PLoS ONE: Død Receptor-induceret apoptose Signalering forordning ved Ezrin Er Cell type Afhængige og forekommer i en DISC-uafhængig måde i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Ezrin hører til ERM (ezrin-radixin-moesin) proteinfamilie og er blevet påvist at regulere tidlige trin i Fas-receptor signalering i lymfoide celler, men dets bidrag til TRAIL-induceret celledød regulering i adhærente cancerceller forbliver ukendt. I denne undersøgelse rapporterer vi, at regulering af FasL og TRAIL-induceret celledød ved ezrin er celletype afhængig. Ezrin er en positiv regulator af apoptose i T-lymfom cellelinie Jurkat, men en negativ regulator i colon cancerceller. Brug ezrin fosforylering eller actin-bindende mutanter, giver vi dokumentation for, at negativ regulering af døden receptor-induceret apoptose ved ezrin sker i en cytoskeleton- og DISC-uafhængig måde, i tyktarmen kræftceller. Bemærkelsesværdigt blev inhibering af apoptose induceret af disse ligander fundet at være tæt forbundet med regulering af ezrin phosphorylering på serin 66, tumorsuppressorgenet WWOX og aktivering af PKA. Mangel på WWOX udtryk i leverkræft SK-HEP1 eller pancreas Mia PaCa-2 cellelinjer samt WWOX dæmpning eller modulering af PKA-aktivering af farmakologiske regulatorer, i coloncancercellelinie SW480, ophævede reguleringen af ​​TRAIL signalering ved ezrin. Tilsammen vores resultater viser, at døden receptor pro-apoptotisk signalering regulering af ezrin kan forekomme nedstrøms for DISC i tyktarmen kræftceller

Henvisning:. Iessi E, Zischler L, Etringer A, Bergeret M, Morle A, Jacquemin G et al. (2015) Død receptor-induceret apoptose Signalering forordning ved Ezrin Er Cell type Afhængige og forekommer i en DISC-uafhængig måde i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 10 (5): e0126526. doi: 10,1371 /journal.pone.0126526

Academic Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, UNITED STATES

Modtaget: Januar 7, 2015; Accepteret: April 3, 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Iessi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det Europæiske Fællesskab (ApopTrain Marie Curie RTN), programmet “Investissements d’Avenir” med henvisning ANR-11-LabX -0021-01-LipSTIC LABEX, University of Bourgogne, Conseil Régional de Bourgogne, Inca (Institut National du Cancer, polynom-174), den Cancéropôle Grand-Est, Ligue nationale contre le Cancer, ARC (Association pour la Recherche sur le Cancer), og Ministeriet for forskning og uddannelse. EI, SS, LZ og AM blev støttet af stipendier fra Marie Curie RTN, Inca, CAPES (N ° BEX4938 /14-3) og Ligue Nationale Contre le Cancer hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

TNF-relaterede apoptoseinducerende ligand (TRAIL eller Apo2L) inducerer celledød i en bred række af cancerceller, men ikke i normale celler. Denne ejendommelighed gør trail og TRAIL derivater innovative og lovende terapeutiske midler mod maligne sygdomme. TRAIL udløser celledød ved binding til to transmembrane agonistiske receptorer: TRAIL-R1 (DR4) [1-3] og TRAIL-R2 (DR5) [1, 2, 4, 5], indeholder i deres intracellulære område en dødsdomænet (DD ), hvilket er afgørende for at udløse apoptose. Aktivering af TRAIL-R1 /TRAIL-R2 tillader rekruttering af adapteren proteinet FADD og proformer af caspase-8 og -10 til dannelse af det makromolekylære kompleks kaldet DISC (Død-inducerende Signalering Complex) [6]. I dette komplekse, er Caspase-8 og -10 aktiveres af auto-proteolytisk spaltning og frigives i cytosolen tillader aktivering af effektorceller caspaser [7].

Ligesom TRAIL-receptorer, Fas, også opfundet CD95 eller APO-1 , signalerer apoptose gennem dannelsen af ​​en DISC [8]. Eksperimentelt bevis indikerer, at Fas binding til actincytoskelettet gennem ezrin primer humane CD4 + T-lymfocytter for Fas-medieret apoptose [9, 10]. CD4 T-celleaktivering, gennem enten HIV-1 gp120 eller IL-7, gør CD4 T-celler udsat for Fas-medieret apoptose gennem ezrin-Fas binding og derfor til apoptose af bystander uinficerede T-celler i AIDS-patienter [11, 12]. I T lymfomer såsom Jurkat-celler blev ezrin vist at binde Fas, og at være nødvendig for celledød udløsning [13]. Men ezrin blev også foreslået, i en anden undersøgelse, at inhibere trail og Fas-ligand-induceret celledød i T celle lymfomer [14].

