PLoS ONE: NEDD4L nedreguleres i kolorektal cancer og Forhindrer Canonical WNT Signaling

Abstrakt

NEDD4 familie af E3 ubiquitin ligaser omfatter ni medlemmer. Hver er et modulært protein, der indeholder et N-terminalt C2-domænet for celle lokalisering, to til fire centrale WW domæner for substratgenkendelse, og en C-terminal, katalytisk HECT domæne, som er ansvarlig for at katalysere ubiquitylering reaktionen. Medlemmer af denne familie er kendt for at påvirke veje centrale for patogenesen af ​​kolorektal cancer, herunder WNT, TGF, EGFR, og p53 veje. For nylig,

NEDD4

mRNA blev rapporteret at være overudtrykt i kolorektal cancer, men tumor Etapen blev ikke behandlet i analysen. Angivelse af de andre familiemedlemmer er ikke undersøgt i kolorektal cancer. Heri vi bestemt udtrykket mønstre af alle ni NEDD4 familiemedlemmer i 256 patienter, som præsenteres med sygdom spænder fra præmaligne adenom til stadie IV tyktarmskræft.

NEDD4

mRNA blev øget betydeligt i alle stadier af tyktarmskræft. I modsætning hertil

NEDD4L

mRNA, den nærmeste homolog til

NEDD4

, var den mest nedreguleret familiemedlem, og var signifikant nedreguleret i samtlige tumor etaper. Vi fandt også NEDD4L protein blev signifikant reduceret med western blotting i tarmkræft prøver sammenlignet med tilstødende normal slimhinde. Desuden NEDD4L, men ikke katalytisk inaktiv NEDD4L, inhiberet kanoniske WNT signalering ved eller under niveauet for β-catenin

in vitro

. Disse resultater tyder på, at NEDD4L kan spille en tumor undertrykkende rolle i tyktarmskræft, eventuelt gennem hæmning af kanonisk WNT signalering

Henvisning:. Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L nedreguleres i kolorektal cancer og hæmmer canonical WNT Signaling. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10,1371 /journal.pone.0081514

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Juli 22, 2013; Accepteret: 23. oktober 2013; Udgivet: November 28, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Jarred Tanksley blev støttet af NCIP5095103, RO1CA46413, og GM007347. Xi Chen blev støttet af RO1CA158472. Robert J. Coffey blev støttet af NCIP5095103 og RO1CA46413. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform i USA af forekomst, og overgås kun af lungekræft i dødelighed, der forårsager ca. 50.000 dødsfald hvert år [1]. Tumorigeneseprocessen i sporadisk CRC begynder typisk med et inaktiveringsmiddel mutation i

adenomatøs polypose Coli (APC)

gen, der resulterer i afvigende aktivering af den kanoniske WNT signalvejen [2]. I de resterende tilfælde er der ofte en mutation i

CTNNB1

, som koder β-catenin [3]. Resultatet af hver af disse mutationer er formindskelsen eller tab af en celles evne til korrekt målrette cytoplasmatisk β-catenin til multi-protein E3 ubiquitin ligase, beta-transducin repeat-holdigt protein (β-TRCP), som poly-ubiquitylates β catenin, og målretter det til proteasomet for nedbrydning [4]. I stedet β-catenin akkumuleres i kernen, og partnere med TCF /LEF transskription faktor til at drive en transkriptionel program, der i sidste ende resulterer i neoplasi. I dette scenario er det cellens manglende evne til at kontrollere mængden af ​​β-catenin gennem ubiqitin-medieret nedbrydning, der fremmer tumorigenese. Men processen med ubiquitylering som helhed menes, at være opreguleret i cancer, hvilket har ført til anvendelse af proteasominhibitorer i CRC behandling [5].

