PLoS ONE: Effekter af Androgen receptor og Androgen på genekspression i prostata Stromal fibroblaster og parakrine Signaling til Prostata Cancer Cells

Abstrakt

androgen receptor (AR) er udtrykt i en delmængde af prostata stromale celler og funktionel stromacelle- AR er nødvendig for normal prostata udviklingsmæssige og påvirker væksten af ​​prostata tumorer. Selvom vi er stort set klar over detaljerne i de genomiske handlinger AR i prostata kræftceller, er relativt lidt kendt med hensyn til gen-mål for funktionel AR i prostata stromale celler. Her beskriver vi en hidtil ukendt human prostata stromal celle model, der gjorde det muligt at undersøge virkningerne af AR den genekspression i disse celler. Modellen indebærer en genetisk manipuleret variant af immortaliserede humane WPMY-1 prostata stromale celler, der overudtrykker vildtype AR (WPMY-AR) på et niveau, der kan sammenlignes med LNCaP celler og er lydhør over for dihydrotestosteron (DHT) stimulation. Anvendelse af WPMY-AR celler til genekspressionsprofilering viste, at tilstedeværelsen af ​​AR, selv i fravær af DHT, væsentligt ændret genekspression mønster af cellerne sammenlignet med kontrol (WPMY-Vec) celler. Behandling af WPMY-AR-celler, men ikke WPMY-Vec kontrolceller, med DHT medførte yderligere ændringer, der er ramt ekspressionen af ​​141-gener med 2 gange eller mere sammenlignet med vehikelbehandlede WPMY-AR celler. Bemærkelsesværdigt, DHT betydeligt nedreguleret flere gener end der blev opreguleret men mange af disse ændringer vendt de første virkninger af AR overekspression alene på individuelle gener. Generne mest høj grad berøres DHT behandling blev kategoriseret baseret på deres rolle i cancer veje eller i celle-signalveje (transformerende vækstfaktor-β, Wnt, pindsvin og MAP kinase) menes at være involveret i stromal-epitel krydstale under prostata eller prostatakræft udvikling. DHT behandling af WPMY-AR-celler var også tilstrækkelig til at ændre deres parakrin potentiale for prostatacancerceller som konditioneret medium fra DHT-behandlede WPMY-AR signifikant forøget vækst af LNCaP-celler sammenlignet med DHT-behandlede WPMY-Vec celle konditioneret medium.

Henvisning: Tanner MJ, Welliver RC Jr, Chen M, Shtutman M, Godoy A, Smith G, et al. (2011) Virkninger af Androgen receptor og Androgen på genekspression i prostata Stromal fibroblaster og parakrine Signaling til prostatacancerceller. PLoS ONE 6 (1): e16027. doi: 10,1371 /journal.pone.0016027

Redaktør: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, USA

Modtaget: 12. oktober 2010; Accepteret: December 2, 2010; Udgivet: 18 Jan 2011

Copyright: © 2011 Tanner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Equinox Foundation og Medical Research Foundation of Albany, New York. MT var en amerikansk Urological Association (URA) Foundation Research Fellow. MC og AG er modtagere af Department of Defense (DoD) Prostata Cancer Research Program (PCRP) postdoc stipendier (W81XWH-10-100.125 [til MC] og W81XWH-09-1-0330 [til AG]). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatakirtlen kræver androgene steroider til udvikling, voksen vedligeholdelse og funktion. Hanner med inaktiverende mutationer i vigtige gener, der er nødvendige for androgen metabolisme udvikle kun en rudimentær prostata [1] og mænd med inaktiverende mutationer i androgen receptor (AR) -genet, som medierer virkningerne af androgener, ikke udvikler prostata [2]. Androgener og AR handling spiller også en vigtig rolle i prostata carcinogenese. Lægemidler, der hæmmer androgen biosyntese har kemoforebyggende virkninger, der nedsætter risikoen væsentligt for at udvikle prostatakræft hos mænd [3] og androgen ablation terapi give den mest klinisk nyttige midler til palliativ sygdomsbekæmpelse når prostatakræft opdages i fremskredent stadium [4]. Disse kliniske fakta identificere relevansen af ​​androgen signalering for prostata biologi og karcinogenicitet og drev forskningsindsats at karakterisere konsekvenserne af androgen signalering i prostata celler.