Ezrin er medlem af ezrin, radixin, moesin (ERM) familie af proteiner, der linker forskellige integrale membranproteiner til actincytoskelettet [15]. ERM proteiner er sædvanligvis til stede i cytoplasmaet i en inaktiv /lukket form, hvis det aminoterminale membranprotein-bindende domæne (FERM eller N-ERMAD domæne) er maskeret på grund af sin forbindelse med carboxylgruppen, actin-bindende domæne (C -ERMAD). ERM aktivering foreslås at ske gennem phosphorylering og binding af phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP

2) [16].

Phosphorylering af ezrin på threonin 567 inducerer en overgang til den åbne /aktive form, som korrelerer med dets rekruttering til plasmamembranen, hvor det binder membranmolekyler. Andre phosphoryleringssteder på ezrin er blevet beskrevet. Phosphorylering på tyrosin-rester 145 og 353, f.eks som reaktion på epidermal vækstfaktor, fremmer overlevelse [17] og epitheldifferentiering [18]. Src-medieret ezrin phosphorylering på tyrosin 145 forøger adhæsion af epitelceller til ekstracellulære matrix [19], mens phosphorylering af serin 66 af proteinkinase A (PKA) er forbundet med syresekretion i gastriske celler [20].

vi her yderligere at undersøge funktionen af ​​ezrin i TRAIL-vejen. Vi viser, at ezrin fosforylering på serin 66 selektivt bidrager til TRAIL-induceret celledød regulering nedstrøms for TRAIL DISC i tyktarmen kræftceller.

Materialer og metoder

ligand produktion og antistoffer

Flag-tagget rekombinant opløselig human TRAIL, His-mærket TRAIL og Fas-ligand blev fremstillet og anvendt som tidligere [21] beskrevne. Anti-Flag (M2), 8-brom-cyklisk AMP, forskolin og orthovanadat blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Lyon, Frankrig). PKA-inhibitor, H89 var fra Cayman (Interchim, Montluçon, Frankrig). Til Western blot-analyse blev anti-TRAIL-R1 og anti-TRAIL-R2-antistoffer købt fra Chemicon (Millipore, Molsheim, Frankrig), anti-FADD, anti-phospho-ezrin (Thr567) og anti-moesin blev opnået fra Transduction Laboratories (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrig), anti-caspase-8 og anti-caspase-10 var fra Medical Biologisk Laboratories (Clinisciences, Montrouge, Frankrig). Antistoffer mod phospho-ezrin (Thr567) /radixin (Thr564) /moesin (Thr 558), phospho-PKA Substrat (RRXS * /T *) (100G7E), phospho- (Ser) PKC Substrat (P-S3-101), phospho-CREB (Ser133) (87G3) og den aktive spaltede fragment af caspase-3 og caspase-9 var fra Cell Signaling (Ozyme). Anti-radixin, caspase-2, GAPDH og HSC-70 var fra Santa Cruz Biotechnology (Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, Frankrig). Anti-actin, anti-ezrin og anti-VSV-glycoprotein-antistoffer blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Lyon, Frankrig). Til flowcytometri eksperimenter blev anti-Bax fås fra BD Biosciences. Det sekundære antistof var en Alexa-488-koblet gede-anti-muse fra Molecular Probes (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig). For immunopræcipitation blev anti-ezrin (klon 3C12), anti-FLAG (M2) og anti-VSV-glycoprotein (P5D4) antistoffer indkøbt fra Sigma-Aldrich Anti-TRAIL-R1 (WB-S26) og anti-TRAIL-R2 ( B-D37) antistoffer blev leveret af Gen-Probe (Diaclone, Besançon, Frankrig).

Cell kultur

HCT116 (human colon carcinoma), SW480 (human colon adenocarcinom), SK- HEP-1 (humant hepatocellulært carcinom), og Mia Paca-2-cellelinier blev dyrket med høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (Lonza, Levallois-Perret, Frankrig) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Lonza) og penicillin /streptomycin ( 100 ug /ml af hver). PANC-1 (humant pancreatisk carcinom) celler blev dyrket i RPMI 1640 som ovenfor. Alle cellelinier blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C.