ubiquitylering er en sekventiel, tre-trins proces, der involverer en E1, E2 og E3 ubiquitin ligase, der resulterer i kovalent binding af ubiquitin (er), en 76 aminosyrer stort protein, til en Lys-rest (er) af et substrat eller målprotein. Det er centralt for cellulær homeostase, primært ved at målrette proteiner til proteasomet eller lysosomet for nedbrydning via fastgørelse af ubiquitin kæder (poly-ubiquitylering). Men ubiquitylering har også vist, at spille vigtige roller i forbindelse med handlen, lokaliseringen og aktiviteten af ​​proteiner, især når der er tilføjelsen af ​​kun en ubiquityl del, betegnet mono-ubiquitylering [6]. Målspecificitet er primært leveres af E3 ligaser, som katalyserer det sidste trin af ubiquitin vedhæftet fil. I det menneskelige genom, er der over 600 E3 ligaser, versus ca. 30 E2s og to E1S. En given E3 kan have mange mål, og kan aktivere eller inhibere multiple cellulære signalveje [7]. Der er to store familier af E3’ere:. Den virkelig interessante New Gene (RING) familie, bestående 95% af alle E3’ere, og de homologe til E6-AP carboxylterminal (HECT) familie, som omfatter de resterende 5% [8]

NEDD4 familie af HECT-typen E3’ere omfatter ni medlemmer [9]. Hvert medlem er et modulært protein, med et N-terminalt C2-domænet, to til fire centrale WW domæner og en C-terminal, katalytisk HECT domæne. WW domæner er ansvarlig for target udvælgelse, og interagere med en fire aminosyrer motiv (PY motiv, PPXY) i målet protein, mens C2 domæne hjælpemidler i ordentlig cellulær lokalisering. Den HECT domænet er ansvarlig for rekruttering E2, der tjener som bærer for ubiquitin og direkte konjugater ubiquitin til målet Lys-rest, en proces, der kræver en aktiv-site Cys-rest. Den stiftende medlem af denne familie, NEDD4, er for nylig blevet vist at være opreguleret i CRC, og for at fremme udbredelsen af ​​CRC celler

in vitro

, selvom mekanismen fortsat uklart [10]. Ud over denne undersøgelse, intet er kendt om udtrykket mønstre af NEDD4 familien i CRC. Af note, har mange af de NEDD4 familiemedlemmer vist sig at målrette proteiner, der er integrerede aktører i veje menes at være vigtigst i tilblivelsen og progression af CRC.

I denne undersøgelse har vi forsøgt at bestemme mRNA-ekspression niveauer af hver af de ni NEDD4 familiemedlemmer i tumorer fra en stor gruppe af personer med colorektal neoplasi. Vi fandt, at

NEDD4

er den mest opreguleret medlem af familien. Overraskende,

NEDD4L

, som deler den største sekvenshomologi med

NEDD4

, var den mest nedreguleret medlem af familien i CRC. Vi bekræftede nedregulering af NEDD4L på proteinniveauet i humane CRC prøver. For nylig NEDD4L blev vist at nedbryde DVL2, således inhibere WNT signalering, som bestemt ved reduceret TOPFlash aktivitet [11]. Vi fandt også, NEDD4L inhiberer TOPFlash aktivitet ved eller under niveauet for β-catenin. Tilsammen tyder disse resultater på, at NEDD4L har potentiale til at fungere som en tumor suppressor i CRC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle de humane prøver, der anvendes i vores manuskript blev indsamlet og analyseret i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Review Boards på Vanderbilt University Medical center, Nashville, TN, og Moffitt Cancer center, Tampa, FL. Prøverne, der anvendes i denne publikation er beskrevet tidligere [12], [13]. De resulterende data blev analyseret anonymt.

