PLoS ONE: dipeptidylpeptidase IV Aktivitet er korreleret med kolorektal cancer Prognosis

Abstrakt

Baggrund

dipeptidylpeptidase IV (EF 3.4.14.5) (DPPIV) er en serin peptidase involveret i celledifferentiering, adhæsion, immunmodulation og apoptose, funktioner, som styrer neoplastisk transformation. Tidligere undersøgelser har vist ændret ekspression og aktivitet af væv og cirkulerende DPPIV i flere kræftformer og foreslog sin potentielle nytte til tidlig diagnosticering i kolorektal cancer (CRC).

Metoder og vigtigste resultater

aktivitet og mRNA og protein ekspression af DPPIV blev prospektivt analyseret i adenocarcinomer, adenomer, uengagerede colorectal slimhinde og plasma fra 116 CRC patienter ved fluorimetrisk, kvantitativ RT-PCR og immunohistokemiske metoder. Resultaterne blev korreleret med de vigtigste klassiske patologiske data relateret til aggressivitet og med 5-årige overlevelsesrater. Resultaterne viste, at: 1) mRNA-niveauer og aktivitet af DPPIV steg i kolorektale neoplasmer (Kruskal-Wallis test, p 0,01); 2) Både adenomer og CRC’er viste positiv cytoplasmatisk immunfarvning med luminale membran forstærkning; 3) plasmatisk DPPIV aktivitet var lavere i CRC patienter end hos raske forsøgspersoner (Mann-U test, p 0,01); 4) plasmatisk DPPIV aktivitet var associeret med dårligere overordnede og sygdomsfri overlevelse (log-rank p 0,01, Cox-analyse p. 0,01)

Konklusion /signifikans

1) Up-regulering af DPPIV i kolorektale tumorer foreslår en rolle for dette enzym i den neoplastiske transformation af kolorektale væv. Dette fund åbner mulighed for nye terapeutiske mål i disse patienter. 2) plasmatisk DPPIV er en uafhængig prognostisk faktor i overlevelse af CRC patienter. Bestemmelsen af ​​DPPIV aktivitetsniveauer i plasma kan være en sikker, minimalt invasiv og billig måde at definere aggressivitet CRC i daglig praksis

Henvisning:. Larrinaga G, Perez I, Sanz B, Beitia M, Errarte P, Fernández A, et al. (2015) dipeptidylpeptidase IV Aktivitet er korreleret med kolorektal cancer Prognose. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10,1371 /journal.pone.0119436

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: September 7, 2014 Accepteret: 14 Jan 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Larrinaga et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den baskiske regering (IT8-11 /13), University of Baskerlandet UPV /EHU (UFI 11/44), og Gangoiti Barrera Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CRC er den tredje mest almindelige malignitet hos mænd og kvinder i USA, med mere end 136.500 estimerede nye tilfælde og mere end 50.000 estimerede dødsfald i 2014 [1]. Europa og andre udviklede regioner viser lignende satser for forekomst og dødelighed [2]. Traditionelt relateret til kostvaner [3], har sin frekvens steget støt i de sidste årtier i de vestlige lande som følge af moderne stil af liv til at blive et sundhedsproblem af stor bekymring. Kæmpe ressourcer bliver investeret i forebyggelse og tidlig diagnose af sygdommen. Befolkning-baserede screening kampagner forsøger at opdage så meget tidligt tumorer og prækursorer læsioner som muligt med henblik på at mindske forekomsten af ​​sygdommen, for at forenkle den kliniske behandling af patienter, når læsionen udvikler, og for at forbedre overlevelsen.

fra et patologisk synspunkt er adenomatøse læsioner i tyktarmen fuldt accepteret forstadier af CRC [4,5] og adenom-carcinom-sekvensen stadig udgør en solid model for forskning i carcinogenese [6]. Imidlertid er et stort antal cellulære metaboliske processer stadig ukendte involveret i oprindelsen og udviklingen af ​​neoplastiske processer [7].

