PLoS ONE: FOXM1 modulerer Cisplatin Følsomhed ved Regulering EXO1 i æggestokkene Cancer

Abstrakt

Cisplatin er almindeligt anvendt i æggestokkræft kemoterapi dog kemoresistens til cisplatin er fortsat en stor klinisk udfordring. Onkogen transkriptionel faktor FOXM1 er blevet rapporteret at være overudtrykt i ovariecancer. I denne undersøgelse, vi havde til formål at undersøge den potentielle rolle FOXM1 i ovariecancer med kemoresistens til cisplatin. Vores resultater viser, at FOXM1 er opreguleret i kemoterapi ovariecancer prøver, og forsvarer ovariecancerceller mod cytotoksicitet af cisplatin. FOXM1 letter DNA-reparation gennem regulering direkte transkriptionel mål EXO1 at beskytte ovariecancerceller fra cisplatin-medieret apoptose. Formildende FOXM1 og EXO1 udtryk af små interfererende RNA, forøger kemoterapi effekt mod kræft i æggestokkene. Vores resultater viser, at målrette FOXM1 og sit mål gen EXO1 kunne forbedre cisplatin effekt i kræft i æggestokkene, der bekræfter deres rolle i modulerende cisplatin følsomhed

Henvisning:. Zhou J, Wang Y, Wang Y, Yin X, han Y, Chen L et al. (2014) FOXM1 modulerer Cisplatin Følsomhed ved Regulering EXO1 i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10,1371 /journal.pone.0096989

Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center på San Antonio, USA

Modtaget 31. oktober, 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: 13. maj 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. I udrette af dette manuskript, har forfatterne fået støtte fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81272882,81302275, 81.072.137) og Shanghai Udvalg for Videnskab og Teknologi (Grant nr 12411950200). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske malignitet i verden, med 225,500 nye tilfælde og 140,200 dødsfald anslået for 2008 [1]. De fleste kvinder med epitelial ovariecancer (EOC) til stede med fremskreden sygdom (fase III eller IV) på tidspunktet for diagnosen. Aktuel standard behandling af kræft i æggestokkene, i både tidlige og fremskredne stadier, består af komplet cytoreduktive kirurgi efterfulgt af kemoterapi, normalt baseret på en platin og taxan dublet [2]. Men udviklingen af ​​kemoresistens stadig udgør en stor hindring for en vellykket behandling. De fleste patienter bukke under for kemoresistens og tilbagefald, og den samlede 5-års overlevelse er ca. 31% [3]. En bedre forståelse af det molekylære grundlag for cisplatin modstand kan føre til nye antitumor strategier, der vil bevidstgøre reagerer ovariecancer til cisplatin kemoterapi.

pattedyrtranskriptionsfaktor Forkhead Box M1 (FOXM1) tilhører en stor familie af Forkhead transkriptionsfaktorer. Forkhead familiemedlemmer er involveret i en lang række biologiske processer, herunder embryogenese, proliferation, differentiering, apoptose, transformation, tumorgenese, levetid, og metabolisk homeostase [4]. I modsætning til de øvrige FOX-transkriptionsfaktorer, er FOXM1 associeret med celledeling og er overudtrykt i kræft. F.eks genekspressionsprofiler i carcinomer, herunder prostata, bryst, lunge, ovarie, kolon, pankreas, mave, blære, ovarie, lever og nyre, afslørede, at FOXM1 overudtrykkes i alle carcinomer [5] – [9]. Overekspression af FOXM1 i forskellige tumorer viser en kraftig afhængighed af tumorcellerne på FOXM1 [10]. Desuden i kræft i æggestokkene, viste den integrerede vej analyse, FOXM1 transkriptionsfaktor netværket ændres væsentligt i 87% af høj kvalitet serøs ovariecancer [11]. FOXM1 fremmer celledeling, migration og invasion i ovariecancer [12]. FOXM1 er også blevet påvist at spille en afgørende rolle i drug reaktionsevne og modstand. For eksempel er det blevet vist, at dereguleret FOXM1 ekspression kan bibringe resistens over for kemoterapeutiske lægemidler, såsom cisplatin og epirubicin [13], og beskytter kræftceller mod DNA-beskadigelse induceret celledød i brystcancer [14]. Det er dog fortsat undvigende, om FOXM1 spille en lignende rolle ansvarlig for overdragelse cisplatin-resistens i ovariecancer.