Menneskelig vævsprøve microarray analyse

I alt 250 humane CRC vævsprøver blev indsamlet ved VUMC (N = 55) og MCC (N = 195). Af disse CRC prøver, 33 var Fase I (13,2%), 76 fase II (30,4%), 82 fase II (32,8%), og 59 Stage IV (23,6%). Tilstødende normale væv blev opsamlet ved MCC fra ti af disse patienter. Af disse blev to indsamlet fra fase I, fem fra trin II, og tre fra trin III patienter. Yderligere seks adenomer blev opsamlet ved MCC. Prøverne, der anvendes i denne publikation er beskrevet tidligere [12], [13]. RNA fra disse væv blev opnået og hybridiseret til Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip Expression Array. blev analyseret følgende prober:

NEDD4

(213012_at),

NEDD4L

(237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),

WWP1

(212637_s_at, 212638_s_at),

WWP2

(1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),

ITCH

(209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),

SMURF1

(1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),

SMURF2

(205596_s_at, 227489_at, 232020_at),

NEDL1

(210331_at, 215584_at), og

NEDL2

(232080_at, 243080_at). Af de fire prober specifikke til

NEDD4L

fokuserede vi vores opmærksomhed på 212445_s_at som det koder for en del af det translaterede protein. Tre af de fire NEDD4L sonder blev væsentligt nedreguleret på en lignende måde, mens en (237498_at) uændret med progression.

Patienterne i VUMC gruppe havde en median opfølgning på 50,2 måneder, med et minimum føl- op på 0,4 måneder og maksimalt 111,3 måneden. Dem i MCC gruppe havde en median opfølgning på 44,7 måneder, med et minimum på 0,92 og højst 142,8 måneden. Alle disse prøver blev indsamlet og analyseret i overensstemmelse med en protokol godkendt af Institutional Review Boards både VUMC og MCC.

Western blot-analyse

CRC væv og tilstødende normale colon mucosa blev indsamlet fra 20 personer ved kirurgisk resektion på VUMC og lynfrosset i flydende nitrogen. Prøver blev derefter lyseret i 8 M urinstof, sonikeret og centrifugeret ved 14.000 rpm. Supernatanten blev fjernet, og proteinet kvantificeres ved at måle absorbansen ved 280 nm. Prøverne blev derefter kørt på en 7,5% polyacrylamidgel og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blottet med anti-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) og anti-α-tubulin (1:2000) (TUBA) (Calbiochem, San Diego, CA) antistoffer, og påvist under anvendelse af passende HRP -konjugerede sekundære antistoffer og kemiluminescensmetoden. Intensiteterne af blots blev derefter kvantificeret under anvendelse af ImageJ software og analyseret.

TOPFlash assay

Transfektioner blev udført under anvendelse Metafectene (Biontex, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner. HEK293-celler (2 x 10

5) blev udpladet i en 12-brønds skål, fik lov til at vedhæfte, og transficeret den følgende dag med 0,1 pg af hvert plasmid. Følgende plasmider blev anvendt: TOPFlash reporterplasmid, FOPFlash reporterplasmid, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene plasmid 27000), og NEDD4L (C A) (Addgene plasmid 27001) [14]. Konstruktioner indeholdende vildtype (wt) β-catenin og mutant β-catenin (ΔN89) var en gave fra Ethan Lee ved Vanderbilt University. Dagen efter transfektion blev mediet fjernet, og serum-frit medium indeholdende 20 ng /ml Wnt3a og 100 ng /ml R-spondin (Vanderbilt antistof og protein delte ressource) blev tilsat. Den følgende dag blev celler lyseret og behandlet i overensstemmelse med luciferase (Promega, Fitchburg, WI). TOPFlash aktivitet blev normaliseret til FOPFlash aktivitet, og fold-aktivering blev bestemt ved at normalisere til TOPFlash og FOPFlash aktivitet i stimulerede celler. Alle forsøg blev udført tre gange mindst tre gange.

NEDD4L knock-down

Lentivirale plasmider indeholdende shRNA (Open Biosystems, Huntsville, AL) mod human

NEDD4L

blev transficeret ind i HEK293-celler under anvendelse Metafectene. Den følgende dag, frisk medium blev tilsat. Den næste dag blev mediet filtreret (0,45 um filtre). At inficere DLD-1 og RKO-celler, 2,0 x 10

5-celler blev udpladet i hver brønd i en 6-brønds plade, og inficeret med lentivirus. Efter to dage blev GFP-ekspression observeret, og inficerede celler blev selekteret med puromycin (5 ug /ml) og sorteret for GFP-ekspression. Effektivitet af knock-down blev bestemt ved NEDD4L western blotting.