Peptidaser spiller en central rolle i carcinogenese på flere måder, for eksempel regulering af bioaktive peptider, som er afgørende i neoplastisk vækst og immunreaktion, nedbryde den ekstracellulære matrix, som adhæsionsmolekyler eller deltager i intracellulær signalering [8]. Desuden har nogle undersøgelser vist, at aktiviteten og ekspressionen af ​​disse enzymer varierer i forskellige tumorer afhængig af flere patologiske parametre som histologisk Grade, Stage og tålmodig overlevelse [8-12]. Af denne grund, peptidaser er nyttige redskaber i udviklingen af ​​kliniske strategier for behandling og opfølgning af kræftpatienter.

dipeptidylpeptidase IV (EF 3.4.14.5) (DPPIV), også kendt som cluster differentiering antigen CD26 , er en serin peptidase udtrykt på en række celler, herunder epitel-, endotel- og lymfocytter [13]. Som andre membranbundne glycoproteiner, også det kan frigives i aktiv form for kropsvæsker, såsom plasma, serum og urin [14]. DPPIV spalter N-terminale dipeptider fra udvalgte bioaktive peptider, herunder nogle cytokiner, chemokiner og neuropeptider, der fører til deres inaktivering og /eller nedbrydning. Uafhængigt af dets enzymatiske aktivitet, DPPIV interagerer med ekstracellulær matrix (ECM) komponenter, herunder kollagen og fibronectin, således regulere celle-celle- og celle-ECM-interaktioner, og med flere receptorer og proteaser, der fører til sekretionen af ​​matrixmetalloproteaser (MMP’er). Gennem disse multiple funktioner, DPPIV regulerer forskellige biologiske processer, herunder celledifferentiering, adhæsion, immunmodulation og apoptose, funktioner, som styrer neoplastisk transformation [13].

Mange undersøgelser har beskrevet, at DPPIV ekspression og aktivitet ændres væsentligt i flere solide tumorvæv og at disse ændringer er forbundet med tumor kvalitet, scene og patienterne 5-års overlevelse, hvilket peger på dette enzym som en potentiel diagnostisk værktøj og terapeutisk target [12,13,15]. Desuden er det blevet påvist, at blod DPPIV niveauer er signifikant lavere hos kræftpatienter end hos raske individer, en konstatering af, at der er blevet af stor interesse for udvikling af yderligere tumormarkører [14,16-19].

med hensyn til CRC, to nylige undersøgelser beskrevet, at højere immunhistokemisk udtryk for DPPIV i CRC væv er korreleret med metastaser og værre samlet overlevelse af CRC patienter [20], og at cirkulerende DPPIV niveauer er korreleret med fjernmetastaser af CRC [21]. Vi og andre grupper også beskrevet, at ekspressionen og aktiviteten profil andre serinpeptidaser forbindelse med DPPIV variere i løbet af adenom-adenocarcinom sekvens og som er uafhængigt korreleret med overlevelsen af ​​CRC patienter [22-26]. Alle disse akkumulerede beviser peger på analyserne af serinpeptidaser såsom DPPIV som lovende redskaber i udformningen af ​​nye diagnostiske /prognostiske biomarkører og terapeutiske mål i CRC [14,20-26].

I den forbindelse Formålet med nærværende arbejde var at studere i et prospektivt måde de metaboliske og udtryk profiler af DPPIV i patienter med CRC analysere væv fra adenom-adenocarcinom sekvens og plasmaprøver, og at korrelere de opnåede resultater med klassiske histopatologiske parametre for tumor prognose og overlevelse .

Materialer Metoder

Forfatterne erklærer, at alle forsøg udført i denne undersøgelse er i overensstemmelse med de nuværende spanske og EU lovbestemmelser. Prøver og data fra patienter, der indgår i denne undersøgelse blev leveret af den baskiske Biobank for Forskningsbaseret OEHUN (www.biobancovasco.org). Alle patienter blev informeret om den potentielle anvendelse til forskning af deres kirurgisk resektion væv, og accepteret denne eventualitet ved at underskrive en bestemt dokument godkendt af de etiske og videnskabelige komitéer i Baskerlandet Public Health System (Osakidetza) (CEIC 11/51).

patienter

i alt 116 patienter med CRC blev prospektivt inkluderet i undersøgelsen. Alle patienter fik delvise kolektomier. Den topografiske fordeling var 41 lige sidet CRC’er, 51 forlod sidet og 24 fra endetarmen. 7 patienter fik præoperativ terapi, 49 patienter modtog kemoterapi eller kemo-strålebehandling efter resektion, og 60 patienter modtog ikke nogen behandling.