EXO1 er et protein med 5 ’til 3′ exonucleaseaktivitet og en RNase H-aktivitet, som interagerer med MSH2 og som er involveret i mismatch reparation og rekombination [15], [16]. Seneste undersøgelse viser, at EXO1 bidrager til induktion af DNA-skader checkpoints og deltager i DNA-skader reparation [17], [18].

I den foreliggende undersøgelse, vi giver de beviser, FOXM1 og dens direkte nedstrøms DNA-reparation gen EXO1 kan spille i at øge overlevelsen af ​​kræft i æggestokkene celler efter cisplatin behandling, og målretning FOXM1 /EXO1 akse kan bevidstgøre æggestokkræft celle til cisplatin behandling.

Materialer og metoder

Etik Statement

de protokoller for håndtering paraffinindstøbte ovariecancer prøver og analysere patientdata blev godkendt af de etiske udvalg Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Skriftligt informeret samtykke blev underskrevet af hver tilmeldt patient, hvis hun stadig var i live eller ved hendes første grads slægtning, hvis hun er død. Alle vævsprøver blev registreret af en sag nummer i databasen uden patientens navne eller personlige oplysninger, der er angivet.

Immunhistokemi

De paraffinindstøbte vævsprøver blev indsamlet fra 20 kvinder med primær epitelial ovariekræft , stagesIIto IV, der havde gennemgået indledende kirurgi ved afdelingen for obstetrik og gynækologi, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University mellem 2005-2008. Objektglassene blev deparaffineret, rehydreret og anbragt i citronsyre-buffer (pH 6,0, 0,1 M) til opvarmning i 10 min. Den endogene peroxidase aktivitet blev derefter blokeret ved inkubering med 3% H

2O

2 i 10 min. Bagefter blev snit inkuberet med blokeringsbuffer (Beyotime, Kina) i 1 time og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med FOXM1 antistof (1:50, Santa Cruz). Efter en 10-minutters inkubation af biotinyleret andet antistof, blev objektglassene igen inkuberet med streptavidin-peroxidase under de samme betingelser. Immunreaktionen blev derefter visualiseret ved inkubation med diaminobenzidin chromogen (DAB, Maixin-Bio, Kina) i 5 minutter. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin, dehydreret, klaret og monteret. Negative kontroller blev inkuberet i blokeringsbuffer alene. Disse resultater blev kun overvejes, hvis disse kontrolprøver viste en negativ farvning.

cellelinjer og Kultur

De humane ovariecancer cellelinjer A2780 og SKOV3 blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Begge cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 (Hyclone, USA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 g /ml streptomycin og cellerne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 /95% luft.

siRNA og plasmid transfektion og co-transfektion

siRNA-duplexer blev udarbejdet af RiboBio (Guangzhou, Kina). SiRNA Sekvensen af ​​siRNA’er var som følger: FOXM1 siRNA-1: 5′- GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 ‘, siRNA-2: 5′- GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3′ [19]. EXO1 siRNA-1: 5’-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 ‘, siRNA-2: 5′-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3′ [18]. Sekvensen af ​​den negative kontrol (NC) var: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. Transfektion eller co-transfektion af siRNA og plasmid blev udført ifølge fabrikantens protokol af lipofectamin (Invitrogen).

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen), og cDNA blev syntetiseret ved anvendelse PrimerScript RT reagens Kit (Takara). For real-time kvantitativ PCR, blev samme mængde cDNA tilsat til SYBR premix EX Taq II (Takara) og køre i Stepone realtids-PCR-system (Applied Biosystem). Cyklusprogrammet var 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer, og β-actin blev anvendt som en endogen kontrol. De fremadrettede og reverse primere var som følger: FOXM1: 5’GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 ‘og 5’GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3’, EXO1: 5’CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 ‘og 5’AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3’. PLK4: 5’AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 ‘og 5’GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3’. XRCC1: 5′- CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 ‘og 5’CCTCCTTCACACGGAACTGG-3’. BRCA2: 5′- TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 ‘og 5’AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3’. RAD51: 5′- CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 ‘og 5’TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3’. β-actin:. 5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 ‘og 5’CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