Statistisk analyse

For at sammenligne ekspressionsniveauet af hver probe mellem normal, adenom, og kræft vævsprøver, Wilcoxon rank sum test blev anvendt [12], [13]. For at bestemme de relative proteinniveauer blev NEDD4L proteinniveauer normaliseret til tuba niveauer, log-transformeret, og sammenlignet ved anvendelse af en parret t-test. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført på mikroarrayet datasæt for at bestemme sygdomsspecifikke overlevelse. Sygdomsspecifikke overlevelse blev defineret som en dokumenteret cancer-relaterede dødsfald [12]. Betydning niveauer i TOPFlash reporter analysen eksperiment blev bestemt ved hjælp af t-test.

Resultater

Expression niveauer af NEDD4 familiemedlemmer i CRC

De ni medlemmer af NEDD4 familie af E3 ubiquitin ligaser er modulære proteiner (figur 1). Som helhed er NEDD4 familien er kendt for at være involveret i reguleringen af ​​en række proteiner og veje, der er centrale for udviklingen af ​​CRC. Tabel 1 er en samling af kendte substrater, signalveje berørt, og ekspressionsniveauer i forskellige cancertyper i alle NEDD4 familiemedlemmer. Der er høj sekvenshomologi blandt familiemedlemmer, hvilket forklarer de delte mål for mange af familiens medlemmer. Men der er også eksempler på forskellige familiemedlemmer har modstående virkninger på samme signalvej. F.eks NEDD4 forårsager nedregulering af SMAD1 og CBL, som hæmmer knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering og aktiverer epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) signalering, henholdsvis [15], [16]. På den anden side, NEDD4L virkninger transformerende vækstfaktor-β (TGFp) signalering, men ikke BMP-signalering gennem nedbrydning af SMAD 2 og 3 og type I TGFp-receptor, og ophæver EGFR signalering gennem ubiquitinmedieret nedbrydning af aktiveret cdc42 kinase 1 (ACK1) [14], [17], [18]. Derudover NEDD4 er blevet vist at nedregulere tumor suppressor PTEN [19]. NEDD4 blev dog vist, at fremme udbredelsen af ​​CRC celler

in vitro

, uafhængig af en virkning på PTEN niveauer [10].

De ni medlemmer af NEDD4 familien er modulopbyggede proteiner. I deres N-terminus, hver har en C2-domænet, som spiller en rolle i korrekt cellulær lokalisering. Den centrale del af hver protein indeholder to til fire WW-domæner, der er ansvarlige for target anerkendelse. WW-domæner er 20-23 aminosyre, Trp-baserede motiver, som genkender PY motiver (PPXY, LPXY), samt nogle phospho-Ser- eller phospho-Thr-baserede motiver. Ved C-terminalen er HECT domæne, der direkte konjugater en ubiquityl gruppe til målproteinet. Familiemedlemmerne er samlet ved navn og homologi. ITCH er tættere homolog til WWP1 og 2 end til andre familiemedlemmer.

For at bestemme en potentiel rolle for NEDD4 familie i initiering eller progression af CRC, vi udsat 250 CRC patienttumorceller prøver af forskellige stadier, seks adenom prøver, og 10 hosliggende normale prøver til microarray analyse og bemærker hvordan ekspressionen af ​​hvert familiemedlem ændret med progression (Figur 2A). Interessant, den nært homologe par

NEDD4

NEDD4L

var modsat reguleret (figur 2B, C).

NEDD4

(213012_at) trended opad i adenom scenen, men var signifikant forhøjet i fase 1 CRC og forblev signifikant forhøjet i løbet af tumor progression. Omvendt

NEDD4L

(212445_s_at) udtryk faldt, tendenser nedad i adenomer, og blev signifikant reduceret i alle faser af CRC (Figur 2C).