I 20 patienter, både adenomatøse og adenocarcinomatous polypper blev diagnosticeret. 13 adenomer var rørformet, 6 var tubulovillous adenomer, og en villøs adenom. Derudover 16 viste mild til moderat dysplasi og 4 viste høj grad dysplasi. Den gennemsnitlige størrelse var 2.1cm (med en række 0.6-4cm). Disse 20 sager blev anvendt til at analysere DPPIV aktivitet og mRNA /protein-ekspression i hele den normale slimhinde-adenom-adenocarcinom sekvens.

Den amerikanske fælles udvalg om kræft-system (AJCC, 7

th udgave) [27 ] er blevet anvendt til at tildele Stage og Grade. Opfølgning blev lukket den 30. juni, 2014. På det tidspunkt 43 patienter (37%) var død af sygdom. Gennemsnitlig opfølgningsperiode blev 53 måneder (spændvidde 4-88).

Plasma blev også indsamlet præoperativt og analyseret i 98 af disse patienter. Plasma fra 72 raske frivillige uden kliniske historie af neoplastiske sygdomme blev anvendt som kontrolprøve.

Kliniske data inkluderet i undersøgelsen, blev hentet fra patienten kliniske journaler og er opsummeret i tabel 1.

vævsprøver

Kirurgiske resektioner blev indsendt

i frisk

til Patologi Lab inden for en periode på 30 minutter efter fjernelse. Materialet til denne undersøgelse kommer fra den overskydende væv af patologisk diagnose. Håndtering af prøver blev udført efter traditionelle protokoller for håndtering af kirurgiske resektioner af tyktarm og endetarm [28]. Tumor karakteristika blev indregnet på grov undersøgelse og udvalgte fragmenter af tumor og ikke tumorvæv blev frosset i isopentan og lagret ved -80 ° C. Rutinemæssige procedurer i Patologi Lab inkluderet formalin fiksering af den kirurgiske prøve og paraffin indlejring af væv fragmenter udvalgt til histopatologisk undersøgelse. Histologiske objektglas blev farvet med hematoxylin-eosin. Desuden blev perifere venøse blodprøver fra 98 af disse patienter opnåede før operation og centrifugeres ved 1500 rpm i 15 minutter. Det opnåede plasma blev også opbevaret ved -80 ° C. Enzymassay blev udført i plasma opnået fra 72 raske frivillige (matches af køn og alder).

Prøveforberedelse

Eksplanterede tumorprøver blev homogeniseret i 10 mM Tris-HCI-buffer ved pH 7,4, i 30 sekunder ved 800 rpm ved anvendelse af en Heidolph PZR 50 Selecta homogenisator og ultracentrifugeret i en Centrikon T-2070 Kontron Instruments apparat ved 100.000

g

i 35 minutter. For at undgå kontaminering med opløselige enzymer blev de resulterende pellets vasket tre gange ved suspension i 10 mM Tris-HCI-buffer ved pH 7,4. Pellets blev derefter homogeniseret i 10 mM Tris-HCI-buffer ved pH 7,4, og centrifugeret ved lav hastighed (1500

g

) i 3 min at oprense prøverne. De således opnåede supernatanter blev anvendt til at bestemme DPPIV-aktivitet og proteinkoncentrationer. Alle ovennævnte trin blev udført ved 4 ° C.

målinger DPPIV aktivitet

DPP IV-aktivitet blev målt i tre eksemplarer ved anvendelse H-Gly-Pro-β-naphthylamid som substrat, efter en modificeret version af metoden ifølge Alponti et al. [29]. Bestemmelsen er baseret på fluorescens af produkter genereret fra hydrolysen af ​​substratet af enzymet. Reaktioner blev initieret ved tilsætning af 30-50 pi prøve til 1 ml af den pågældende inkubationsblandingen (50 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, og 0,2 mM aminoacyl-β-naphthylamid). Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C blev 1 ml 0,1 M natriumacetatpuffer (pH 4,2) tilsat til blandingen for at afslutte reaktionen. Det frigivne produkt blev bestemt ved måling af fluorescensintensiteten med et Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (excitations- og emissionsbølgelængder var 345 og 412 nm). Blindprøver blev anvendt til bestemmelse baggrundsfluorescens. Den relative fluorescens blev omdannet til picomol af produktet ved hjælp af en standardkurve konstrueret med stigende koncentrationer af β-naphthylamin.