klongenicitetsassayet

Efter transfektion af NC eller genspecifikke siRNA, celler blev underkastet den angivne koncentration af cisplatin i 1 time. Derefter blev cellerne resuspenderet i frisk komplet medium og udpladet i 6-brønds celledyrkningsplade med en densitet på 500 celler /brønd. Efter inkubering ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 /95% luft i 8-10 dage blev mediet skiftet hver 3. dag. Ved slutningen af ​​dyrkning blev cellerne farvet med 1% methylenblåt i 50% methanol i 20 min, vasket med vand, og kolonier (≥ 50 celler) blev talt.

Western blot-

celler blev lyseret i RIPA-puffer med tilskud af PMSF proteaseinhibitor, efterfulgt af centrifugering ved 14000 g i 10 min. Ved udgangen af ​​centrifugering blev cellelysater indsamlet og proteinkoncentration cellelysater blev målt. Lige så stor mængde af proteiner (10-20 ug) blev opløst ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Millipore). Blottene blev derefter inkuberet med primære antistoffer i 5% bovint serumalbumin /Tris-bufret saltvand Tween-20 ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. Protein- signaler blev detekteret ved Odessey scanner. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse omfattede: menneskelig FOXM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology), phospho-histon H2A.X (γH2AX, 1:1000, Cell Signaling Technology), caspase-3 (1:1000, Cell Signaling Technology) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-actin (1:2000, Abcam).

Cell levedygtighed assay

Cellernes levedygtighed blev målt ved Cell Counting Kit-8 assay ( Dojindo Molecular Technologies). Kort beskrevet blev celler udpladet ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd på plader med 96 brønde og udsat for forskellig behandling. Efter 48 timers inkubation ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2/95% luft blev prøverne inkuberet i yderligere 2 timer med CCK8 reagens. Absorbansen blev bestemt ved 450 nm under anvendelse FLx800 fluorescensmikropladelæser (Biotek).

γH2AX immunfluorescensfarvning

A2780 og SKOV3-celler blev transficeret med NC eller genspecifikke siRNA. Efter 48 timer blev cellerne derefter behandlet med den angivne koncentration af cisplatin i 1 time, og friske medier blev ændret. 24 timer senere blev cellerne underkastet anti-γH2AX (Ser139) farvning. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 10% formalin i 15 minutter, derefter permeabiliseret med 0,1% Triton-100 i 10% FCS i 10 minutter. Prøver blev blokeret med 5% gedeserum i 10% FCS i 1 time og derefter inkuberet natten over med det primære kanin anti-γH2AX (Ser139; 1:400; Cell Signaling). Efter vaske med PBS, sekundært gede-anti-kanin IgG-TRITC (1:400; Sigma-Aldrich) blev tilsat til prøverne i 1 time. Celler blev modfarvet med DAPI inden montering. Billeder blev taget med et laser konfokalt TCS SP5 (Leica). For foci kvantificering blev celler med mere end 10 foci talt som positive ifølge standardproceduren [20]. Forsøg blev gentaget tre gange.

Flowcytometri

Apoptose blev exmamined ved flowcytometrisk analyse af Annexin V og PI-farvning (BD) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, efter den angivne behandling blev cellerne resuspenderet ved en koncentration på 1 x 10

6 celler /ml, blev derefter 5 pi FITC annexin V og 5 pi PI tilsat til 1 × 10

5-celler (100 pi), og cellerne blev inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Efter inkubation blev cellerne analyseret ved flowcytometer FC500 /FC500-MPL (Beckman Coulter). For cellecyklusanalyse blev celler trypsinbehandlet, pelleteret og derefter resuspenderet i propidiumiodid-opløsning (50 ug /ml propidiumiodid, 0,1 mg /ml RNaseA, og 0,05% Triton-X). Alle reagenser blev købt hos Sigma. Efter 40 minutters inkubation blev celler analyseret ved FC500 /FC500-MPL.

