 rpm i 30 min. De alikvoteres prøver blev opbevaret ved -70 ° C. HOG er en non-profit medicinsk forskning organisation. Selv om det er en separat enhed, IUSM er en understøttende organisation for bestyrelsesmedlemmer aftaler og IRB godkendelser til HOG. Tre separate IRB protokoller for indsamling og /eller bruge blodprøver relateret til dette arbejde er blevet godkendt af de samme IUSM Institutional Review Board (Protokol numre: 0670-81, 0808-24, 0905-20). Skriftligt informeret samtykke former blev indhentet fra alle fag og alle kliniske undersøgelser var blevet gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen.

Reagenser og inhibitorer

PLA

2 substrat 1 -O- (6-Dabcyl-aminohexanoyl) -2-O- (6- (12-BODIPY-dodecanoyl) aminohexanoyl) -Sn-3-Glyceryl phosphatidylcholin (DBPC) var fra Echelon Bioscience (Salt Lake City, UT, USA) . Bromoenol lacton (BEL) og methyl arachidonylfluorophosphonate (MAFP) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA).

PLA

2 enzymatiske aktivitet analyser

PLA

2 aktiviteter blev analyseret under anvendelse af fluorescerende substrat DBPC, et fluorogent phosphatidylcholin substrat [17]. Plasmaprøver (0,1 pi) blev blandet med DBPC (0,2 ug i PBS) til slutvolumen 200 pi. Fluorescensen blev aflæst ved intervaller over flere timer på en Victor

3V pladeaflæser (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). PLA

2 aktiviteter blev udtrykt som ændring i fluorescens intensitet /min /pi plasma. Som tidligere beskrevet [16], valgte vi betingelser for at skelne PLA

2 aktivitet hidrører fra forskellige undertyper: a) den “naturlige” PLA

2 aktivitet uden nogen eksogene tilsætningsstoffer, b) IPLA

2 aktivitet i nærvær af 5 mM EDTA (en divalent kation chelator at blokere al PLA

2s trænger calcium, herunder SPLA

2 og CPLA

2), c) SPLA

2-aktivitet i nærvær af 1,2 mM calciumchlorid (naturlige koncentration af ioniseret calcium i blod [18]) og MAFP (10 uM, en dobbelt inhibitor af CPLA

2 og IPLA

2), og d) CPLA

2-aktivitet i tilstedeværelse af 100 uM calciumchlorid og bromoenol lacton (BEL, 10 uM, en selektiv hæmmer til IPLA

2).

Statistisk analyse

kategoriske variable blev opsummeret som tæller med procenter og løbende variabler blev opsummeres som betyder med standardafvigelser (SD) på tværs af sund kontrol, og kræft grupper. Chi-square test blev anvendt til at teste sammenhængen mellem sygdom statusser og kategoriske kovarianter såsom køn, race, rygning og alkohol drikke. For kontinuerlige kovarianter som alder og BMI, blev envejs ANOVA anvendt til at teste generel forskel og Student

t

-test blev anvendt til at teste den parvise forskel tværs sygdomstilstande status. Lineær regression blev anvendt til at vurdere univariate associering mellem PLA

2 målinger og kovariater. Logistisk regression blev anvendt til at evaluere klassificering ydeevne PLA

2 målinger. Bootstrap blev anvendt til internt validere klassificeringen ydelse med 1000 prøver [19]. Hver prøve havde samme størrelse som den oprindelige datasæt og blev anvendt til at udvikle modellen. Resultaterne blev derefter testet i de oprindelige data. Områder under kurven (AUC) blev beregnet for hver gentagelse. Alle tests var to-sidet. I betragtning af den sonderende karakter af denne undersøgelse blev der ikke justeringer for flere sammenligninger vedtaget.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-software version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultater

Emne demografiske data

De demografiske data for undersøgelsen deltagerne er opsummeret i tabel 1. i IUSM CRC sæt prøver, 41,7% af de samlede var mænd, 88,7% var hvide, og den gennemsnitlige alder var 53,1 år. Den alder, køn og race sammensætning var ikke signifikant forskellig i kontrol vs. CRC-grupper (

P

værdier 0,05; tabel 1). For det andet sæt af prøver, alder hos den raske kontrolgruppe var signifikant yngre end hver af de tre cancer grupper (tabel 1). Selvom mænd var dominerende i hver gruppe, de var ikke signifikant forskellig fra det andet sæt af raske kontrolpersoner. 71,2% af de samlede deltagere var mænd, 90,4% var hvide, og den gennemsnitlige alder var 58,3 år (tabel 1).