(A) Udtrykket af alle ni NEDD4 familie medlemmer blev undersøgt i CRC ved microarray profilering. Vist her er det gennemsnitlige fold-change af alle prober for hvert enkelt gen i NL (N = 10), Ad (N = 6), Ca1 (N = 33), Ca2 (N = 76), Ca3 (N = 82) og CA4 (N = 59). (B)

NEDD4

(213012_at) er den mest opreguleres medlem af NEDD4 familien i CRC. (C)

NEDD4L

(212445_s_at) er den mest nedreguleret medlem af NEDD4 familien i CRC. Nl = normal, Ad = adenom, og Ca1-4 = CRC, fase I-IV. * P. 0,05

NEDD4L protein er faldet i CRC

Som transkriptniveauer af et bestemt gen ikke altid sammen med protein niveauer, vi næste afgøres, om faldet i

NEDD4L

mRNA-niveauer resulterede i et fald i NEDD4L protein. For at gøre dette, vi udførte western blot analyse på menneskers CRC og tilstødende normale vævsprøver fra 20 patienter ved hjælp af væv indsamles på Vanderbilt University Medical Center (figur 3A, B). Vi observerede et signifikant fald i NEDD4L proteinniveauer (~42%) i human CRC sammenlignet med normalt væv, en konstatering overensstemmelse med microarray analyse.

(A) NEDD4L niveauer blev bestemt ved western blotting af CRC (Ca ) og tilstødende normal (Nl) slimhinde fra tyve personer. Niveauer blev normaliseret til TUBA og Nl blev sammenlignet med Ca. NEDD4L var signifikant nedreguleret (~42%) i CRC (* p 0,05). Data er repræsenteret i boksen og whisker plot format. De linjer, der forbinder datapunkter viser de relative NEDD4L niveauer i en given Nl-Ca matchede par. Røde betegner faldt NEDD4L niveauer i Ca, mens sort angiver en stigning. (B) Lysater genereret fra Nl-Ca matchede par blev slettet for NEDD4L og TUBA. Vist her er fire repræsentative par.

Vi næste forsøgt at afgøre, om NEDD4L ekspressionsniveauerne korrelerer med sygdomsspecifikke overlevelse i vores kohorte af patienter. Vi sammenlignede overlevelsen af ​​patienter i den højeste kvartil af NEDD4L ekspression med den for dem i den laveste kvartil (figur 4). Vi fandt, at de patienter med den højeste NEDD4L udtryk udstillet en længere periode med sygdomsspecifikke overlevelse end patienter med de laveste ekspressionsniveauerne. Denne forskel er imidlertid, ikke nåede statistisk signifikans (p = 0,079).

Sygdom-specifik overlevelse i CRC patienter med den højeste og laveste NEDD4L udtryk blev sammenlignet ved hjælp af Kaplan-Meier analyse. De patienter med tumorprøver i den højeste kvartil af NEDD4L ekspression viste en tendens mod længere sygdomsspecifik overlevelse over en 60-måneders periode. p = 0,079.