blev udført chromatin immunpræcipitationsassay

chromatin immunopræcipitation (chip) eksperimenter som beskrevet tidligere [21]. 24 timer efter cisplatin behandling blev celler fikseret i 1% formaldehyd i 10 minutter for at tillade tværbinding og derefter standset med glycin. Celler blev opsamlet og lyseret i SDS lysis buffer. Lysatet blev sonikeret, præ-blokerede, inkuberet med antistoffer, og opsamlet med protein-A + G agarose /laksesperma DNA. DNA-protein-tværbindinger blev vendt, og kromatin DNA blev oprenset og underkastet PCR-analyse. Primerne 5′-AAA TCT GGC AAC FTT ACC TCA-3 ‘og 5′-TTA AGT GTG FTT GTC AGT TCC-3′ blev anvendt til at forstærke EXO1 FHRE1-holdige region (-1934 /-1575), og primere 5’-CAA TTT CGA TTT GTA GAG GCA AC-3 ‘og 5′-CGG CTT CCA ACT CAT AGG GT-3’ blev anvendt til at opformere FHRE2-holdige region (-459 /-74). Efter amplifikation blev PCR produkter løst på agarosegel visualiseret ved GelRed (Biotium).

Promoter reportere og luciferaseassays

EXO1 promotorregionen blev PCR-amplificeret fra genomisk DNA ekstraheret fra A2780-celler under anvendelse af forward og reverse primere indeholder NheI og HindIII restriktionssites (5′-CTA GCT AGC AGG ACC AAA GAG CCA TCA CA-3 ‘og 5′-CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3′). Efter restriktionsfordøjelse blev fragmentet klonet i PGL-3 grundlæggende reportergen vektor til genereret EXO1 promotorkonstruktionen, pGL3-FHER2 promotor konstruere -490 /-148 blev klonet ved PCR (primere: 5’- CTA GCT AGC AAA GAA CCC AGC GTG AAC TGA-3 ‘, 5’CCC AAG CTT CAC GGG TAA CTT GCC TAC ACA 3’). Formodede Forkhead websted mutagenese blev udført under anvendelse af et site-directed mutagenese kittet (ExCell Biology). pGL3-Basic, pGL3-EXO1, vildtype pGL3-FHRE2, vildtype pGL3-FHRE2 plus FOXM1 siRNA, og mutant pGL3-FHRE2 blev transficeret til celler hhv. Transficerede celler blev behandlet med cisplatin i 24 timer og deres luciferaseaktiviteter blev målt ved luciferase-assay-systemet (Promega).

Statistisk analyse

Vi bruges SPSS19.0 software til at beregne standardafvigelser og statistisk signifikant forskelle mellem prøver. Stjernerne i hver graf indikerer statistisk signifikante ændringer, med

P

beregnede værdier Student

t

test som følger: *,

P

0,05; **,

P

≤0.01; ***,

P

≤0.001.

P

værdier af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

1.. FOXM1 udtryk var opreguleret i cisplatin resistente ovariecancer væv og celler

Tidligere er det blevet påvist, at FOXM1 er overudtrykt i æggestokkræft, og at FOXM1 overekspression var signifikant korreleret med høj kvalitet ovariecancer, hvilket indikerer, at FOXM1 kan spille en onkogen rolle i ovariecancer [12]. Hidtil har den rolle, FOXM1 i cisplatin modstand af ovariecancer ikke blevet belyst. For at undersøge ekspressionen af ​​FOXM1 i cisplatin følsomme eller resistente ovariecancer, blev ovariecancer vævsprøver opnået fra 10 kvinder med tilbagevendende epitelial ovariecancer i 6 måneder efter standardbehandling, og andre 10 kvinder, som var chemosensitive. Alle patienter fik optimal cytoreduktive kirurgi efterfulgt af 6 serier af systemisk kemoterapi med kombinationen af ​​cisplatin og paclitaxel. Blandt de 10 chemosensitive patienter, 7 af dem gentog sig efter 12 måneder, og 3 af dem ikke gentage sig hidtil. Alle dias var fra kræft i æggestokkene væv resektion i den indledende drift. De paraffinindlejrede slides blev immunhistokemisk farvet med FOXM1 antistof og repræsentative farvede objektglas blev vist i figur 1A og figur 1B. Moderat til høj FOXM1 udtryk blev påvist i så meget som 8 af 10 resistente tilfælde, men kun i 4 af 10 følsomme sager (Fig.1C). Næste sammenlignede vi cisplatin modstand og FOXM1 ekspression i tre cellelinier. SKOV3, som viste højeste udtryk for FOXM1, var også den mest modstandsdygtige over for cisplatin, mens ES2, som var den mest følsomme over for cisplatin, udtrykte FOXM1 på det laveste niveau (Fig.1D). Disse resultater indikerer, at cisplatin resistente ovariecancer udviser højere FOXM1 ekspression sammenlignet med cisplatin følsomme ovariecancer.