Plasmidkonstruktion

VSV-mærkede ezrin WT blev subklonet fra pEGFP-N1-vektoren (Invitrogen) til PCR- 3 (Invitrogen). Mutationer S66A, S66D, Y145F, Y145D, Y353F, Y353D, T567A, T567D, R579A blev skabt ved standard PCR metoder og et site-directed mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA) i henhold til producentens manual (se S1 Tabel til primer beskrivelse). Den S66D, Y145D, Y353D, T567D blev skabt for at efterligne fosforyleret ezrin, mens S66A, Y145F, Y353F blev T567A genereret som nonphosphorylatable ezrin. VSV-tagged ezrin mutanter blev subklonet i pMSCV-puro ekspressionsvektor som HindIII /XhoI-fragmenter. Alle konstruktioner blev bekræftet ved sekventering.

Retrovirus produktion og celle transduktion

retroviral vektor pMSCV-puro udtryk og generering af virus er blevet beskrevet tidligere [22]. HCT116, SW480, MIA PACA-2 og SK-HEP-1-celler blev inficeret i 16 timer med virale supernatanter indeholdende 8 ug /ml polybren (Hexadimethrin bromid fra Sigma-Aldrich), vasket i phosphatpufret saltvand fra Lonza (PBS), og dyrket i komplet medium indeholdende 2,5 ug /ml puromycin fra InvivoGen.

Måling af cellelevedygtighed

i 96-brønds plader, 50 000 celler blev inkuberet ved 37 ° C i 24 timer med stigende koncentration hans-TRAIL (fra 0 til 10 000 ng /ml) eller i 48 timer med stigende koncentration af CDDP (fra 1 til 1000 uM). Cellelevedygtighed blev bestemt ved methylenblåt [22].

Hoechst analyse

Celler, behandlet og ubehandlet med His-TRAIL eller FasL, blev inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. Alternativt celler forbehandlet eller ikke i 30 minutter med 100 uM H89, 1 eller 100 uM forskolin eller i 20 minutter med 4 mM 8-brom-cyklisk AMP (8B), efterfulgt af TRAIL (100 eller 500 ng /ml for 6 timer) eller Fas-ligand (100 ng /ml for 6 timer), blev inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. Apoptose blev vurderet ved Hoechst farvning ved at bestemme procentdelen af ​​kondenseret og fragmenterede kerner fra mindst 300 celler pr betingelser. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

APO 2.7 farvning

Celler, behandlet og ubehandlet med His-TRAIL eller FasL, forbehandlet eller ikke med 10 pM H89 blev permeabiliseret (PBS, FCS 2,5% og digitonin 100 ug /ml) i 10 minutter ved 4 ° C og farvet med et PE-konjugeret 2.7A6A3 antistof (Beckman Coulter), som genkender APO2.7 mitokondrielle membranprotein eksponeret på et tidligt stadium på celler, der undergår apoptose. I alt blev 10 000 arrangementer analyseres ved hjælp af en FACScalibur flowcytometer (BD Biosciences).

Immunopræcipitationer

For TRAIL DISC analyse, 10

8 celler blev stimuleret med 5 pg flag- TRAIL tværbundet med 10 ug anti-Flag M2 i 1 ml medium i de angivne tidsrum ved 37 ° C. Celler blev derefter vasket med kold phosphat saltvandspuffer (PBS) og lyseret i 1 ml lysepuffer indeholdende 1% NP40, 20 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCI og 10% glycerol og proteinase inhibitor cocktail. Lysater blev præ-clearet med Sepharose 6B (Sigma-Aldrich), og immunpræcipiteret natten over ved 4 ° C med protein G-sepharoseperler (Amersham Biosciences, Les Ullis, Frankrig). For TRAIL receptor eller GAPDH immunopræcipitationer blev celler stimuleret som beskrevet ovenfor med 5 ug /ml His-TRAIL. I begge tilfælde blev celler lyseret i NP40-holdig lyseringsbuffer. Celleekstrakter blev klaret og immunopræcipiteret ved anvendelse af 5 ug tilsvarende antistoffer. Perlerne blev derefter vasket fire gange med lyseringsbuffer, og immunpræcipitater blev elueret i loadingpuffer (Tris-HCI 63 mM, SDS 2%, phenolrødt 0,03%, glycerol 10% og DTT 100 mM pH 6,8), kogt i 5 minutter og forarbejdet til immunblotting.