Da AR protein er en udvidet medlem af den nukleare transskription faktor, betinget regulerer ekspressionen af ​​gener [5], er det rimeligt at forvente, at tilgængeligheden af ​​et omfattende katalog af androgen regulerede gener i prostata celler i væsentlig grad kan bidrage til vores viden om androgen handling i prostata. Til dette formål brugen af ​​moderne masse genekspression profilering teknologi, især involverer gen microarrays på chips, har allerede i høj grad udvidet listen over kendte androgen regulerede gener i prostatacancerceller [6] – [9]. Undersøgelser med denne tilgang har støttet den endelige identifikation af nye genetiske anomalier (ETS gen omlejringer) [10] – [12], og har bidraget til at identificere unormalt aktive signalveje i prostata cancer celler [13], [14], der har translationel potentiale for forbedring af strategier prostatakræft diagnostiske eller behandling. Denne type teknologi er dog endnu ikke blevet anvendt til at karakterisere androgen /AR virkninger på genekspression i prostata stromaceller, på trods af den omfattende dokumentation for, at celler fra prostata stroma deltage aktivt i de processer, hvorigennem androgener regulerer normal eller malign prostata udvikling [15] – [19]. Hovedårsagen til dette underskud er manglen på egnede dyrkede humane prostata stromacellelinier modeller, robust udtrykker AR protein og beviseligt reagerer på tilstedeværelsen af ​​androgener som angivet ved ændringer i genekspression, når de dyrkes i et androgen medium. Her beskriver vi vores erfaring i at teste nogle rådighed (godartet) humane prostata stromale celle modeller for deres lydhørhed over for androgener

in vitro

og udvikle et særligt androgen-responsiv human prostata stromacelle- model (WPMY-AR celler) der blev profileret for AR- og androgen-inducerede ændringer i genekspression ved anvendelse af humant gen Chip microarrays. Desuden brugte vi denne model celle system til at teste den idé, at androgener ændrer parakrin signalering miljø af en prostata tumor ved at påvirke produktionen af ​​udskilte faktorer fra prostata stromale fibroblaster.

Resultater

Androgen receptor ekspression og aktivitet i dyrkede humane prostata stromaceller

To tilgængelige immortaliserede humane prostata stromale cellelinier, PS-30 og WPMY-1, og ikke-immortaliserede primære humane prostata stromale celle myofibroblaster blev evalueret for AR-ekspression og modtagelighed over for androgener. Ingen af ​​disse celler kræver androgen til

in vitro

vækst blev imidlertid WPMY-1-celler der tidligere er rapporteret til at vokse lidt hurtigere i nærvær af syntetisk androgen, R1881 [20]. AR ekspression blev vurderet i disse celler ved kvantitativ RT-PCR (qPCR) og Western blot-procedurer og blev sammenlignet med dyrkede primære humane prostata stromale fibroblaster (PRSC) og til LNCaP-prostatacancerceller, der er modeller for AR indsats prostatacancer (figur 1A ). Af de adspurgte celler, LNCaP celler udtrykte de højeste niveauer af AR mRNA. AR mRNA blev udtrykt på kun 3,4% af dette niveau i PS30 celler, 1,1% i PRSC og på lidt over 0,1% af dette niveau i WPMY-1 celler. Dette mønster var i overensstemmelse med vores Western blot data, hvor vi var ude af stand til at opdage en bånd svarende til AR i ekstrakter af nogen af ​​de immortaliserede celler eller i PRSC selvom det var let påvises i ekstraktet fra LNCaP-celler (fig. 1B). Ligeledes når parentale WPMY-1-celler blev transficeret med et androgen responsive reporter vektor, viser de intet tegn på øget ekspression af reporter (luciferase) som reaktion på stigende mængder af DHT (fig. 1C). Men når WPMY-1-celler blev co-transficeret med androgen reporter sammen med en AR-ekspressionsvektor blev ekspressionen af ​​reporteren steg betydeligt ved tilstedeværelsen af ​​DHT (fig. 1C). Sammenfattende lav endogen AR-ekspression i disse humane prostata stromale cellelinier og deres manglende respons til androgen stimulation tyder på, at de er dårlige modeller for studiet af androgen virkning i stromale celler, men eksogen ekspression af AR, i det mindste i WPMY-1 celler, der er tillagt disse celler en androgen-reagerende fænotype, der kunne være mere befordrende for studiet af androgen handling.