Reproducerbarhed og stabilitet PLA

2 analyser

Vi har for nylig valideret kvantitativ karakter af DBPC-baserede PLA

2 assays og optimeret betingelserne for biologiske væsker og væv prøver [16]. Når hver af 8 repræsentative plasmaprøver blev analyseret tre gange, PLA

2-aktivitet værdier reproducerbar, med en gennemsnitlig standardafvigelse (SD) 13,5 (1,3%). Vi testede også PLA

2-aktivitet stabilitet ved at sammenligne dem i prøver før opbevaring til dem i de samme prøver opbevaret ved -80 ° C i en måned, samt virkningen af ​​frysning-og-tø på PLA

2 aktiviteter i 8 repræsentative prøver. Som tidligere rapporteret [16], PLA

2 aktiviteter var stabil med SDS 35,8 (5,8%). Endvidere viste vi, at i nærvær af alle andre assaykomponenter herunder inhibitor (er) anvendt i denne undersøgelse, men i fravær af blod eller andre biologiske prøver, den ikke-specifikke hydrolyse af DBPC substrat var negativ og ubetydeligt (data ikke vist).

Den naturlige PLA

2, CPLA

2, IPLA

2, og SPLA

2 aktiviteter blev forhøjet i prøver kræft vs raske kontrolpersoner

Blood IPLA

2 og CPLA

2 aktiviteter er ikke tidligere rapporteret i humane prøver. Vi analyserede den naturlige PLA

2 (defineret som PLA

2 aktivitet målt under betingelserne uden modifikatorer, som kan være lavere end summen af ​​undergruppen PLA

2 aktivitet målt under ændrede betingelser), som samt CPLA

2, IPLA

2 aktiviteter i plasmaprøver.

Med undtagelse af den sunde vs. CRC CPLA

2 aktivitet, alle andre sammenligninger viste

2, og SPLA at PLA

2 aktiviteter blev signifikant forhøjet i kræft grupper (fig. 1A og 1B). PLA

2 aktivitet værdier på tværs af plasmaprøver fra LC, BC, og pc-patienter var ikke signifikant forskellige (

P

værdier 0,05)

Sammenligning af PLA

2 aktiviteter. i den sunde kontrol (normal koloskopi, n = 77) og CRC (N = 38) grupper. A. Sammenligning af PLA

2 aktiviteter i den sunde (n = 79) og andre kræft grupper. Lungecancer (LC, n = 95), blærecancer (BC, n = 31) og pancreascancer (PC, n = 38). Fordelingen af ​​de naturlige og individuelle grupper af PLA

2 aktiviteter blev analyseret som beskrevet i materialer og metoder. Middelværdierne for PLA

2 aktiviteter blev fremlagt af “+” i figuren. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

. 0,001

Siden SPLA

2 udskilles, det var forventet, at SPLA

2 aktivitet ville tegne sig for størstedelen af ​​den PLA

2 aktivitet påvises i blodet. Men i vores resultater, høje niveauer af IPLA

2 og CPLA

2 og lave niveauer af SPLA

2 aktiviteter blev observeret i alle plasmaprøver. Blood exosomer kan være bærere af disse aktiviteter [15]. Vi brugte differentiel centrifugering trin som vi beskrev for nylig [16] for at afgøre, hvorvidt disse aktiviteter kan være forbundet med blodplader, exosomer eller andre mikrovesikler. To blodprøver blev først centrifugeret ved 1.750 g i 15 minutter til fjernelse af de fleste blodlegemer og supernatanten blev betegnet S1. S1 blev centrifugeret ved 20.000

