PLoS ONE: Label-Free Imaging af basalmembraner differentierer Normal, forstadier og Kræft colonvæv ved Second-Harmonic Generation Microscopy

Abstrakt

Da ændringer i kælderen membraner er kritiske indikatorer for at differentiere normal, præcancer , og kræft colon væv, direkte visualisering af disse advarselstegn er afgørende for tidlig diagnosticering og behandling af colon cancer. Her præsenterer vi, at anden harmoniske generation (SHG) mikroskopi kan sonde ændringerne i kælderen membraner i forskellige colon stadier kræft. Vores resultater viser også mulighed for at bruge de kvantitative analyser af billeder til kvantificering disse ændringer i forskellige kræft stadier. Disse resultater antyder, at SHG mikroskopi har potentiale i mærkaten frit billeddannelse ændringerne i basalmembraner for effektivt at skelne mellem normale, præcancerøse og cancerøse colonvæv. Til vores viden, er dette den første demonstration af dynamikken i kælderen membran ændringer i forskellige colon stadier kræft ved hjælp af helt iboende kilde til kontrast

Henvisning:. Zhuo S, Yan J, Chen G, Shi H, Zhu X , Lu J, et al. (2012) Label-Free Imaging af basalmembraner differentierer Normal, forstadier og Kræft colonvæv af Second-Harmonic Generation Microscopy. PLoS ONE 7 (6): e38655. doi: 10,1371 /journal.pone.0038655

Redaktør: Mitsunobu R. Kano, University of Tokyo, Japan

Modtaget: Januar 13, 2012; Accepteret: 8. maj 2012; Udgivet: Juni 8, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhuo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet blev støttet af Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (Grant nr IRT1115), National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 60.908.043, 30.970.783, 81.101.209), og Natural Science Foundation i Fujian-provinsen (Grant Nos . 2011J01341, 2010J01136, 2010J01321). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

coloncancer er en af ​​de hyppigste årsager til sygelighed og dødelighed i human [1]. Generelt er det let behandles, hvis diagnosticeret i en af ​​de præ-invasive stadier [2], [3]. Imidlertid er påvisning af tidlige læsioner er stadig en udfordring. Med colon cancerudvikling, maligne celler ændre basalmembraner (grænseflader i krypt og lamina propria), såsom variationer i basalmembran størrelse og tæthed, tab af basalmembran [4], [5]. Ændringer i basalmembranen er blandt de vigtigste indikatorer for colon udvikling af kræft [5], [6]. Imidlertid har disse advarselstegn hidtil kun været påviseligt ved histologisk undersøgelse af biopsi prøver [4], [7]. Derfor er udviklingen af ​​nye og ikke-invasiv

in situ

afbildningsmodalitet for disse advarselstegn probing er af stor medicinsk betydning.

tyktarmsslimhinde indeholder krypten, basalmembranen og lamina propria, som vist i fig. 1. Det ses også i figur 1, at

en face

sektion af colon mucosa samtidigt kan observere krypten, basalmembranen og lamina propria. Da krypten består hovedsageligt af søjleformede epitelceller og slimceller, der ikke er effektive til frembringelse af anden harmoniske generation (SHG) signaler og lamina propria er sammensat primært af kollagen, der er i stand til at udsende stærke SHG signaler [8] – [10], SHG mikroskopi kan være nyttige til at probe ændringerne i basalmembranen, som ikke er tilgængelige for andre billeddannende modaliteter. SHG mikroskopi er en ikke-lineær optisk teknik og har fordelene ved at være label-fri, iboende tredimensionelt opløsning, nær-infrarød excitation for overlegen optisk penetration, lavere lysbeskadigelse, og kan levere kvantitative oplysninger [11] – [15]. Indtil nu er der ingen rapporter at teste potentialet i denne teknik til etiket-frit visualisere kælderen membraner som indikatorer for at differentiere normal, præcancerøse, og kræft colon væv, og det er det motiveret os til at udføre dette arbejde med denne teknik.

Resultater

Patologi Resultater

af de 72 colon biopsiprøver afbildet, 20 blev diagnosticeret som normal, 28 med adenom, og 24 med adenocarcinom. Til statistisk analyse blev vævsprøver opdelt i normale tilfælde (n = 20), præcancer (adenom, n = 28) og cancer (adenocarcinom, n = 24).