(A) AR mRNA-niveauer i PS30, primær prostata stromale (PRSC), WPMY-1 (W ), WPMY-Vec (W-Vec), WPMY-AR (W-AR) eller LNCaP celler påvises ved real-time qPCR af RNA udvundet fra cellerne. Ekspressionsniveauer er indekseret til ekspression af GAPDH i hver celle linie. (B) AR protein (øvre baner) i PS30, PRSC, W, W-Vec, W-AR eller LNCaP celler påvises ved Western blot. Blottet blev igen probet for GAPDH protein (lavere baner) som kontrol. (C) Luciferase reporter ekspression i WPMY-1-celler co-transficeret med ARE-luc reporter vektor og en kontrol (tom) vektor (Vector) eller pLenti6.2-Har-vektoren (AR). Luciferase niveauer er normaliseret for GFP-fluorescens i samme ekstrakt som transfektionskontrol markør. (D) immunfluorescensfarvning for AR i W-AR-celler dyrket i 72 timer i fravær (venstre) eller nærvær (højre) på 10 nM DHT. Celler blev co-farvet med DAPI for at identificere kerner. (E) Luciferaseaktivitet i W-AR celler transficeret med ARE-Luc og GFP i fravær eller nærvær af 10 nM DHT. Luciferaseaktivitet blev normaliseret ved sammenligning med GFP-niveauer i den samme ekstrakt. (F). Vækst af W-Vec eller W-AR celler i fravær eller nærvær af 10 nM DHT målt ved WST-1 analysen.

For at gøre WPMY-1 celler mere medgørlige for undersøgelsen af androgen virkninger på genekspression, vi transduceret cellerne med human vildtype AR ekspression lentivirus og derefter anvendt antibiotisk selektion til opnåelse af en stabil population af AR overudtrykker WPMY-1-celler (WPMY-AR). Andre WPMY-1-celler blev transduceret med tom lentivirus og udvalgt under de samme betingelser for at opnå en kontrol cellepopulation (WPMY-Vec). WPMY-AR celler udtrykker AR mRNA og protein på et niveau sammenligneligt med androgensensitive LNCaP prostatacancerceller (fig. 1A, B). Immunofluorescens-farvning ved anvendelse af anti-AR-antistof viste, at AR var hovedsagelig i cytoplasmaet, når disse celler blev dyrket i fravær af DHT, selv om der var lys nuklear immunfluorescensfarvning i de fleste celler (fig. 1D). I modsætning hertil, når WPMY-AR-celler blev dyrket i DHT-holdigt medium, AR immunfarvning var udelukkende nukleare. AR udtrykt i de stabile WPMY-AR-celler var funktionelle for genomisk aktivering af genekspression. Når disse celler blev transficeret med androgen-reporteren, blev luciferaseaktivitet steg betydeligt ved behandling med DHT henviser DHT ikke påvirkede luciferaseekspression i reporter-transficerede WPMY-Vec kontrolceller (fig. 1E). Ellers WPMY-AR-celler viste ingen andre åbenlyse fænotypiske forskelle i forhold til WPMY-Vec kontrolceller; de kunne ikke skelnes ved morfologi ved mikroskopisk observation (ikke vist) og har lignende vækstrater i både androgen-fri og androgen-holdigt medium (fig. 1F).