(A) repræsentant FOXM1 immunfarvet snit er vist fra chemosensitive patientgruppe, (B) repræsentant FOXM1 immunfarvet snit er vist fra kemoterapi patientgruppe. (C) Antallet af tilfælde med det angivne niveau af FOXM1 udtryk i chemosensitive og kemoterapi gruppe vises. (D) IC

50 værdier af forskellige cellelinjer blev vist i det øverste panel, og udtryk for FOXM1 i celle linjer blev vist i det nederste panel.

2. FOXM1 er opreguleret i æggestokkene cancerceller efter cisplatin behandling

For yderligere at bestemme udtryk mønster af FOXM1 i æggestokkene kræftceller, vi behandlede A2780 og SKOV3 med forskellige koncentrationer af cisplatin, og opdagede mRNA niveau af FOXM1 øget kun lidt efter cisplatin behandling (2A). Vi fandt imidlertid, at FOXM1 protein bemærkelsesværdigt forøget i en koncentration og tid afhængig måde i begge cellelinier, og svarede til niveauet for γH2AX (Fig.2B og Fig.S1), som er guldstandarden af ​​DNA-skader kvantificering [22 ]. Vi udførte også ON /OFF behandling af cisplatin, blev forhøjet niveau af FOXM1 protein observeret i begge cellelinier ved 24 timer efter behandling, og virkningen opretholdes indtil 96 timer (2C). Da den øgede FOXM1 protein ikke svarer til det øgede niveau af FOXM1 mRNA, var det muligt at forhøjet FOXM1 protein i høj grad blev medieret af stabilisering protein [23].

(A) A2780 og SKOV3 celler blev behandlet med den angivne koncentration af cisplatin i 24 timer. Efter behandling blev FOXM1 mRNA-transkription niveauer bestemt ved real-time PCR og p-actin blev anvendt som en endogen kontrol. Hver søjle og søjle repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. (B) Cellelysater fremstilledes efter den samme behandling som i (A), opløst ved SDS-PAGE og underkastet immunoblotting-analyse under anvendelse af anti-FOXM1, anti-γH2AX, eller anti-β-actin henholdsvis. (C) A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med 2 ug /ml og 4 ug /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis derefter blev dyrket i frisk komplet medium i angivne tidspunkter (tiden komplet medium blev tilsat blev sat som 0 h) . Western blot blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​FOXM1 og β-actin.

3. Målretning FOXM1 øger cisplatin følsomhed i æggestokkræft

Da FOXM1 blev overudtrykt i æggestokkræft, og blev yderligere opreguleret som respons på cisplatin behandling, vi hypotese, at målrette FOXM1 kunne bevidstgøre æggestokkræft celle til cisplatin. Vi transient transficeret to siRNAs målrettet FOXM1 i A2780 og SKOV3, begge siRNA’er bemærkelsesværdigt reducerede FOXM1 ekspression og siRNA-2 har en større lyddæmpende effekt i de to cellelinier (Fig.3A og 3B). 48 timer efter siRNA-2 transfektion blev celler behandlet med den angivne koncentration af cisplatin. Klongenicitetsassayet blev udført ved 1 time efter cisplatin behandling, og cellulær levedygtighed blev målt ved anvendelse af et CCK8 assay ved 48 timer efter behandling med cisplatin. Som forventet FOXM1 siRNA transfektion i A2780 og SKOV3-celler gjort begge cellelinier mere følsomme over for cisplatin toksicitet, som det fremgår af en sammenligning af IC