NEDD4L undertrykker kanoniske WNT signalering

Det betydelige fald i NEDD4L udtryk i CRC antyder muligheden for, at NEDD4L spiller en tumor-undertrykkende rolle i CRC. I betragtning af den centrale i kanoniske WNT signalering til initiering og progression af CRC, vi undersøgt, om NEDD4L kan undertrykke kanoniske WNT signalering ved at udføre TOPFlash reporter assay, som måler kanoniske WNT aktivitet ved sammensmeltning TCF /LEF respons elementer til en ildflueluciferase reporter. NEDD4L inhiberede TOPFlash aktivitet, når kanoniske WNT signalering blev aktiveret ved tilsætning af Wnt3a og coaktivator, R-spondin (figur 5A). Inhibering synes at være afhængig af evnen hos NEDD4L til ubiquitylate målproteiner, som den katalytisk inaktiv form af NEDD4L, hvor aktive sted Cys blev muteret til en Ala [NEDD4L (C A)] viste ingen hæmning af TOPFlash aktivitet ( figur 5A) [20]. Disse resultater understøtter den seneste konstatering af, at NEDD4L hæmmer WNT signalering ved ubiquitylating og målretning DVL2 til proteasom for nedbrydning [11]. Vi fandt imidlertid også, at NEDD4L inhiberede kanoniske WNT signalering når wt eller mutant (ΔN89) β-catenin blev anvendt som en aktivator (figur 5B), hvilket tyder NEDD4L undertrykker WNT signalering nedstrøms DVL i nærvær af mutant APC eller CTNNB1.

(A) NEDD4L hæmmer TOPFlash aktivitet i HEK293 celler sammenlignet med tom vektor (CTL) eller katalytisk inaktiv NEDD4L [NEDD4L (C A)]. Wnt3a (20 ng /ml) og R-spondin (100 ng /ml) blev anvendt til at aktivere kanoniske WNT signalering. (B) Når to forskellige β-catenin-konstruktioner, β-catenin (WT) og β-catenin (ΔN89), tjener til at betjene kanoniske WNT signalering en signifikant reduktion i TOPFlash aktivitet blev observeret i nærvær af NEDD4L overekspression sammenlignet med tom vektor eller NEDD4L (C A). Alle resultater er normaliseret til FOPFlash aktivitet. * P. 0,05

For at udvide dette arbejde, vi undersøgte vækst virkninger af banker ned endogene NEDD4L i to humane CRC cellelinjer, DLD-1 og RKO. DLD-1 celler indeholder en beskærer mutation i

APC

, mens RKO celler har hverken en mutation i

APC

eller

CTNNB1

, men har en inaktiverende mutation i

NKD1

, en inducerbar negativ regulator af WNT signalering [21]. Knock-down blev verificeret ved Western blotting (-80%) (data ikke vist). Vi målte vækst på plast, og i blød agar og collagen. Vi observerede ingen signifikante forskelle i væksten i celler med NEDD4L knock-down i forhold til scrambled kontroller (data ikke vist). Derudover NEDD4L knock-down havde ingen effekt på tumorstørrelse hos nøgne mus xenografter (data ikke vist).

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at begynde at forstå, hvis der er en rolle for medlemmer af NEDD4 familie af E3 ubiquitin ligaser i CRC. Ni medlemmer omfatter denne familie, og hver er blevet vist at påvirke mindst én af de cellulære veje centrale for indledningen og fremadskriden af ​​CRC. Adskillige medlemmer har vist sig at blive dysreguleret i en række forskellige cancere. Men ikke tidligere er foretaget en systematisk evaluering af ekspressionsniveauerne af alle familiemedlemmer i human CRC. Især

NEDD4

mRNA-ekspression blev for nylig vist at være opreguleret i CRC, men denne analyse ikke overveje den fase af CRC, eller omfatter adenomer [10]. Vi følte, at det første skridt i begyndelsen til at forstå denne familie af E3’ere i CRC var at undersøge ekspressionsniveauerne af hvert familiemedlem i CRC’er fra en stor gruppe af patienter. Vi valgte at udføre vores analyse på tværs af alle faser, herunder adenomer, som der er almindeligt ændringer i lignende veje på lignende punkter under CRC progression [2]. Nogle af disse veje har forskellige funktioner på forskellige stadier. For eksempel er TGFp-vejen er et tumorsuppressor tidligt i CRC, men fremmer progression og metastase senere [22].