g

i 20 minutter, hvilket resulterede i S2 og pelleten 2 (P2 cellefragmenter og store vesikler). S2 blev ultracentrifugeret ved 110.000

g

i 2 timer, hvilket resulterede i S3 og P3 (exosomer). En endelig centrifugering af S3 på 200.000

g

i 2 timer resulterede i S4 og P4 (andre mikrovesikler). Vi fandt, at alle PLA

2 aktiviteter blev tilbageholdt i S1 gennem S4 fraktioner, hvilket tyder på at de var “fri” og ikke er forbundet med mikrovesikler (detaljerede data ikke vist). Dette svarer til, hvad vi for nylig har rapporteret i humane ovariecancer ascites og nye sekretion mekanismer til IPLA

2s og CPLA

2s kan være involveret [16].

Kliniske parametre og PLA

2 aktiviteter i cancerpatienter plasmaprøver

Interessant, den naturlige, IPLA

2, og SPLA

2 aktiviteter i plasma af CRC patienter forøget hos forsøgspersoner med sene stadier (III og IV) sammenlignet med tidligere tidspunkt (i og II) sygdom (

P

= 0,0335, 0,0367, 0,0778, og 0,0345 for PLA

2, IPLA

2, CPLA

2, og SPLA

2 henholdsvis;. figur 2), hvilket antyder, at disse enzymatiske aktiviteter kan være involveret i CRC progression. Vi sammenlignede PLA

2 aktiviteter i tyktarmen (n = 24) vs. rektal (n = 14) prøver. Selvom naturen, samt undergruppen PLA

2 aktiviteter hos patienter med tyktarmskræft var højere end dem fra endetarmen kræftpatienter, forskellene var ikke statistisk signifikant (

P

0,05 i alle tilfælde ; tabel 2). Desuden blev ingen forskel findes i PLA

2 aktiviteter blandt forskellige undergrupper af CRC patienter med tidligere behandlinger (operation, kemoterapi, strålebehandling eller ubehandlet; tabel 2). Derimod fandt vi, at PLA

2 aktiviteter blev ikke korreleret til enten T eller N stadier af LC, BC, eller PC (tabel 3).

De naturlige og individuelle grupper af PLA

2 aktiviteter blev gradvist øget med tumor fase. Trin I og II (n = 7), trin III og IV (n = 31). * Student t-test,

P

. 0,05 Vejviser

Virkningerne af andre faktorer på PLA

2 aktivitet

Vi har samlet andre faktorer, som kan påvirke PLA

2 aktiviteter, herunder rygning, alkoholforbrug, og body-mass index (BMI). For CRC undersøgelse fra 80 forsøgspersoner med tilgængelige ryge oplysninger (27 CRC og 53 sunde sager), de fleste (96%) af mennesker ikke ryge, når prøverne blev indsamlet, med en gennemsnitlig 50,5% mennesker aldrig røget, og 45,7% af tidligere ryger, og kun 9,4% og 19,2% folk havde brugt rygning eksponering i hver gruppe. De ryger status blev ligeledes fordelt i to grupper (

P

værdier 0,05; detaljerede data i tabel 4), og der var ingen statistiske forskelle i PLA

2 aktiviteter blandt forskellige ryger status (Fig 3A. ). I det andet sæt af undersøgelse, rygning status var signifikant forskellig mellem

P

værdier raske kontrolpersoner, og hver af de kræft grupper med højere procenter af mennesker, der var gældende, fortid, eller brugte rygere i kræft grupper ( 0,05, bortset fra i et sammenligning, tabel 5). Ikke desto mindre blev der ikke observeret statistiske forskelle i PLA

2 aktiviteter blandt forskellige ryger statusser, der understøtter konceptet stammer fra det første sæt af undersøgelsen, at plasma PLA

2 aktiviteter påvirkes ikke af at ryge (fig. 3B).