50 værdier mellem scramble siRNA og FOXM1 siRNA-behandlede celler (~1.7 ug /ml vs ~ 4,1 ug /ml i A2780, ~2.5 ug /ml vs ~6.1 ug /ml i SKOV3) (Fig.3C). Behandling med FOXM1 siRNA og cisplatin resulterede også i signifikant reduktion i A2780 og SKOV3 celletal som målt ved klonogene assay (~17% vs. ~45% i A2780, ~16% vs ~37% i SKOV3) (Fig.3D). Desuden har vi undersøgt, om knockdown af FOXM1 ført til øget apoptose efter cisplatin behandling. Som vist i Fig.3E, cisplatin kombineret med FOXM1 siRNA resulterede i øgede apoptose satser i begge cellelinier (-18% vs ~38% i A2780, -20% vs ~ 40% i SKOV3). Svarende til apoptose-assay, western blot-analyse viste også forøget spaltet caspase-3 ved samtidig behandling med FOXM1 siRNA og cisplatin (Fig.4A). Tilsammen indikerer disse resultater, at målretning FOXM1 tilvejebringer en strategi for sensibiliserende ovariecancer til cisplatin.

A2780 og SKOV3-celler blev transient transficeret med siRNA (100 nM) rettet mod FOXM1. Kontrol celler blev efterladt utransficerede eller negativ kontrol siRNA (100 nM) transficerede. 48 timer efter transfektion blev FOXM1 mRNA-niveau (A) og proteinniveau (B) bestemt ved real-time PCR og western blotting, hhv. Hver søjle og søjle repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. (C) 48 timer efter transfektion, A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af cisplatin i yderligere 48 timer, og deres satser levedygtighed blev målt ved CCK8 og sammenlignet med celler uden cisplatin behandling. (D) 48 timer efter siRNA transfektion, A2780 og SKVO3 celler blev behandlet i 1 time med 1 ug /ml og 2 pg /ml cisplatin hhv. Derefter blev cellerne udpladet i 6-brønds plade blev kolonier farves og tælles efter inkubation i 8-10 d. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Graferne kvantificeret som en procentdel af den ikke-behandlede brønde. Hver søjle og søjle repræsenterer middel ± standardafvigelse. af tredobbelte bestemmelser. (E) 48 timer efter transfektion, A2780 og SKOV3-celler blev behandlet i yderligere 48 timer med 1 ug /ml og 2 pg /ml cisplatin hhv. Efter behandling blev apoptose bestemt ved flowcytometrisk analyse af Annexin V og PI-farvning. Højre panel viser middelværdier ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg.

(A) 48 timer efter transfektion, A2780 og SKOV3-celler blev behandlet i 24 timer med 2 ug /ml og 4 ug /ml cisplatin hhv. Efter behandling blev cellelysater fremstillet, opløst ved SDS-PAGE og underkastet immunobloting analyse af FOXM1, γH2AX, spaltet caspase-3 og β-actin. (B) A2780 og SKOV3-celler med eller uden silencing af FOXM1 ekspression, blev behandlet med 1 ug /ml og 2 pg /ml cisplatin i 1 t. γH2AX foci af A2780 og SKOV3-celler blev kvantificeret på forskellige tidspunkter point: 24, 48 og 72 timer efter cisplatin-behandling. Procentdel af γH2AX positive celler blev afbildet. Ubehandlede celler blev anvendt som kontrol.

4. FOXM1 banke-down resulterer i DNA-reparation mangel

Det er blevet rapporteret, at FOXM1 regulerede adskillige gener i DNA-reparationsvej [14], [24], vi næste undersøgt, om FOXM1 knock-down-celler var modtagelige for DNA pauser i kræft i æggestokkene. Til dette formål blev FOXM1 siRNA-behandlede celler og scramble-behandlede celler behandlet med cisplatin, og western blotting-analyse blev udført 24 timer efter behandling. Især øget γH2AX blev påvist i FOXM1 siRNA-behandlede celler efter samme behandling med cisplatin (Fig.4A). Endvidere har vi farvet for γH2AX 24, 48 og 72 timer efter behandling med cisplatin. γH2AX foci per kerne blev talt i mere end 100 celler i hvert tidspunkt. Resultaterne blev udtrykt som procent af γH2AX positive celler i hvert tidspunkt. FOXM1 siRNA-behandlede celler viste høj procentdel af uforarbejdede DNA skader (γH2AX positive celler) ved 48 timer og 72 timer efter cisplatin behandling sammenlignet med scramble-behandlede celler (Fig.4B). Derfor understøtter disse data indgåelsen af ​​DNA-reparation mangel i FOXM1 siRNA-behandlede celler.