Western blotting

Immunpræcipitater eller cellelysater blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Uspecifikke bindingssteder blev blokeret ved inkubation i PBS indeholdende 0,05% Tween 20 og 5% mælkepulver. Membraner blev derefter inkuberet med et specifikt primært antistof efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof, og blev udviklet af forøget kemiluminescens fremgangsmåden ifølge fabrikantens protokol (Pierce, Rockford, IL, USA).

Analyse af Bax aktivering ved flowcytometri

Celler, behandlet eller ubehandlet med His-TRAIL, blev fikseret med 4% PFA, permeabiliseret (PBS, BSA 1% og saponin 0,1%) i 10 minutter ved stuetemperatur og farvet med et anti -Bax antistof, som genkender den aktive N-terminale form af Bax (klon 6A7, BD Biosciences). 10 000 arrangementer blev analyseret ved hjælp af en FACScalibur flowcytometer (BD Biosciences).

Statistisk analyse

For in vitro studier, blev forskellene bestemmes enten med to-vejs gentagne-foranstaltninger variansanalyse (ANOVA ) med Bonferroni multiple sammenligningstest eller ved Students t-test, anvendelse af Prism 5.0a software (GraphPad software, San Diego, CA, USA). Et signifikansniveau på * P 0,05, ** P 0,01 eller *** P 0,001 blev antaget for alle tests

Resultater

Ezrin er en negativ regulator af Fas og trail. induceret celledød

Ezrin og moesin blev tidligere påvist at være positive regulatorer af Fas-induceret celledød via deres evne til at interagere med Fas-receptor i lymfoide T-celler [9, 13]. Følgelig ezrin og moesin silencing i Jurkat-celler inhiberede signifikant FasL-induceret apoptose, og ligeledes inhiberede apoptose induceret af TRAIL (S1 Fig). Rolle ezrin i regulering Fas- og TRAIL-induceret apoptose blev derpå evalueret i colon carcinomceller. Ezrin blev enten stabilt overudtrykkes (Fig 1A og 1B) eller tavshed ved hjælp siRNA (Fig 1C og 1D) i HCT116 og SW480-celler og apoptose-induceret ved TRAIL eller Fas-ligand blev vurderet ved Hoechst-farvning. Ektopisk ekspression af Ezrin betydeligt svækket Fas ligand- og TRAIL-induceret celledød i de to cellelinjer (Fig 1A og 1B). Følsomhed over for apoptose induceret af staurosporin, en PKC-inhibitor kendt for at inducere mitokondrie aktivering, blev imidlertid ikke ændret i disse celler (fig 1A og 1B). I overensstemmelse med disse resultater, ezrin lyddæmpning steg både FasL- og TRAIL-induceret apoptose (fig 1C og 1D).

(A) HCT116 eller (B) SW480-celler, der udtrykker eller ikke VSV-ezrin blev behandlet i 6 timer med Fas-ligand (100 ng /ml) eller His-TRAIL (500 ng /ml) eller 16 timer med 1 uM staurosporin (STS). Apoptose blev kvantificeret ved Hoechst-farvning. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af mindst tre forskellige eksperimenter. (* P 0,05; ** P 0,01 respektiv med kontrolceller). Ezrin ektopisk ekspressionsniveauer blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af et anti-VSV-antistof i kontrol- eller ezrin WT-udtrykkende HCT116 og SW480 celler. Hsc70 blev anvendt som en loading kontrol. (C) HCT116 eller (D) SW480-celler, blev transficeret ezrin eller scramble (SCR) siRNA’er. 72 timer efter transfektion blev celler stimuleret i 6 timer med Fas-ligand (100 ng /ml) eller His-TRAIL (500 ng /ml) og apoptose blev kvantificeret efter farvning med APO2.7 antistof ved flowcytometri. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af mindst tre forskellige eksperimenter. (* P 0,05; ** P 0,01 respektiv med kontrolceller). Ezrin ekspressionsniveauer blev analyseret ved immunblotting. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (E) Analyse af TRAIL DISC formation. HCT116 og SW480-celler blev stimuleret eller ikke med 5 ug /ml Flag-TRAIL tværbundet med 10 ug /ml anti-FLAG (M2) -antistof. Cellerne blev lyseret, og skiven blev immunopræcipiteret og analyseret ved western blot. En af tre uafhængige forsøg er vist. (F) HCT116 celler blev stimuleret eller ikke med 5 ug /ml His-TRAIL i 20 og 60 minutter. Efter cellelyse blev GAPDH antistof til cellelysaterne og immunopræcipitater blev analyseret ved western blot.