Sammenlignende genekspressionsprofilering af prostata Stromal Cell Varianter Grown i Tilstedeværelsen eller fraværet af DHT

WPMY-Vec og WPMY1-AR-celler blev udpladet i lige stort antal i androgen-frit medium til fastgørelse derpå overført til frisk medium med eller uden supplerende 10 nM DHT i 72 timer. RNA udvundet fra biologiske dubletter af disse kulturer blev mærket derefter profileret på Affymetrix Human Gene ST 1.0 Array Gene Chips. Den microarray udtryk data blev analyseret for at identificere de gener, der blev udtrykkes forskelligt mellem en given celle under forskellige betingelser (- /+ DHT) eller mellem de to celletyper (WPMY-VEC vs WPMY-AR) under tilsvarende forhold. Ved hjælp af en afskæring på 1,5-fold ændringer i RNA-ekspression, WPMY-vec kontrolceller havde kun 8 gener, der blev differentielt udtrykt i nærvær af DHT og grafen viser udvalget af disse ændrede gener blev genereret af GeneSpring program og er vist i Figur 2A. Vi har forsøgt at bekræfte forskellen udtryk for disse 8 gener i WPMY-VEC DHT-behandlet /-untreated celler ved hjælp af real-time qPCR at vurdere ekspressionen af ​​hvert gen på en frisk sæt biologiske dobbeltprøver men resultaterne af denne analyse viste ingen signifikante forskelle i ekspression for nogen af ​​dem ved hjælp af denne metode (ikke vist). Sammenligning af genekspressionsprofilerne af DHT-behandlet /-untreated WPMY-AR-celler imidlertid gjorde viser meget mere slående og robuste ændringer i genekspression forbundet med DHT behandling. DHT påvirkede ekspressionen af ​​172 individuelle gener med 1,5 gange eller mere (fig. 2B). Størstedelen af ​​disse ændringer (141 eller 81,9%) var på niveau med 2 gange eller mere. I denne sidstnævnte kategori, blev flere gener nedreguleres af DHT (85 gener), end der blev opreguleret (56 gener). De gener, der er blevet ændret af 2 gange eller mere er identificeret i tabel S2 og tabel S3. Vi valgte derefter 10 forskellige gener fra disse lister, herunder 6 opreguleret og 4 nedreguleret gener, for yderligere validering af real-time qPCR på en frisk sæt RNA’er ekstraheret fra biologiske dobbeltprøver. Hver af disse udvalgte gener blev bekræftet at være signifikant op- eller nedreguleret ved tilstedeværelsen af ​​DHT på samme måde som resultaterne af microarray ekspressionsanalyse (fig. 3A). Endelig blev listen over gener (op- og ned-reguleret), der er blevet ændret ved to-fold eller større i tilstedeværelse af DHT funktionelt vurderet ved hjælp af

Pathway Express

program (http: //vortex. cs.wayne.edu/projects.htm) [21], der tildeler gener i specifikke Kegg funktionelle veje og derefter de forskellige Kegg pathways associeret med disse gener blev kvantitativt prioriteret af et af to forskellige parametre: 1) antallet af input gener, som er tilknyttet en bestemt Kegg vej; eller 2) procentdelen af ​​individuelle Kegg pathwaygener der var til stede i input gensæt (tabel 1). De øverste 10 Kegg pathway placeringer ved hjælp af to forskellige parametre delt kategorierne, Pathways i Cancer, Cytokine-Cytokine Receptor Interaktion, TGF-β Pathway, Wnt Pathway, og pindsvinesignaleringsvejen men andre fremtrædende celle signalveje var repræsenteret i en rangordning eller andre

(A) GeneSpring-genereret line plot af signifikant. (P 0,05) genekspression forskelle større end 1,5 gange i WPMY-VEC celler behandlet i 72 timer med 10 nM DHT. (B) GeneSpring-genereret line plot af signifikant (P 0,05) genekspression forskelle større end 1,5 gange i WPMY-AR-celler behandlet i 72 timer med 10 nM DHT. (C) GeneSpring-genereret line plot af signifikant (P 0,05) genekspression forskelle større end 1,5 gange mellem WPMY-Vec og WPMY-AR-celler dyrket uden DHT. (D) GeneSpring-genereret line plot, der viser virkningen af ​​DHT behandling på gener, der var differentielt opreguleres med 2 gange eller mere ved AR ekspression alene (ingen DHT). (E) GeneSpring genereret line plot, der viser virkningen af ​​DHT behandling på gener, der var differentielt nedreguleres ved 2-fold eller mere af AR-ekspression alene (ingen DHT) og blev efterfølgende opreguleret med 2 gange i nærvær af DHT. (F) GeneSpring genereret line plot, der viser virkningen af ​​DHT behandling på gener, der var differentielt nedreguleres ved 2-fold eller mere af AR-ekspression alene (ingen DHT) og blev efterfølgende yderligere nedreguleres med 2 gange eller mere i nærvær af DHT.