PLA2 aktiviteter i sunde og CRC prøver med forskellige ryger status (a) og passiv rygning status (b). A. Sammenligning af PLA2 aktiviteter mellem forskellige rygning statusser (a) og passiv rygning statusser (B) i deltagere med LC, BC, og PC. Vejviser

Alkoholforbrug i kontrol og CRC grupper var ikke signifikant forskellige (tabel 4). De alkohol forbrugere i CRC grupper tendens til at have højere niveauer af plasma PLA

2 aktiviteter, men forskellene var ikke statistisk signifikant (fig. 4). Men på grund af det lave antal i ikke-alkoholindtagelse (n = 7), bør vi fortolke disse data med forsigtighed. For andre cancere, blev der opnået lignende resultater. Selv om der var signifikant højere procentdele af alkoholforbruget fag på andre kræft grupper (tabel 5), PLA

2 aktiviteter blev ikke signifikant relateret til alkohol (fig. 5).

Sammenligning af PLA2 aktiviteter mellem ” non-alkohol “og” alkohol “grupper med de sunde og CRC deltagere. A. Sammenligning af PLA2 aktiviteter mellem “non-alkohol” og “alkohol” groupsin det andet sæt af undersøgelser med raske, LC, BC, og pc-deltagere.

PLA2-aktivitet sammenligning hos mænd og kvinder i den sunde og CRC-grupperne. A. PLA2-aktivitet sammenligning i hanner og hunner i de sunde og andre kræft grupper. Data fra alle fag i hvert sæt af undersøgelser præsenteres også.

Forskellene i PLA

2 aktiviteter mellem kønnene ikke nåede statistisk signifikans i kontrol eller kræft grupper i enten sæt undersøgelser (fig. 5A og 5B). Ligeledes var der ingen forskel eller sammenhæng i PLA

2 aktiviteter i forsøgspersoner med BMI 25 vs. BMI ≥ 25 grupper i CRC undersøgelsen (. Figur 6A og 6B), selv om den gennemsnitlige BMI i CRC og pc-grupper var betydeligt mindre end i kontrolgrupper (tabel 4 og 5)

udsat i sunde og CRC grupper blev opdelt i to grupper:. BMI 18,5 til 25 (for alle fag, n = 43) og BMI 25 (For alle fag, n = 80). A. udsat hos raske og andre kræft grupper blev opdelt i to grupper: BMI≤25 (For alle fag, n = 80) og BMI 25 (For alle fag, n = 148)

Alder er en af ​​de mest klart identificerede risikofaktorer for at udvikle CRC og andre kræftformer. The American Cancer Society og amerikanske Forebyggende Services Task Force anbefaler, at folk får koloskopi screeninger hvert 10. år begynder i en alder af 50. Vi analyserede derfor alder virkninger på PLA

2 aktiviteter ved at opdele emnerne i to grupper (alder 50 år, n = 37 og ≥ 50 år, n = 78). Selv om der var en tendens til øget PLA

2 aktiviteter i ≥ 50 år gamle gruppe i CRC-gruppen, var forskellene ikke statistisk signifikant (fig. 7A). Tilsvarende blev påvist nogen forskel mellem de to aldersgrupper i LC, BC, og PC sæt, selv når alle de emner (herunder raske kontrolpersoner) blev kombineret, var der betydelige stigninger i PLA

2 aktiverer i de ældre forsøgspersoner ( . figur 7B)

deltagerne i sunde og CRC grupper blev opdelt i to grupper:. alder 50 (For alle fag, n = 42) og alder ≥50 (For alle fag, n = 153). Student t-test blev udført for at analysere forskellene mellem disse to grupper. A. Deltagerne i sunde og andre kræft grupper blev opdelt i to grupper: alder 50 (For alle fag, n = 61) og alder ≥50 (For alle fag, n = 144). Student t-test blev udført for at analysere forskellene mellem disse to grupper. *** P. 0,001

En direkte sammenligning af de to sæt raske kontrolpersoner viste, at selv om deres køn, alder, passiv rygning, og alkoholforbrug var anderledes, var der ingen forskel i enhver PLA

2-aktivitet målt (tabel 6). Denne yderligere understøtter, at plasma PLA

2 aktiviteter påvirkes ikke signifikant af alder, køn, alkoholforbrug, og /eller rygning.