Ezrin ikke rekrutteres i TRAIL DISC

Siden ezrin har vist sig at være en del af Fas DISC i lymfoide celler [13, 14], næste kontrolleres vi, om ezrin blev ansat i TRAIL DISC i tyktarmen kræftceller. HCT116 eller SW480 celler blev efterladt ustimulerede (CTL og 0) eller stimuleret med 1 ug /ml rhFlag-TRAIL tværbundet med 2 ug /ml M2 i 15, 20, 30 eller 60 minutter. Efter stimulering blev cellerne lyseret, og DISC blev immunpræcipiteret, hjælp sepharose-protein G-perler. Kontrol immunopræcipitation blev også udført ved anvendelse af et irrelevant antistof (CTL) i ikke-stimulerede celler. Som vist Fig 1E, TRAIL stimulering induceret DISC dannelse som det fremgår af rekrutteringen af ​​adapteren protein FADD samt initiativtager caspase-8 og -10 til trail receptorer. Rekruttering af ezrin blev imidlertid ikke konsekvent iagttaget i TRAIL DISC, selv efter selektiv immunfældning af enten TRAIL-R1 (S2 Fig) eller TRAIL-R2 (S3 Fig). For at kontrollere muligheden for, at ezrin pull-down kan være uspecifikke, ikke et protein relateret til TRAIL eller Fas-vejen blev immunpræcipiteret i celler stimuleret med en anden version af TRAIL, RH-His-TRAIL, en ligand i stand til at inducere apoptose i fravær af M2 tværbinding. Immunopræcipitering af GAPDH trukket ned tilsvarende mængder af ezrin, moesin og actin fra ikke-stimulerede celler, men i mindre grad fra lysater opnået fra TRAIL stimulerede celler (Fig 1F). Tilsammen disse resultater argumentere imod en fysiologisk funktion for ezrin på DISC niveau i tyktarmen kræftceller.

Ezrin fosforylering modulerer TRAIL-induceret celledød

Regulering af ezrin fosforylering blev foreslået at redegøre for sin evne at interferere med Fas signalering [13, 23]. Ligesom FasL, TRAIL inducerede en stigning i ezrin phosphorylering på threonin 567 i SW480-celler (fig 2A). Som det fremgår efter ezrin immunfældning, en stigning i ezrin tyrosin 145 og serinrester phosphorylering blev også fundet efter TRAIL stimulation (Fig 2B). På den anden side blev imidlertid fundet phosphorylering af ezrin tyrosin 353 blive reduceret en smule i celler stimuleret med TRAIL, men i mindre udstrækning end celler stimuleret med FasL (Fig 2B).

(A) immunoblotanalyse af phospho-ezrin (Thr567) ekspressionsniveauerne i SW480 celler efter stimulering med His-TRAIL, Fas ligand eller orthovanadat (NAV). Andel af relativ phospho-Ezrin (Thr567) intensiteter blev bestemt som følger: intensiteten af ​​specifikt bånd i stimulerede celler divideret med den normaliserede intensitet af stimulerede celler, normaliseret til hsc70. (B) SW480-celler blev stimuleret med 500 ng /ml His-TRAIL eller 100 ng /ml Fas-ligand i 15 minutter eller venstre ubehandlet. Efter cellelysis i NP40-holdige puffer, blev ezrin immunopræcipiteret med et anti-ezrin antistof (klon 3C12). Niveauet af ezrin phosphorylering blev bestemt ved Western blot under anvendelse af anti-phospho-ezrin målretning tyrosiner 353 og 145, anti-phospho-ERM anerkender phosphoryleret-ezrin på threonin 567, -moesin på threonin 558 og-radixin på threonin 564 og et anti pan phosphoserin. (C) Skematisk gengivelse af ezrin domæner og phosphorylering sites inden for proteinet. (D) SW480 celler blev inficeret med en tom pMSCV retroviral vektor (Mock) eller med en pMSCV vektor kodning ezrin WT, ezrin S66A, ezrin S66D, ezrin Y145F, ezrin Y145D, ezrin Y353F, ezrin Y353D, ezrin T567A, ezrin T567D og ezrin R579A. Ekspressionsniveauer af ezrin konstruktioner blev bestemt ved immunoblot fra NP40 celleekstrakter under anvendelse af et anti-VSV-antistof. Actin blev anvendt her som en loading kontrol. De viste data repræsenterer tre uafhængige forsøg. (E) De valgte celleekstrakter opnået efter lysis i SDS blev analyseret ved immunblot som ovenfor. (F) Effekt af ezrin WT og ezrin phosphomutants ektopisk ekspression på TRAIL-induceret celledød i SW480-celler. Celler blev stimuleret med TRAIL 500 ng /ml i 6 timer. Apoptose blev målt ved APO2.7 farvning ved flowcytometri. (G) Cell levedygtighed i SW480 celler, der udtrykker ezrin S66A, ezrin S66D eller ezrin R579A sammenlignet at håne inficerede celler blev evalueret ved methylenblåt assay 24 timer efter behandling ved hjælp af stigende koncentrationer af His-TRAIL. (H) Procent inhibitoriske TRAIL koncentrationskurver, i ng /ml, fra SW480 celler, der udtrykker ektopisk de angivne ezrin mutanter blev opnået ved methylen blåfarvning 16h efter en stigning His-TRAIL koncentrationer. Tilsvarende IC25, IC50 og IC90, inducerende 25, 50 og 90% celledød, blev opnået ved anvendelse CompuSyn. Data repræsenterer gennemsnit ± SD af mindst 3 uafhængige forsøg. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 respektive til Mock kontrol celler