SHG Images of

for at undersøge ændringerne i kælderen membraner i forskellige colon stadier kræft, er repræsentanten da ansigt SHG billeder fra normal, præcancerøse, og kræft colon væv henholdsvis vist i fig. 2. Som forventet kan SHG imaging teknik godt visualisere omridset af basalmembraner (røde cirkler). Det ses i fig. 2, at store morfologiske forskelle i omridset af kælderen membraner observeres i forskellige colon stadier kræft. I normale tilfælde observeres et honeycomb arrangement af rund form regelmæssige basalmembraner med ensartet størrelse. I præcancer, er de rørformede-formede basalmembraner med større størrelse og en lavere befolkningstæthed opnået i sammenligning med normale tilfælde. Ved cancer er de basalmembraner fundet i normale tilfælde mangler.

kvantitativ analyse af basalmembraner

Tabel 1 viser middelværdien og SD af cirklen længde basalmembran og befolkningen tæthed af basalmembraner for normale, præcancerøse og cancerøse colonvæv. I detaljer cirklen længden af ​​basalmembranen i normal er 342,7 ± 27,2 um (n = 60 områder i 20 biopsier), i præcancer er 695,8 ± 79,1 um (n = 84 områder i 28 biopsier), og i cancer er 1767,8 ± 166,3 um (n = 72 områder på 24 biopsier). Hertil kommer, at befolkningstætheden i kælderen membraner i normal er 103,2 ± 10,6 /mm

2 (n = 60 områder på 20 biopsier), i præcancer er 27,1 ± 6,3 /mm

2 (n = 84 områder af 28 biopsier), og i kræft er 0,3 ± 1,2 /mm

2 (n = 72 områder på 24 biopsier). Disse resultater præsentere cirkel længde basalmembran og befolkningstætheden i kælderen membraner variabler, der viste signifikante forskelle (

P

0,05) mellem den normale, præcancerøse, og kræft væv kategorier baseret på unparired Wilcoxon rank sum test .

diskussion

Dette arbejde præsenterer, at SHG mikroskopi effektivt kan undersøge ændringerne i kælderen membraner i forskellige colon stadier kræft. Især SHG mikroskopi muliggør identifikation af to morfologiske funktioner (cirklen længde basalmembran, befolkningstætheden i kælderen membraner), der viser betydelige forskelle i forskellige colon stadier kræft. Disse observationer er består med immunhistokemiske resultater (vist i fig. 3), og bekræfter også det faktum, [4], [16], at før kræft bliver invasiv handelsled, som er kendt som præcancer, maligne celler ændre omridset af basalmembranen, men gør ikke tilintetgøre basalmembranen; som kræft bliver invasive, maligne celler (ingen SHG signaler) erstatte kollagenfibre, hvilket fører til tab af basalmembranen.

Som bemærket, SHG mikroskopi kan etiket-frit billeddannelse ændringerne i basalmembraner i forskellige colon cancer faser og som sådan kan fungere som en

in situ

histologisk værktøj, der er fri for kravet om traditionelle fremgangsmåder mærkning. Desuden er baseret på billedet analyser, var vi i stand til at opnå nogle kvantitative oplysninger i forskellige kræft stadier. Således SHG mikroskopi giver os både en morfologisk, samt kvantitativ, middel til at undersøge ændringerne i kælderen membraner i forskellige colon stadier kræft. Den vigtigste af denne evne skyldes, at de ændringer af basalmembran spille en vigtig rolle i coloncancer udvikling [5], [6], og disse ændringer har hidtil kun været påviselige ved histologisk undersøgelse af biopsiprøver [4], [7]. SHG mikroskopi gør det muligt at observere disse variationer, og måle dem muliggør basalmembranen størrelse og befolkningstæthed, der skal fastlægges. Disse resultater indikerer løftet om SHG billeddannelse til klinikker, og som et biomedicinsk forskning værktøj til at studere dynamikken i basalmembranen ændringer i forskellige colonic faser cancer. Endvidere skal det bemærkes, at selvom de inflammatoriske læsioner blev ikke behandlet i dette arbejde, bør SHG billeddannelse kunne skelne mellem kræft og inflammatoriske læsioner på grund af tabet af basalmembraner i cancervæv. I den forbindelse ser man, at SHG mikroskopi har potentiale i mærkaten frit visualisere ændringerne i basalmembraner som indikatorer til differentiering normale, præcancerøse og cancerøse colonvæv.

Afslutningsvis dette arbejde viser potentialet af SHG mikroskopi til at mærke-frit billede ændringerne i kælderen membraner, herunder basalmembranen størrelse og befolkningstæthed, de vigtige indikatorer for colon udvikling kræft. Så vidt vi ved, er dette den første gang at vise, hvordan SHG billeddannelse kan anvendes til kvantitativt visualisere dynamikken i basalmembran ændringer i forskellige colon faser cancer. I det fremtidige arbejde, vil en storstilet undersøgelse udføres for at bestemme følsomhed, specificitet, negativ prædiktiv værdi, positiv prædiktiv værdi med hensyn til traditionel histologisk analyse. Fordelen ved denne teknik i forhold til konventionelle diagnostiske procedurer er, at væv ikke er forpligtet til at gennemgå udskæring, paraffin indlejring, eller fryse-tø proces, bevarer derfor potentialet i

in vivo

billeddannelse. Med evnen til at kvantificere basalmembranen ændringer, som vist i denne undersøgelse, det kan forudses, at en SHG-baserede endoskopi [17] – [19] kunne lette og gavne

in vivo

undersøgelser og diagnose i årene at komme.