For at verificere, at dannelsen af ​​β-naphthylamin (β-NA) var på grund af virkningen af ​​DPPIV og ikke på grund af andre enzymer, udførte vi inhiberingsassays i CRC væv og plasma med en specifik inhibitor af enzymet (diprotin a, 0,2 mM). Frigørelse af β-NA var hovedsagelig inhiberet i kolorektale væv (82%) og i plasmaprøver (86%).

Proteinkoncentration blev målt i tre eksemplarer ved Bradford-metoden [30], under anvendelse af BSA (1 mg /ml) som kalibratoren. Resultater fra CRC væv og fra plasmaprøver blev registreret som enheder i peptidase pr milligram protein (OP /mg prot) og per liter plasma (UP /L), hhv. En enhed af peptidaseaktivitet (UP) er den mængde enzym, der kræves for at frigøre en pmol β-naphthylamin per minut. Fluorogene assays var lineær med hensyn til hydrolyse tid og proteinindhold.

Immunhistokemi

Formalin-fikserede og paraffin-indlejret væv fra 20 CRCs, adenomatøse polypper og de ikke-involverede omgivende slimhinde blev immunfarvet med et monoklonalt antistof specifikt for DPPIV /CD26 (Novus Biologicals NB 100-59.021, kanin-anti-humant, arbejder fortynding 1: 250). Den immunfarvning blev udført ifølge rutinemæssige fremgangsmåder i en automatisk immunostainer (Dako Autostainer Plus). Kort sagt, blev endogen peroxidaseaktivitet blokeret ved inkubering af objektglassene i 3% hydrogenperoxid i absolut methanol i 10 minutter. Antigen genfinding blev udført i citratbuffer (10 mM, pH = 6) i 15 minutter ved 100 ° C i en mikrobølgeovn. Det primære antistof blev anvendt i 1 time ved stuetemperatur. En efterfølgende reaktion blev udført med sekundære antistoffer og biotin-fri HRP enzymmærket polymer af EnVision-Flex detektionssystem (Dako, Carpinteria, CA). Uspecifik IgG blev anvendt som en negativ kontrol. En positiv reaktion blev visualiseret med diaminobenzydine opløsning efterfulgt af modfarvning med hæmatoxylin.

Real-time kvantitativ RT-PCR analyse

udtryk for

DPP4

, det gen, der koder DPPIV , blev analyseret i væv fra 20 CRC’er, adenomatøs polypper og de uengagerede omkringliggende slimhinde. For at undgå nedbrydning, blev vævssnit nedsænket i RNAlater umiddelbart efter operationen og opbevaret ved -80 ° C, indtil den forarbejdes. Totalt RNA blev ekstraheret fra 20 mg væv ved hjælp TriReagent (Sigma, St. Louis, MO). De RNA-prøver blev derefter inkuberet med RNase-fri DNase I og RNasin (Promega, Madison, WI) for at fjerne resterende genomisk DNA. Første-streng cDNA blev syntetiseret ud fra 5 ug totalt RNA fra hver human prøve ved anvendelse af første-streng-cDNA-syntese kit (Roche, Mannheim, Tyskland). De resulterende cDNA-prøver blev amplificeret ved PCR med specifikke oligonukleotidprimerpar designet med analysen software Primer 3 og syntetiseret af Sigma-Genosys (Cambridge, UK). Baseret på tidligere forsøg på menneskers renalcellecarcinom [15], CRC [12] og andre humane væv [31] vi valgte glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

), polymerase (RNA) II (DNA- Instrueret) polypeptid A (

POLR2A

), hypoxanthin phosphoribosyltransferase 1 (

HPRT1

), β-actin (

ACTB

), succinat dehydrogenase kompleks, underenhed A (

SDHA

), TATA box protein (

TBP

) og peptidylprolyl isomerase A (

PPIA

) som endogene reference- gener. Sekvensen af ​​primerne anvendt til at amplificere

DPP4

og de syv housekeeping-gener er vist i tabel 2.