(A). Vurdering af individuelle genekspression ændringer forbundet med DHT behandling af WPMY-AR-celler ved qPCR. Seks af generne i dette panel (SFRP-5, IGF-1, Wnt-16, AQP3, FKBP5 og RERG) blev identificeret som DHT-opregulerede gener i microarray genekspression analyse og fire gener (BMP-4, FST , IL7R og FGF5) blev identificeret som DHT-nedregulerede gener i microarray genekspression analyse og disse ændringer blev bekræftet i qPCR assay. Alle ændringer opdaget af qPCR var væsentlige ændringer (P 0,05). (B) Vurdering af individuelle genekspression ændringer forbundet med DHT behandling af PS30 celler transient transficeret med pLenti6.2-Har ved qPCR. Måling af ændringer i SRBP5, IGF1, Wnt-16, AQP3, FKBP5, RERG og FGF5 var signifikant (P 0,05), mens ændringer i BMP-4, FST og IL7R ikke var signifikant (P 0,05).

for bedre afgøre, om disse gen ændringer i forbindelse med DHT behandling var specifikke for WPMY-AR celler, eller om de kan også forekomme i andre humane prostata stromale celler med tilstrækkelig AR udtryk, vi forbigående transficeret PS30 celler med AR ekspressionsvektor eller en tom vektorkontrol derefter behandlet disse celler uden eller med 10 nM DHT i 72 timer. RNA’er ekstraheret fra disse celler blev testet ved real-time qPCR analyse for ekspression af AR og til ekspression af de samme 10 gener, der blev selektivt analyseret i WPMY-AR-celler. Resultaterne viste, at AR blev udtrykt 923 gange mere i AR-transficeret end i kontrol-transficerede PS30 celler. Som vist i figur 3B, ekspression af 6 i de øvrige 10 gener blev ændret på den samme måde som for de WPMY-AR celler behandlet med DHT, mens 4 af de 10 gener ikke var signifikant ændret mellem untreated- eller DHT-behandlede celler . Endelig er de primære humane prostata celle fibroblaster var også dyrket i medium med eller uden DHT i 72 timer og RNA’er blev ekstraheret for real-time qPCR analyse. CDNA’erne fra disse celler blev derefter analyseret for DHT virkninger på ekspression af 5 forskellige gener fra vores panel. Resultaterne viste, at SFRP5 og IGF1 blev opreguleret ved 1.67- til 1.73- gange ved DHT (p 0,05) og FGF5 blev nedreguleret med 1,5-fold (p 0,05) sammenlignet med ingen-DHT kontrol hvorimod udtryk for FST og Wnt16 ikke var væsentligt ændret af DHT behandling af disse celler.

Gene Expression ændringer i forbindelse med Overekspression af AR i WPMY-1 celler

for at afgøre, om AR udtryk (i fravær af ligand), der berøres genekspression i de WPMY celler sammenlignede vi også genekspressionsprofilerne mellem WPMY-Vec og WPMY-AR-celler dyrket uden DHT behandling. Bemærkelsesværdigt 443 gener fandtes at være differentielt udtrykt mellem disse celler i et niveau på 1,5 gange eller mere (fig. 2C) og 374 af disse gener udtrykkes forskelligt med 2 gange eller mere mellem disse celler. I denne sidstnævnte undergruppe, blev 55 gener selektivt opreguleres og 319 gener blev selektivt nedreguleret i AR-udtrykkende celler. Det var yderligere interesse for at bestemme, hvordan disse to kategorier af gener blev efterfølgende ramt af DHT behandling. Først valgte vi disse gener (55), der blev opreguleres ved overekspression af AR (mindst 2 gange) i fravær af DHT. Tres procent af disse gener (33 gener) blev efterfølgende nedreguleret (ved 2 gange eller mere) igen i nærvær af DHT (fig. 2D), mens den anden 40% var enten uændrede eller ændres mindre end 2 gange ved DHT og, derfor udelukket fra vores analyse. For de 319 gener, der blev nedreguleret ved 2-fold eller mere af AR overekspression alene blev 21 gener (6,58%) efterfølgende opreguleret med 2 gange eller mere ved tilførsel af DHT (figur 2E), hvorimod 21 gener (6,58%) var yderligere nedreguleret ved 2-fold eller mere ved tilførsel af DHT (figur 2F). De resterende gener i denne kategori (277 eller 86,8%) var enten uændrede ved tilsætning af DHT eller blev ændret mindre end 2 gange og udelukket fra vores analyse. Ingen gener opreguleret ved AR udtryk derefter yderligere opreguleres af DHT, selv i dem, der blev ramt af DHT 2 til 1,5 gange. Sammenfattende kan AR overekspression alene i fravær af ligand inducerer men hovedsagelig undertrykke ekspressionsniveauer gener i WPMY-1-celler, men disse effekter blev undertiden vendt i nærværelse af ligand. Der blev dog nogle genekspression forandringer som følge af AR overekspression (gen downregulations) yderligere forstærket af behandlingen med androgen ligand i disse celler.