Materialer og metoder

vævsprøve

i alt 72 friske colon biopsi prøver blev opnået fra toogtredive patienter gennemgik endoskopisk biopsi. Forud for at studere deltagelse, alle patienter underskrev et informeret samtykke, og denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Fujian Provincial Tumor Hospital. Den biopsi prøve blev placeret i Glass Bottom Dish (Mattek, dækglas: 0,085-0,13 mm) for SHG billeddannelse. I dette arbejde blev det prøvepræparation og SHG scanning afsluttet inden for 1 time efter endoskopisk biopsi.

Imaging Instrumentation

SHG mikroskopi blev opnået under anvendelse af en ulineær optisk system, som tidligere er blevet beskrevet [20] . Kort fortalt blev SHG billeder erhvervet ved anvendelse af en kommerciel laserscanning mikroskopisk afbildningssystem (Zeiss LSM 510 META, Jena, Tyskland) koblet til en femtosekund Ti: safir-laser (Coherent Mira 900-F), der opererer ved 800 nm. Polarisationsretningen af ​​laserlyset er den vandrette polarisation. En fordybelse olie mål (× 63 og NA = 1,4) blev anvendt til at fokusere excitationsstrålen i vævsprøver (gennemsnitlig effekt mindre end 15 mW) og blev også brugt til at indsamle de tilbagespredte iboende SHG signaler. Billederne blev opnået ved 2,56 mikrosekunder per pixel. En fin fokus etape (HRZ 200 trin, Carl Zeiss) bruges til at oversætte prøverne efter xy scanning af prøverne for at opnå en stor område billede, og for at ændre fokus position til optagelse forskellige optiske dele.

Histologi Analyse

efter SHG billedbehandling, vævsprøverne blev fikseret i 10% formalin og forberedt til patologisk undersøgelse ved hjælp af standard-protokoller. H & E-farvede sektioner og sektioner farvet af primære antistoffer til kollagen IV blev opnået fra hver prøve, og gennemgået af en certificeret patolog

Kvantificering af Basement Membraner

For yderligere at kvantificere ændringer i. basalmembraner i forskellige colon stadier kræft, tre 415 um med 490 um rektangulære områder i hvert biopsi blev udvalgt til kvantitativ analyse. I dette arbejde blev der to analyser udført. Først målte vi cirklen længde basalmembran. Desuden bedre at skildre denne værdi, hvis der er et tab af basalmembraner, cirklen længden af ​​basalmembran blev sat til cirklen længden på det valgte rektangulært tværsnit. For det andet, vi beregnet det samlede antal basalmembraner per arealenhed, dvs. befolkningstætheden i kælderen membraner. I dette arbejde blev hver kvantitativ analyse udført på alle de undersøgte biopsier.

Statistiske Analyser

Kvantitative data blev sammenfattet med middelværdi og standardafvigelse (SD), der vises som “middel ± SD” . Sammenfattende statistikker for cirklen længde basalmembran og befolkningstætheden i kælderen membraner (relateret til patologisk bestemmelse) skyldes flere sektioner fra hver af de 72 colon biopsi udtaget fra toogtredive patienter. med henblik på statistisk analyse, den målinger fra enkelte afsnit antages at udgøre uafhængige observationer. med data i denne undersøgelse (karakteriseret ved tilsyneladende homogenitet af værdier inden de diagnostiske kategorier), blev mere komplekse statistiske teknikker anses unødvendig, da de ikke ville ændre prøven midler, de ville heller ikke føre til større prøve standardafvigelser. i dette arbejde blev Wilcoxon rank-sum test udført at afgøre, om der er væsentlige forskelle i cirklen længde basalmembran og befolkningstætheden i kælderen membraner mellem normal, præcancerøse og ondartede væv (uparret sammenligning ). Parametriske Wilcoxon test blev valgt til uparrede sammenligning på grund af den lille stikprøve. Præcis

P

-værdier blev beregnet, og forskelle blev anset for at være statistisk signifikant, når de

P

-værdier var mindre end 0,05.

Tak

forfatterne vil gerne takke redaktør og to anonyme anmeldere for deres konstruktive kommentarer, som var meget nyttigt for at styrke præsentationen af ​​dette papir.