For at afgøre, om ezrin fosforylering [19, 20, 24] påvirker TRAIL signalering, vi næste genereret flere phosphoryleringsbegivenheder mutanter koder nonphosphorylatable varianter eller pseudophosphorylated varianter af ezrin, på serin 66, threonin 567 og tyrosin 145 og 353 steder ved mutagenese (fig 2C). Ud over disse phosphoryleringsbegivenheder mutanter, en ezrin mutant defekt i F-actin binding, blev ezrin R579A genereret til bestemmelse af rollen af ​​actincytoskelettet i ezrin-medieret TRAIL inhibering [25]. Infektion af SW480-celler med en retroviral vektor, der koder disse konstruktioner førte til variable men væsentlige ekspressionsniveauer af ezrin mutanter (fig 2D), med undtagelse af den nonphosphorylatable variant Y145F, der var mest udtrykt i den uopløselige fraktion (fig 2E). Interessant mest ezrin mutanter forringet trail (fig 2F) og Fas-ligand-induceret apoptose (S4 Fig). Bemærkelsesværdigt, den nonphosphorylatable variant S66A betydeligt og selektivt forøget apoptose induceret af TRAIL mens pseudophosphorylated variant S66D demonstreret overlegen beskyttende virkning i forhold til ezrin WT og at håne celler (Fig 2F og 2G). Ændring af S66 phosphorylering imidlertid ikke at regulere ezrin-medieret FasL-induceret apoptose inhibering (S4 Fig). Ligesom WT ezrin, det actinbindende deficient mutant R579A inhiberede apoptose induceret af FasL og TRAIL (Fig 2F og S4 Fig), hvilket antyder, at inhibering af apoptose induceret af død receptor ezrin i kolon kræftceller kan forekomme uafhængigt af cytoskelettet-bindende egenskaber af ezrin. Ændring af ezrin phosphorylering på serin 66 synes at være langt den vigtigste begivenhed kontrollerende ezrin evne til at inhibere TRAIL signalering.

I forhold til parentale celler, i hvilke omkring 200 ng /ml TRAIL er nødvendige for at inducere celledød i 50% af cellerne, ezrin WT eller R579A mutante udtrykkende celler viste en IC50 på 260 og 380 ng /ml, mens IC50 i S66A udtrykkende celler var mindre end 40 ng /ml og den for S66D nåede 850 ng /ml (fig 2G ). Med andre ord, regulering af ezrin fosforylering på S66 modulerer TRAIL-induceret celledød følsomhed ved en størrelsesorden fra 0,2 til mere end fire gange i forhold til forældrenes celler (Fig 2H og S2 Table, for IC% værdier).