Ekspressionen af ​​

DPP4

og husholdning gener var kvantificeret i alle cDNA’er af real-time PCR under anvendelse realtid detekteringsapparatet iCycler iQ (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Eksperimenter blev udført i det væsentlige som tidligere [12,15,32] beskrevet. Fortyndinger af cDNA template blev fremstillet ud fra hvert væv og amplificeret in triplo under anvendelse SensiFAST SYBR Mix (Bioline Ltd, London, UK). Tre negative kontroller (uden skabelon, ingen revers transkriptase og ingen RNA i omvendt transkriptase reaktion) var også inkluderet i hver plade for at detektere en eventuel forurening. Efter en varm start (10 min ved 94 ° C), de anvendte parametre til PCR-amplifikation var: 10 s ved 94 ° C, 20 s ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C, for 50 cykler

Real-time PCR data blev udtrykt som gange ændring af målgenekspression forhold til den geometriske middelværdi (GM) mRNA ekspression af husholdning gener i hver prøve, som beskrevet af Vandesompele et al. [33]. Den gange ændring i genekspression blev beregnet ved formlen: 2

-ΔΔ C

T, hvor C

T er tærskelcyklen, beregnet af iCycler software, ΔC

T = (C

Ttarget gen-C

Tg.m.reference gener) og ΔΔC

T = (ΔC

TTEST prøve-ΔC

Tcontrol prøve).

prøver fra den samme patient blev altid måles på samme analytisk kørsel for at udelukke mellem-run variationer. PCR data opnået i et af de normale CRC prøver blev valgt vilkårligt som kontrol, og denne prøve blev inkluderet i alle PCR-forsøg til at korrigere for eventuelle inter-variationer.

Statistisk analyse

Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilk test blev anvendt på data fra vævs- og plasmaprøver henholdsvis at vide, om de tal, efterfulgt en normalfordeling. Baseret på denne information (p 0,05), DPPIV-aktivitet i væv og plasma blev analyseret med ikke parametriske prober: Mann-Whitney test og Kruskal-Wallis test blev anvendt til at påvise forskelle mellem to eller tre grupper, henholdsvis

Endelig Kaplan-Meier kurver og log-rank test blev udført for at vurdere sammenhængen mellem DPPIV aktivitet og 5-års overlevelse, sammenligner grupper oprettet af cut-off point baseret på receiver-drift karakteristiske (ROC) kurver. En Cox regressionsmodel blev brugt til at teste de uafhængige virkninger af kliniske og patologiske variabler og DPPIV aktivitet på overlevelse. SPSS 21.0 software blev anvendt til den statistiske analyse.

Resultater

DPPIV aktivitet og udtryk i kolorektale væv fra CRC patienter

Når DPPIV aktivitet blev analyseret hele kolorektal adenoma- adenocarcinom sekvens, blev højere aktivitet fundet i CRCs og adenomer end i det tilstødende uengagerede mucosa (Kruskal-Wallis test, p = 0,015).

DPP4

mRNA-ekspression viste et lignende mønster, med højere niveauer i begge neoplasmer end i den ikke tumorvæv (Kruskal-Wallis test, p = 0,001). Disse resultater er beskrevet i tabel 3.

Når data blev stratificeret efter topografisk fordeling af CRC’er, har vi ikke fundet nogen signifikant forskel (Kruskal-Wallis test, p = 0,965). Tissue DPPIV aktivitet var også lignende mellem patienter, der fik præoperativ behandling, postoperativ terapi og patienter, der ikke har fået nogen behandling efter resektion (Kruskal-Wallis test, p = 0,842).

Fig. 1 viser den immunhistokemiske ekspression af DPPIV i colon adenocarcinom, adenom og normal tilstødende slimhinder. Normal slimhinde ikke udtrykke DPPIV immunfarvning. Men begge adenomer (rørformet, tubulovillous og villøse) og CRC’er viste positiv cytoplasmatisk immunfarvning med luminale membran forstærkning. Den inflammatoriske komponent i alle tilfælde var også positivt.