Klassificeringen ydeevne af plasma PLA

2 aktiviteter

Logistisk regression blev anvendt til at evaluere klassificering ydeevne PLA

2 aktiviteter i cancere. Alle fire PLA

2 målinger blev holdt som prædiktorer uanset deres betydning. De klassificering forestillinger blev opsummeret af modtager opererer karakteristiske (ROC) kurver (fig. 8). Prediction formler blev genereret ved hjælp af parameterestimaterne.

CRC tilfælde vs. raske forsøgspersoner. A. Alle kræftformer vs. raske forsøgspersoner i 2. sæt. B. Lungekræft vs. raske forsøgspersoner. C. Blærekræft vs. raske forsøgspersoner. D. Kræft i bugspytkirtlen vs. raske forsøgspersoner. . E. Alle kræftformer vs alle raske personer med kombineret to sæt

forudsigelse formel til at adskille CRC sager fra raske forsøgspersoner er: hvor “

P

CRC” stande for sandsynligheden for at have CRC. ROC-kurven er vist i fig. 8A har et areal under kurven (AUC) = 0,7502.

Da eksterne valideringer ville kræve en uafhængig undersøgelse, vi i stedet vedtaget interne metoder til at validere klassificering forestillinger. Blandt forskellige interne valideringsmetoder, har det vist sig, at bootstrap overgår lommekniv, cross-validering og data-delingsmetoder [19]. Derfor bootstrap blev vedtaget for validering. Især blev forudsigelse formel opnået ved at tilpasse den samme model for hver bootstrapped prøve. Formlen blev anvendt på de oprindelige data til beregning af forudsigelse sandsynligheder. Ydelsen for denne særlige bootstrap prøve blev opsummeret af AUC for ROC-kurven. Det samlede resultat blev evalueret ved at opsummere AUC tværs 1.000 bootstrapped prøver. I 95% af de 1000 bootstrapped prøver, AUC er højere end 0,7143 for CRC vs. sundt. Derfor er disse resultater internt bekræfter klassificeringskriterierne præstationer af de modeller, der er udviklet ovenfor.

forudsigelse formel og ROC-kurven til at adskille alle kræfttilfælde fra raske personer i det andet sæt af undersøgelsen er som følger og vist i fig. 8B, med et AUC = 0.8337.This præstation blev valideret i 1000 bootstrapped prøver. I 95% af de 1000 bootstrapped prøver, AUC er højere end 0,8205 for LC, PC, BC kombineret vs det andet sæt af raske kontrolpersoner.

De forudsigelse formler og ROC kurver for den separate LC, BC, og pc-sager fra raske personer i det andet sæt af undersøgelsen er angivet nedenfor og fig. 8C til 8E, med AUC 0,811, hvilket indikerer god klassificering opførelser af testene. For LC versus raske kontrol, AUC = 0,8119 (fig. 8C). I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0.7923.For BC versus raske kontrol, AUC = 0,8624 (fig. 8D). I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0.8161.For PC versus raske kontrol, AUC = 0,8671. I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0,8426.

Endelig da vi har fundet, at PLA

2 aktiviteter blev væsentlige ingen forskel i de to sæt raske kontrolpersoner, vi kombineret alle raske kontrolpersoner og alle kræfttilfælde i begge sæt af undersøgelser og genererede et kombineret formel, med et AUC = 0,8011 (fig. 8F). I 95% af de 1000 bootstrapped prøver, AUC er højere end 0.7907.The følsomheder og særlige kan fås fra ROC kurver vist i fig. 8. Ved CRC sæt undersøgelsen, 60,5% følsomhed og 77,9% af specificitet blev opnået (tabel 7). For 2

nd sæt af studier og data kombineret for begge sæt, følsomheder 80% og de særlige . 66% blev opnået for alle tilfælde (tabel 7)

Den potentielle bidrag fra andre faktorer

Selv om de fleste andre demografiske og /eller miljømæssige testede faktorer ikke var signifikant forskellig i kræft og kontrolgrupper (fig 3-7), testede vi deres potentielle bidrag til ydeevne, når de vurderes på individuelle niveauer. Vi holdt alle fire PLA

2 målinger i modellerne, men lad andre prædiktorer underlagt modellere markeringer på betydeligt niveau 0,05.