ezrin inhiberer TRAIL-induceret celledød nedstrøms for TRAIL DISC

Analyse af caspase-8 og caspase-10-aktivering i cellelysater opnået fra SW480 celler, der udtrykker enten ezrin WT, R579A, S66A eller S66D, stimuleret med stigende koncentrationer af TRAIL, afslørede, at TRAIL DISC forbundet initiator-caspaser blev aktiveret på lignende måde, uanset ezrin mutant (fig 3A). På den anden side, blev aktivering af caspase-9 og caspase-3 lidt forøget i ezrin S66A udtrykkende SW480-celler og konsekvent reduceret i SW480 celler, der udtrykker ezrin WT, ezrin S66D og ezrin R579A, som Jugged fra de tilsvarende spaltede produkter (fig 3A) . Endvidere TRAIL DISC-dannelse blev hverken ændret ved ektopisk ekspression af ezrin S66A, eller S66D mutanter (fig 3B), og ingen af ​​ezrin mutanten, som vi har testet indtil nu var i stand til at ændre TRAIL-R1 eller TRAIL-R2 ekspressionsniveauer (S5 fig), hvilket indikerer, at ezrin-lovgivning forekommer nedstrøms TRAIL DISC, sandsynligvis på niveau med mitokondrierne. Støtte denne konklusion blev den konstatering, at Bax-aktivering som respons på 200 ng /ml TRAIL stimulation faldet fra 45% til 30% i celler, der udtrykker ezrin WT eller ezrin S66D sammenlignet med mocktransfekterede celler (Fig 3C), hvorimod, aktivering af Bax i S66A ezrin udtrykkende celler nåede næsten 57% af cellerne efter stimulering (figur 3C).

(A) Immunoblotanalyse af caspaseaktivering, i SW480-celler udtrykker enten ezrin S66A, S66D, R579A eller WT, 16 eller 6 timer efter His-TRAIL (20 eller 200 ng /ml) stimulering, hhv. (B) Analyse af TRAIL DISC dannelse i SW480 celler, der udtrykker enten S66A, S66D eller WT ezrin. Celler blev stimuleret med 5 ug /ml Flag-TRAIL tværbundet med 10 ug /ml anti-FLAG (M2) -antistof. Efter cellelyse blev DISC immunopræcipiteret og analyseret ved western blot. (C) Analyse af Bax-aktivering. Ezrin S66A, S66D, WT og fingeret inficerede SW480 celler blev efterladt ubehandlet eller stimuleret med His-TRAIL (20 eller 200 ng /ml) i 16 timer, derefter permeabiliseret og farvet med et antistof, der genkender aktiv Bax inden analyse ved flowcytometri. Virkningen af ​​to forskellige koncentrationer af TRAIL (20 eller 200 ng /ml, grå og sorte linjer, henholdsvis) blev sammenlignet med ikke-stimulerede celler (grå fyldt kurve). Procentdelen af ​​celler, der indeholder aktive Bax efter TRAIL stimulering vises (øvre og nedre værdi, henholdsvis).

Ezrin-medieret TRAIL regulering er forbundet med WWOX

Protein kinase A har været vist sig at mediere phosphoryleringen af ​​ezrin på serin 66 [20]. Ligesom forskolin, en aktivator af PKA, TRAIL induceret aktivering af PKA, men også PKC, som det fremgår ved anvendelse af antistoffer, der genkender PKA og PKC-substrater (Fig 4A og 4B). I overensstemmelse med PKA-aktivering, phosphorylering af CREB på serin 133 steget i dosis og tid afhængig måde i disse celler (fig 4B), og farmakologisk modulation af PKA i SW480-celler phenocopied regulering af TRAIL-induceret apoptose af S66 ezrin mutanter (fig 4C og 4D). Ligeledes inhibering af PKA, ved anvendelse af inhibitoren H89, efterlignede virkningerne af ezrin S66A ekspression, om end i mindre grad, og øget TRAIL-induceret apoptose, mens aktivering af PKA hjælp forskolin eller 8-Bromoadenosine 3 ‘, 5’ cyklisk monophosphat (8B), reduceret TRAIL-induceret apoptose i SW480-celler (fig 4C og 4D). Det skal her bemærkes, at i overensstemmelse med resultater opnået med ezrin serin 66 phosphoryleringsbegivenheder mutanter og dens stærkeste evne til at udløse PKA-aktivering (Fig 4B), Fas ligand-induceret celledød i modsætning til TRAIL, blev ikke signifikant ændret ved farmakologiske PKA regulatorer (Fig 4C og S6 fig). PKA-induceret phosphorylering af ezrin på S66 er blevet vist at regulere dets interaktion med WWOX (WW-domæne-holdige oxidoreduktase) [26], en tumor-suppressor protein [27], som regulerer apoptose induceret ved det mitokondrielle niveau [28]. Interessant, hvorimod begge coloncarcinom cellelinier SW480 og HCT116 udtrykke WWOX, to pancreatiske cellelinjer, MIA PaCa-2 og PANC-1 samt SK-HEP-1 leverkræft cellelinje (figur 5A) ikke, og ektopisk ekspression af ezrin til vægt i MIA PaCa-2 eller SK-HEP-1 mislykkedes at regulere apoptose induceret af FasL eller TRAIL (fig 5B). Desuden hverken S66A eller S66D Ezrin mutanter, der i SW480 celler udviser den mest slående lovgivningsmæssige fænotype, moduleret apoptose induceret af TRAIL (Fig 5C). På den anden side, WWOX inaktivering inhiberede apoptose induceret af TRAIL både i Mock og S66A SW480 udtrykkende celler, men ikke i celler, der udtrykker S66D (Fig 5D). Disse resultater antyder, at virkningen af ​​ezrin i dødsreceptor apoptose er mest sandsynligt indirekte og at reguleringen af ​​ezrin phosphorylering på serin 66 af PKA er sandsynligt at målrette WWOX pro-apoptotisk potentiale, forklarer i det mindste delvis ezrin evne til at kontrollere apoptose induceret ved dødsreceptorer.