Direkte eller indirekte forordning af gener ved DHT

Vi beskrev her ændrede mønstre af genekspression i prostata stromale celler induceret af AR overekspression, med eller uden ligand, som var baseret på målinger af mRNA-niveauer. Vi søgte yderligere at evaluere en lille delmængde af disse DHT-regulerede gener for at bestemme, om virkningerne af DHT påkrævet formidler proteinsyntese. Til dette formål trypsinbehandlet WPMY-AR-celler lodes binde natten over og derefter kortvarigt behandlet (30 min) med høj dosis cycloheximid (40 μgs /ml) for at blokere proteinsyntese og derefter skiftet til medium med eller uden DHT (10 nM) i tilstedeværelsen af ​​lavere dosis cycloheximid (10 μgs /ml) i 24 timer. Kontrolceller blev behandlet på samme måde bortset fra at ingen cyclohexmide var inkluderet på ethvert tidspunkt. RNA ekstraheret fra disse celler blev derefter vurderet for ekspression af udvalgte DHT-opreguleret (RERG, Wnt16 og SFRP5) eller DHT-nedreguleret (FST, FGF5 og BMP4) gener. Vores resultater (figur 4) viste, at DHT effekt på udtryk ændrer for fire af disse gener (RERG, WNT16, SFRP5, og FST) blev ikke ændret ved cycloheximid behandling, mens DHT virkninger på BMP4 og FGF5 udtryk blev blokeret af cycloheximid.

WPMY-AR-celler blev forbehandlet derefter behandlet med cycloheximid i fravær eller nærvær af 10 nM DHT i 24 timer. RNA’er blev analyseret ved qPCR for ekspressionen af ​​RERG, FST eller FGF5, som angivet og ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH ekspressionsniveauer.

Virkninger af DHT-stimuleret WPMY1-AR konditionerede medier på LNCaP-cellevækst

Endelig har vi forsøgt at teste om DHT indsats i de WPMY-AR model celler kan påvirke produktionen af ​​udskilte faktorer fra disse celler, der påvirker prostatakræft cellevækst. Tre dages konditioneret medium fra 10 nM DHT-behandlede WPMY-Vec eller WPMY-AR-celler blev fortyndet 1:01 med frisk medium (med 10 nM DHT) og blev derefter tilsat til frisk LNCaP-celler monolag, og cellerne blev fulgt i 9 dage med medium udskiftning hver 3. dag. Vækst i dette tidsrum blev målt ved anvendelse af WST-1 assay og resultaterne er vist i figur 5. Behandling med det konditionerede medium fra DHT-behandlede WPMY-AR-celler viste sig at være betydeligt mere vækst-stimulerende for LNCaP sammenlignet med behandling med konditioneret medium fra DHT-behandlede WPMY-Vec celler.

relative celletal på forskellige dage blev estimeret ved WST-1 analysen. Anvendelse af konditioneret medium fra DHT-behandlede WPMY-AR-celler stimuleret signifikant vækst (P 0,01, tovejs ANOVA) af LNCaP-celler sammenlignet med konditioneret medium fra DHT-behandlede WPMY-Vec celler. Skråninger af de to vækstkurver var også signifikant forskellige (P = 0,0181, lineær regressionsanalyse).