forudsigelse formel og ROC-kurven til at adskille CRC fra raske forsøgspersoner i det første sæt af undersøgelsen er følgende og vist i fig. 9A, med et AUC = 0,8162. I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0.7589.The forudsigelse formel og ROC-kurven til at adskille alle kræfttilfælde fra raske personer i det andet sæt af undersøgelsen er som følger, og vist i fig. 9B, med et AUC = 0.9728.This præstation blev valideret i 1000 bootstrapped prøver. I 95% af de 1000 bootstrapped prøver, AUC er højere end 0,9625 for LC, PC, og BC kombineret vs det andet sæt af raske kontrolpersoner.

CRC sager vs raske forsøgspersoner. A. Alle kræfttilfælde vs. raske forsøgspersoner i det andet sæt. B. Lungekræft vs. raske forsøgspersoner. C. Blærekræft vs. raske forsøgspersoner. D. Kræft i bugspytkirtlen vs. raske forsøgspersoner. E. Alle kræftformer vs alle raske personer med kombineret to sæt.

De forudsigelse formler og ROC kurver for den separate LC, BC, og pc-sager fra raske forsøgspersoner i det andet sæt af undersøgelsen er nedenfor og fig. 9C til 9E, med AUC 0,968, hvilket indikerer høje følsomheder og specificerer for testene. For LC versus raske kontrol, AUC = 0,9742. I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0.9598.For BC versus raske kontrol, AUC = 0,9682. I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0.9398.For PC versus raske kontrol, AUC = 0,9907. I 95% af de 1000 bootstrapped prøven, AUC er højere end 0,9740.

Endelig da vi fandt, at PLA

2 aktiviteter blev væsentlige ingen forskel i de to sæt raske kontrolpersoner, vi kombineret alle sunde kontroller og alle kræfttilfælde i begge sæt af undersøgelser og genererede et kombineret formel, med et AUC = 0,9140 (fig. 9F). I 95% af de 1000 bootstrapped prøver, AUC er højere end 0.9018.The følsomheder og særlige opnået med disse ROC kurver med yderligere parametre forøget til 85% (med undtagelse af CRC vs. sunde sager, tabel 7).

diskussion

I dette arbejde har vi præsenteret de første målinger af plasma naturlig og undertype PLA

2 aktiviteter og deres præstationer som potentielle markører for fire forskellige kræftformer, CRC, LC, BC, og PC. Vi har målt de PLA

2 aktiviteter i mere end 20 blodprøver med eller uden tilsætning af 1,2 mM calcium (naturlig koncentration af ioniseret calcium i blodet) til de endelige assay blandinger og ikke afsløre eventuelle signifikante forskelle. Derfor definerer vi de PLA

2 aktiviteter opnået uden tilsætningsstoffer som “naturlige” PLA

2 aktivitet. Vi har udvalgt optimale betingelser for at måle hver sub-familie af PLA

2 aktiviteter. Disse ændrede betingelser ikke eksistere i blodet. Derfor er det ikke overraskende, at summen af ​​de underfamilie- PLA

2 aktiviteter er større end den “naturlige” PLA

2 aktivitet. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at selv om modificerede betingelser blev anvendt til at opnå de aktiviteter, for underfamilier af PLA

2s, de endelige resultater er fra de naturlige PLA

2s stede i blodprøver.

mens fordelene ved at anvende bekvemme serologiske markører er indlysende, ingen pålidelige blod markører for nogen af ​​disse kræftformer er i øjeblikket tilgængelige. For CRC, udvikling /validering af ikke-invasive eller minimalt invasive påvisningsmetoder er stor fokus på området. Nuværende metoder omfatter afføring og blodprøver, såsom fækal immunkemiske test (anfald) og guaiac-baserede fækal okkult blod test (fik). Selvom specificiteten er høj ( 85%), disse tests har en lav følsomhed ( 23%) for kolorektale adenomer og er således usandsynligt, at være i stand til at øge tidlig påvisning af CRC [20], [21]. Genetiske afføring test afslører mutationer i afføring, der kan findes i CRC.