Heri vurderede vi, hvordan ekspression af hvert NEDD4 familiemedlem ændringer med progression fra adenom til trin IV CRC. Den mest opreguleret familiemedlem var

NEDD4

, i overensstemmelse med de førnævnte resultater [10]. Vi går på at vise, at opregulering opstår tidligt i CRC (fase I), og opregulering opretholdes under progression. Den mest nedreguleret familiemedlem i vores datasæt var

NEDD4L

. Vi fandt denne overraskende i betragtning, at NEDD4L deler den højeste sekvenshomologi med NEDD4, og har vist sig at have en betydelig overlapning med NEDD4 i mål udvalg [7]. For nylig blev NEDD4L proteinniveauer vist at blive nedreguleret i gastrisk cancer og de patienter med de laveste ekspression ved immunohistokemisk analyse havde en dårligere prognose [23]. NEDD4L har også vist sig at være både opreguleret og nedreguleret i prostatacancer, steg i invasive galdeblæren cancerceller, og nedreguleret i mere aggressive maligne gliomer [24] – [27]. Disse forskellige fund er ikke uventet i betragtning af antallet af mål og celle signalveje, hvorpå NEDD4L har vist sig at virke.

En nylig rapport viste, at NEDD4L hæmmer både de kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signalveje ved ubiquitylating DVL2 og målrette den til proteasomet til destruktion [11]. Her fandt vi, at NEDD4L også kan inhibere kanonisk WNT signalering på niveau med, eller nedstrøms, β-catenin. Dette er i modsætning til det førnævnte papir, hvor undersøgere viste, at NEDD4L ikke kunne inhibere TOPFlash når signalering blev aktiveret ved en β-catenin mutant (S37A). I deres undersøgelse blev isoform 2 i NEDD4L (NM_001144964.1), der anvendes, mens vi brugte en anden NEDD4L isoform (KIAA00439). Disse to cDNA’er varierer i deres N-terminale ende; konstruktionen, der anvendes i vores undersøgelse har yderligere 141 aminosyrerester ved den umiddelbare N-terminus, som ændrer C2-domænet, og 20 færre rester i et segment forud for den anden WW-domænet. Dette kan bidrage til differential lokalisering eller substrat målretning. Derudover blev forskellige β-catenin konstruktioner testes; vi brugte wt og mutant β-catenin (ΔN89), og, i den tidligere rapport, blev β-catenin (S37A), der anvendes.

Vi fandt, at banke ned udtryk for endogene

NEDD4L

i to CRC linjer havde ingen effekt på væksten. Dette kan skyldes det faktum, at disse cellelinjer allerede har udviklet en mekanisme til at overvinde de vækstinhiberende virkninger af NEDD4L, eller at cellerne allerede har opnået en endogen reduktion i NEDD4L ekspression til et niveau under det nødvendige for væksthæmning. Fremtidige undersøgelser vil løse dette ved overekspression vægt NEDD4L i et batteri af CRC linjer. I sidste ende kan det være nødvendigt at skabe en musemodel hvori NEDD4L bliver slået ud tidligt i processen af ​​tumorigenese.

Som konklusion har vi undersøgt mRNA ekspression af NEDD4 familie af E3 ubiquitin ligaser i en stor kohorte af personer med kolorektal neoplasi. Den mest opreguleres medlem er

NEDD4

, som tidligere er blevet vist at forøge proliferation af humane CRC celler

in vitro

[10]. Den mest nedreguleret medlem er

NEDD4L

. Efter aftale med tidligere resultater, NEDD4L overekspression i HEK293 celler hæmmes kanonisk WNT signalering [11]. Her viser vi også, at NEDD4L inhiberer WNT signalering ved eller nedstrøms for β-catenin, hvilket er vigtigt i forbindelse med den mest almindelige aktiverende mutation i kanonisk WNT signalering, der findes i CRC. Derfor foreslår vi, at NEDD4L kan fungere som en tumor suppressor i CRC ved at hæmme kanonisk WNT signalering.

Tak

Forfatterne vil gerne anerkende Bruce Aronow, Dan Ayers, Tim Yeatman, og Josh Smith for deres hjælp med dataanalyse, og Jim Higginbotham for hans hjælp med flow sortering. Forfatterne også takke Emily Poulin for hendes redaktionelle assistance.