Diskussion

Ligesom andre væv, prostata består af en blanding af uensartet celletyper, som er stort set udskilt i en epitelial eller en stromal rum baseret på deres lokalisering med hensyn til basalmembranen. Prostata kræftceller, der er afledt af prostata epitel har historisk forudsat modellerne at studere, hvordan androgen handling påvirker prostata celle genekspression. Imidlertid er adskillige celletyper i prostata stroma også kendt for at udtrykke AR

in vivo

[22] – [24] og for at bidrage til processen (r), gennem hvilken androgener regulere prostata udvikling og sygdom alligevel ved vi meget lidt om virkningerne af androgen på genekspression i disse typer af celler. Indsatsen med henblik herpå er hæmmet af manglen på egnede dyrkede stromale celle modeller, især dem, der udtrykker AR på tilstrækkelige niveauer til at tillade brug af moderne masse genekspressionsprofilering teknikker. Her har vi forsøgt at karakterisere AR udtryk og androgen signalering aktivitet i to tilgængelige udødeliggjort prostata stromale cellelinjer, PS30 og WPMY-1, der tidligere blev rapporteret til at udtrykke AR [20], [25] for at vurdere, om de kan give modeller til at studere androgen reguleret genekspression. Disse celler er både klassificeret som myofibroblasts baseret på deres morfologi i kultur og deres co-ekspression af vimentin og glatmuskelactin. Vi fandt, at begge typer af celler udtrykker ekstremt lave niveauer af AR mRNA og protein og hverken celletype responderede på DHT behandling efter transfektion med en androgen-responsive luciferase reporter vektor så hverken er sandsynligvis en god model til undersøgelse af androgen reguleret genekspression. Men når androgen reporter vektoren blev cotransficeret med en vildtype AR ekspressionsvektor, WPMY-1-celler kunne derefter reagere på DHT behandling ved opregulering androgen-responsiv reporter ekspression. Dette resultat viste, at WPMY-1 celler kan gøres modtagelig for studiet af androgen reguleret genekspression når forsynet med eksogen AR. Transduktion af et antibiotikum-valgbar AR-udtryk lentivirus tilladt os derefter at udlede en stabil cellelinie, WPMY-AR, der udtrykte AR mRNA og protein på et niveau, der kan sammenlignes med LNCaP celler, der ofte bruges til at modellere en prostata kræftceller svar på androgener. De WPMY-AR-celler flyttet AR protein til kernen i nærvær af DHT og hensigtsmæssigt opregulere luciferase ekspression fra en androgen-regulerede reporter vektor efter DHT behandling identificere, at de har et funktionelt androgen signalsystem, der er konsistent med deres anvendelse i genekspressionsprofilering eksperimenter. Det var bemærkelsesværdigt, at de WPMY-AR celler var morfologisk uskelnelige fra forældre- eller kontrol transducerede (WPMY-Vec) celler, og at deres relative vækstrate (i nærvær eller fravær af androgen) blev ikke signifikant påvirket af AR overekspression, især da AR er kendt for at påvirke prostatakræft cellevækst, enten når det udtrykkes endogent eller exogent [26], [27].