5. Screening for FOXM1 target gen involveret i cisplatin-induceret DSB reparation i æggestokkræft

Flere målgener af FOXM1, såsom

BRCA2

,

XRCC1

,

RAD51

,

EXO1

,

PLK4

, er blevet rapporteret at være involveret i DNA-reparation efter DNA dobbelt streng pauser (DSBs) [14], [24]. Disse resultater fik os til at afgøre, om disse FOXM1 målgener mægle FOXM1-afhængige DNA-reparation i kræft i æggestokkene. QPCR blev anvendt til at bestemme ekspressionsprofilen af ​​ovennævnte gener efter cisplatin-behandling.

EXO1

mRNA viste den mest robuste forandring og svarede med den ændring af FOXM1 protein efter cisplatin behandling i A2780 og SKOV3 (Fig.5A). De andre gener var imidlertid lidt eller moderat induceres efter den samme behandling (data ikke vist). Interessant, vi fandt også, at EXO1 proteinet ikke kun var højt udtrykt i A2780 og SKOV3 sammenlignet med ES2 celle (Fig.S2A), men var opreguleret i en dosis og tid afhængig måde i A2780 og SKOV3 når de behandles med cisplatin, ligesom FOXM1 protein (Fig.5B og Fig.S2B). ON /OFF behandling af cisplatin resulterede også i øget ekspression af EXO1 indtil 96 h (Fig.5C). Det var ikke overraskende, at knockdown af FOXM1 var ledsaget af 60-70% reduktion i EXO1 mRNA-ekspression (Fig.5D). Desværre fik FOXM1 banke-ned ikke resultere i dyb cellecyklusstop (Fig.S2D), tyder på, at reduktionen af ​​EXO1 var ikke en indirekte effekt af cellecyklus forandring. Desuden FOXM1 silencing ikke blot svækkede EXO1 proteinekspression i respons på cisplatin-behandling (Fig.S2C), men også efter ON /OFF cisplatin treatement (Fig.5E). Disse resultater indikerer, at EXO1 er kandidat målgen af ​​FOXM1 i DNA-reparationsvej i ovariecancer.

A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med den angivne koncentration af cisplatin i 24-time PCR-analyse (A) og western blotting (B). Resultater er vist fra tre uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse. Kolonner, betyder; barer, SD. (C) A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med 2 ug /ml og 4 ug /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis derefter blev dyrket i frisk komplet medium i angivne tidspunkter (tiden komplet medium blev tilsat blev sat som 0 h) . Western blot blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​EXO1 og β-actin. (D) A2780 og SKO3 celler blev transficeret med FOXM1 siRNA, 48 timer senere, blev EXO1 ekspression bestemt ved real-time PCR-analyse. Resultater er vist fra tre uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse. Kolonner, betyder; barer, SD. (E) 24 timer efter FOXM1 siRNA transfektion, A2780 og SKOV3-celler blev behandlet med 2 ug /ml og 4 ug /ml cisplatin i 12 timer henholdsvis derefter blev dyrket i frisk komplet medium i angivne tidspunkter (tiden komplet medium var Added blev sat som 0 h). Pilen (↓) indikerer transfektion og efterfølgende behandling med cisplatin. Western blot blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​FOXM1, EXO1 og β-actin.