(A) Parental SW480-celler blev stimuleret i 30 minutter med forskolin og celleekstrakter blev analyseret ved immunblot under anvendelse af selektive PKA eller PKC substrat antistoffer, såvel som et anti-phospho-S133 CREB antistof. (B) Parental SW480-celler blev analyseret som ovenfor efter stimulering med TRAIL eller FasL som angivet for 15 til 120 minutter. (C) Parental SW480-celler blev forbehandlet eller ikke i 30 minutter med angivne koncentrationer af forskolin, efterfulgt af 6 timers stimulation med 100 eller 500 ng /ml FasL eller TRAIL. Apoptose blev kvantificeret ved Hoechst-farvning. (D) Parental SW480-celler blev forbehandlet eller ikke i 30 minutter med 100 uM H89 eller 20 minutter med 4 mM 8B, efterfulgt af 6 timers stimulation med 100 eller 500 ng /ml TRAIL. (C og D) Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre forskellige eksperimenter. (** P 0,01; *** P 0,001 respektive at kontrollere eller H89 stimulerede celler ns står for ikke statistisk relevant)

(A) WWOX ekspressionsniveauerne i angivne cellelinjer blev analyseret. ved immunoblot. Hsc70 blev anvendt her som en loading kontrol. (B) VSV-ezrin WT blev udtrykt ektopisk i WWOX-deficiente celler SK-HEP-1 og MIA PaCa-2. Ekspressionsniveauer blev analyseret ved immunblot og apoptose i de tilsvarende cellelinier efter FasL (100 ng /ml) eller TRAIL (500 ng /ml) stimulering blev analyseret ved Hoechst-farvning. (C) S66A og S66D Ezrin mutanter blev udtrykt i MIA PaCa-2. Ekspressionsniveauer blev analyseret ved immunblot som ovenfor og celle følsomhed over for TRAIL-induceret celledød blev kvantificeret ved methylenblåt. (D) SW480 celler, der udtrykker enten ezrin wt eller ezrin S66A eller S66D blev transficeret med scramble (SCR) eller WWOX (WOXX) si-RNA’er i 4 timer og følsomhed over for apoptose induceret af TRAIL blev kvantificeret ved Hoechst-farvning. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af mindst tre forskellige eksperimenter. (** P 0,01; * P 0,05 respektive til Scr siRNA transfekteret celler ns står for ikke statistisk relevant).

Diskussion

Mens bidrag ezrin i Fas-signalering er blevet grundigt undersøgt, lidt er kendt om TRAIL, med undtagelse af en nylig undersøgelse, hvor ezrin blev foreslået at forringe både Fas ligand- og TRAIL-induceret celledød i tumoren T-celle lymfom cellelinie H9 [14]. I denne undersøgelse blev ezrin foreslået at inhibere død receptor-medieret celledød i type I celler, som er uafhængige af den mitokondrielle pathway, men ikke i type II-celler [14], der er afhængige af mitokondrierne [29]. I vores hænder, ezrin negative regulerende funktion var ikke strengt begrænset til type I celler, da Fas ligand- og TRAIL-induceret celledød blev hæmmet af ezrin overekspression både SW480 og HCT116 celler, betragtes som type I og type II.

Ezrin-medieret TRAIL-induceret celledød forordning var hverken relateret til ændringer i TRAIL DISC komponent rekruttering eller til differential aktivering af initiator caspaser i DISC, herunder caspase-8.