DPPIV immunfarvning ligger i cytoplasmaet af adenomer og CRC celler, som viser luminal membran forstærkning.

Tissue DPPIV-aktivitet ifølge 5 års overlevelse og til patologisk karakteristika

for at bestemme de bedste afskæringsværdier for total overlevelse (OS) (fig. 2A) og sygdomsfri overlevelse analyser (DFS) (fig. 2B), ROC kurver blev udført. For væv DPPIV aktivitet, viste 2600 OP /mg protein cut-off point de mest optimale følsomhed og specificitet nøgletal (SE = 47% og Sp = 55% til OS, og Se = 48% og Sp = 55% for DFS) (Fig . 2A og 2B)

Optimale sensitivitet og specificitet forhold blev observeret under anvendelse af følgende afskæringsværdi:.. 2600 UP /mg prot væv DPPIV-aktivitet til OS (A) og DFS (B)

Kaplan-Meier kurver og log-rank test viste, at fem års OS og DFS af patienter med CRC ikke var korreleret med væv DPPIV styrke (log-rank test, p = 0,8 til OS, og p = 0,67 for DFS) (fig. 3A og 3B henholdsvis).

Samlet overlevelse (A) og sygdomsfri overlevelse kurver (B) af CRC patienter i henhold til deres tumor DPPIV aktivitetsmønster. Antallet af patienter i fare i hver gruppe på de enkelte tidspunkter er også inkluderet.

Ligeledes lagdeling af DPPIV aktivitet af flere patologiske variabler ikke smide nogen statistisk signifikant resultat (tabel 4).

DPPIV aktivitet i plasmaprøver fra CRC patienter

i plasma fra CRC patienter DPPIV aktivitet var signifikant lavere end hos raske personer (175 ± 7,2 OP /L vs. 218 ± 10,1 OP /L, Mann-Whitney test p 0,01) (figur 4).. Men lagdeling af data i henhold til patologiske variabler gav ikke nogen signifikant resultat (tabel 5).

Værdier er middel ± SE for enheder af peptidase per liter plasma (UP /L). (*) Students t-test, p. 0,01

I plasmaprøver ROC kurver blev udført både for DPPIV aktivitet og carcinoembryonisk antigen (CEA) niveauer. For plasmatisk DPPIV-aktivitet, viste 165 OP /L afskæringsværdi de mest optimale sensitivitet og specificitet forhold (SE = 64% og Sp = 63% til OS, og Se = 65% og Sp = 58% for DFS) (fig. 5A og 5B). En cut-off værdi på 5 ng /ml for CEA, som er kendt for at have en prognostisk effekt i CRC [34], viste lavere følsomhed (44% til OS, og 39% for DFS), men højere specificitet (68% til OS og 64% for DFS) end DPPIV (fig 5A og 5B)

Optimale sensitivitet og specificitet forhold blev observeret under anvendelse af følgende afskæringsværdi:.. 165 OP /L for plasma DPPIV-aktivitet både til OS ( A) og DFS (B). En cut-off værdi på 5 ng /mL for CEA, viste lavere følsomhed, men højere specificitet end DPPIV.

Kaplan-Meier kurver og log-rank test viste, at både OS (fig. 6), og DFS (fig. 7) blev omvendt korreleret med plasmatisk DPPIV-aktivitet. Således når plasma DPPIV aktivitet var højere end 165 OP /L OS og DFS var signifikant dårligere (log-rank p = 0,009 og = 0,018, henholdsvis) (fig. 6A og 7A).

(A) Kaplan-Meier-kurve og log-rank test. (B) Multivariate analyser af clinicopathologic variabler og plasma DPPIV aktivitet forudsige OS. Antallet af patienter i fare i hver gruppe på de enkelte tidspunkter er også inkluderet.

(A) Kaplan-Meier-kurve og log-rank test. (B) Multivariate analyser af clinicopathologic variabler og plasma DPPIV aktivitet forudsige DFS. Antallet af patienter i fare i hver gruppe på de enkelte tidspunkter er også inkluderet.