6. FOXM1 binder direkte til EXO1 promotoren og regulerer dens aktivitet

Vi postuleret, at FOXM1 kunne forbedre EXO1 transskription som respons på cisplatin-behandling. Sekvensanalyse identificeret to konsensus Forkhead respons elementer (FHREs) i promotor-regionen (Fig.6A) [25], [26]. For at demonstrere, at FOXM1 direkte binder sig til endogen EXO1 promoter sekvens efter cisplatin behandling, vi udførte chromotatin immunopræcipitationsanalyser i A2780 og SKOV3 celler. Den anti-FOXM1 antistof, men ikke kontrol-antistof (IgG), fældet den FHRE2-holdige region (-459 /-74) (Fig.6B), dog FHRE1-holdige region (-1934 /-1575) var ikke udfældet (data ikke vist). For at vurdere den funktionelle rolle FHRE2 i EXO1 regulering, vi udførte stedspecifikke mutagenese inden FHRE2 af EXO1 promotor pGL3-FHRE2 (Fig.6C). Som vist i Fig.6D, mutation af FHRE2 ophævet evne FOXM1 at aktivere reporterkonstruktionen efter cisplatin behandling i A2780 og SKVO3 desuden co-transfektion af FOXM1 siRNA og vildtype pGL3-FHRE2 resulterede også i lav luciferase aktivitet. Interessant pGL3-FHRE2 har stærkere transkriptionsaktivitet end fuld promotorsekvens. Disse resultater tyder på, at FHRE2 medierer den transkriptionelle effekt af FOXM1 på EXO1 promotoren og at der kan være nogle andre steder, der kan genkendes af transskription hæmmende faktorer i regionen opstrøms for FHRE2.

(A) Sekvens og position af konsensus FHRE sekvens på EXO1 promotor. (B) chip assays blev udført i A2780 og SKOV3-celler. Kromatin fragmenter af celler blev immunfældet med anti-FOXM1 antistof og negativ kontrol IgG og underkastet PCR. 1% af de totale cellelysater blev underkastet PCR før immunfældning som input. (C) Skematisk struktur af vildtype (WT) og mutant (Mut) former af FHRE2-indeholdende promotor- reportere. (D) Luciferaseaktivitet med eller uden mutation i EXO1 promotoren. A2780 og SKOV3-celler blev transficeret med vildtype eller mutant FRHE2 indeholdende reporter, eller co-transficeret med FOXM1 siRNA og vildtype reporter (PGL-3-Basic og pGL3-EXO1 blev anvendt som negativ og positiv kontrol, respektivt), derefter behandlet med cisplatin i 24 timer. Bagefter blev luciferaseaktivitet i celler målt. blev udført tre uafhængige forsøg.

7. DNA-reparation regulering af FOXM1 er delvist medieret af EXO1

EXO1 har vist sig at være direkte involveret i DNA-reparation mekanisme [18], [27], [28]. Således har vi næste udforsket, om EXO1 tegner sig for FOXM1-medieret cisplatin modstand. Vi forbigående slået ned udtryk for EXO1 i A2780 og SKOV3 celler ved siRNA transfektion. Begge siRNA’er rettet EXO1 reduceres effektivt mRNA og protein-ekspression i A2780 og SKOV3 cellelinjer (Fig.7A og 7B). Knockdown af EXO1 også sensibiliserede celler for cisplatin, som det fremgår af en sammenligning af IC

50 værdier (~2.3 ug /ml vs ~4.2 ug /ml i A2780, ~4.1 ug /ml vs ~6.4 ug /ml i SKVO3) og klon numre (~23% vs ~42% i A2780, ~21% vs ~38% i SKOV3) mellem scramble siRNA og EXO1 specifikke siRNA-behandlede celler (Fig.7C og 7D). I overensstemmelse med ovenstående, den samme behandling med cisplatin resulterede i mere apoptotiske celler EXO1 specifikke siRNA-transficerede celler (-18% vs ~27% i A2780, ~21% vs ~33% i SKVO3) i forhold til scramble-behandlede celler (Fig.7E). Selvom EXO1 knock-down påvirkede ikke udtryk for FOXM1, gjorde det til dels rekapitulere cisplatin overfølsomhed effekt af FOXM1 tavshed i æggestokkene cancerceller. EXO1 siRNA-behandlede celler viste også flere DNA skader, øget apoptose signalveje og nedsat DNA-reparation virkningsfuldhed, som påvist ved immunoblotting for γH2AX og spaltes caspase-3 (Fig.7F), og γH2AX kvantificering (Fig.7G).