WPMY-Vec og WPMY-AR celler blev derefter profileret for overordnede genekspressionsmønstre og for ændringer i disse mønstre forbundet med DHT behandling under anvendelse af et gen Chip microarray tilgang. Vores foreløbige indsats involveret en mere langvarig behandling med DHT (72 timer), end er almindeligt anvendt i studier af prostata kræftceller, men vi håbede, at dette længere behandlingsperiode også ville tillade detektion af potentielle sekundære genekspression ændringer, der kan være relevante for aspekter af krydstale mellem prostata stromale og epitelceller, der påvirker prostata udvikling eller prostatakræft cellevækst. For WPMY-Vec kontrolceller, DHT behandling signifikant ændret ekspression af kun 8 gener (ud af 28,712 gen probesæt på chippen), og disse ændringer var relativt lav, lige fra en 1.62- til 1,74-gange ændring sammenlignet med ubehandlede WPMY -Vec celler. Ingen af ​​disse genprodukter ændringer blev efterfølgende bekræftet ved hjælp af en real-time qPCR tilgang. Vi føler altså, at disse mindre ændringer i vores kontrolceller (+/- DHT) påvises under anvendelse af genet Chip microarray tilgang repræsenterer den “støj” i systemet, og at denne støj er ekstremt lav og let filtreres ved hjælp af den sekundære qPCR tilgang. I slående kontrast, behandling af WPMY-AR-celler med DHT ændret ekspressionen af ​​141 forskellige gener med 2 gange eller mere. Langt størstedelen af ​​disse ændringer (60,2%), der beskæftiger genekspression ned-regler i forbindelse med DHT behandling. I betragtning af at transskriptionelt aktiv (ligand) AR oftest er tænkt som en inducer af genekspression, er dette et bemærkelsesværdigt højt antal potentielt androgen-undertrykte gener. Imidlertid har AR /androgen undertrykt gener blevet beskrevet tidligere i prostatacancerceller [8] og en rapport, der beskriver virkningerne af androgen på genekspression i LNCaP-celler viste, at androgenbehandling undertrykkes næsten lige så mange gener som blev induceret i disse celler [9 ] så vores observation understøttes af observationer i andre prostata cellesystemer. Det var også interessant, at en sammenligning af vores DHT-skiftet stromal celle gen lister med allerede kendte androgen-regulerede gener samles på en hjemmeside ressource (https://argdb.fudan.edu.cn/index_info.php, [28] viste, at ca. 21% af de gener der er til stede på vores lister (tabel S1 og S2) er tidligere beskrevet som “androgen reguleret” baseret på adspurgte litteraturkilder hovedsagelig involverer studier af prostatacancerceller. tilstedeværelsen af ​​denne betydelig procentdel af tidligere beskrevne “androgen reguleret “gener på vores lister støtter tanken om, at vi identificerer mange gener, der kan være almindeligt reguleres af ligand-AR i mange typer af prostata celler samt gener, der selektivt kan berøres af AR /androgener i prostata stromaceller.

med hensyn til arten af ​​disse DHT-regulerede stromale celle gener, der var få, om nogen gener, der er funktionelt klassificeret som regulatorer af celleproliferative processer eller apoptose, og dette er i overensstemmelse med vores observationer, at androgen behandling ikke signifikant påvirker WPMY AR vækst. Vurderingen af ​​gen-funktion for de up-regulerede /ned-regulerede gener på vores lister baseret på Kegg vej betegnelse var bemærkelsesværdigt, da det identificerede en overvægt af gener, der er involveret i generiske “kræft veje”, som kan være relevante for vores resultater, som aircondition medium fra DHT-stimulerede WPMY-AR-celler påvirket LNCaP-cellevækst. Ligeledes tilstedeværelsen af ​​multiple gener på vores liste klassificeret som effektorer af cytokin-cytokin receptor signalering, TGF-β, WNT, hedgehog- eller MAP-kinase signalveje ville støtte tidligere offentliggjorte undersøgelser tyder på, at disse særlige signalveje er involveret i tvær- talk, der opstår mellem prostata stromale og prostata epitel /cancerceller i udvikling eller sygdom [29] – [31]. Kategorisering af gener på listen baseret på Gene ontologi (GO) opgaver blev også gøres ved hjælp af DAVID programmet og resultatet viste lignende kategorier til dem tildelt under Kegg Pathway (ikke vist). Endelig vores begrænsede undersøgelse for en effekt af cycloheximid på DHT-induceret gen ændringer gør støtter idéen om, at mange af de gen-ændringer, vi observerede primært forbundet med AR funktionel aktivitet. Men vores evne til at identificere nogle DHT-ramte gener i WPMY-AR celler, der ikke blev ændret, da cycloheximid blev inkluderet med DHT behandling viser også, at der er gener på vores lister, der er sekundært reguleret af en anden protein påvirket af DHT, som vi mistænkte. Anvendelse af WPMY-AR celler med en kortere periode med DHT behandling kan hjælpe os med at sortere ud den primære påvirket vs de sekundære berørte gener, og vi vil forsøge dette i fremtiden.

For valideringsformål, vi havde valgt et panel