På den anden side viste multivariat analyse, at plasma-DPPIV-aktivitet (p = 0,001), histologisk bedømmelse (p = 0,02 ) og lokal invasion (p = 0,01) var uafhængige faktorer, der påvirker patient OS (fig. 6B), og at plasma DPPIV-aktivitet (p = 0,005), vaskulær invasion (p = 0,02) og grupperet fase (p = 0,02) var uafhængig prognostisk faktorer af DFS (fig. 7B).

diskussion

Malign transformation fra normal til kræft væv er forbundet med celle-overflade glycoprotein modifikationer. Disse fænotypiske ændringer kan spille en afgørende rolle i onkogenese og kan være nyttige tumormarkører i skelne maligne fra benigne væv [8]. Vedrørende CRC, adenom-carcinom-sekvensen i tyktarmen beskriver, at den gradvise overgang fra normal til dysplastiske epitel, og dermed til carcinom, er resultatet af den successive akkumulering af genetiske mutationer, der fører til ændrede niveauer af adskillige glycoproteiner, ligesom nogle peptidaser [6,8].

den første relevante resultat i vores undersøgelse var, at DPPIV udviste højere aktivitet og mRNA-niveauer i præneoplastiske adenomatøse læsioner og i CRC sammenlignet med den uengagerede omgivende slimhinde, selv om det ikke korrelerer med patologisk variable og med 5-års overlevelse CRC patienter. Tidligere blev det rapporteret, at aktiviteten og ekspressionen af ​​to andre serinpeptidaser, fibroblast aktiverede protein alpha (FAP) og prolylendopeptidase (PEP), var højere i adenomer og i tidlige stadier af CRC henholdsvis [22,24]. Desuden FAP udtryk korreleret med dårligere overlevelse [22,23] og PEP aktivitet gjorde det med en bedre samlet og sygdomsfri overlevelse [25]. Selv om disse divergerende indflydelse på CRC prognose tyder forskellige handler roller for disse serinpeptidaser i denne sygdom, bør der træffes de udtryk og aktivitet stiger i disse peptidaser i neoplastiske og præ-neoplastiske væv i betragtning ved udformningen af ​​nye terapeutiske metoder til tyktarmskræft.

på grund af sin variable udtryk på solide tumorer og dens forskellige biologiske funktioner, er endnu ikke klarlagt den præcise rolle, som DPPIV spiller i kræft. Det er blevet beskrevet, at DPPIV enten kan fremme eller hæmme tumor udvikling afhængigt af den specifikke type svulst eller på fase af udviklingen tumoren er [13]. Dette fænomen af ​​tumor specificitet fremsætter praktiske vanskeligheder ved anvendelsen peptidaseinhibitorer i kræftbehandling, og dette punkt er aktivt undersøgt i dag [35,36]. En ny tendens i dette emne består i anvendelsen af ​​cytotoksiske prodrugs aktiverede at blive aktiveret af specifikke peptidaser, hvis disse peptidaser er mere aktive eller stærkt udtrykt, sigter mod at beskadige den neoplastiske celle uden at modificere enzymet funktionalitet [35,36]. Nogle forskere arbejder i prolægemidler med FAP som et mål [35]. Siden sin homologe DPPIV er også meget aktiv i adenomer og CRC, foreslår vi, at dette serin peptidase kunne være mål for lignende prodrugs.

Cell-overflade glykoproteiner kan frigives til det ekstracellulære rum, vises i forskellige kropsvæsker og er blevet anvendelig serum eller plasmatiske biomarkører for at hjælpe i screening, diagnose, iscenesættelse, prognose og overvågning kræftbehandling. Det mest relevante eksempel i den kliniske følgende af CRC patienter er den carcinoembryonisk antigen (CEA) [34]. Imidlertid har analysen af ​​DPPIV i plasma eller serum af disse patienter viste sig at være en pålidelig metode i tidlig påvisning af CRC, at være et supplement til den klassiske fækal okkult blod eksamen og andre serum biomarkører, som er under klinisk afprøvning i dag [14, 17-20].

Flere forfattere [14,17,19] har beskrevet fald i de cirkulerende niveauer af DPPIV af CRC patienter sammenlignet med raske forsøgspersoner. Desuden har stigninger af dette enzym blevet observeret i serum fra metastatisk

vs

. ikke metastatiske patienter [14,17,19,20]. Disse data blev opnået ved immunodetektion, tyder på potentielle nytte for tidlig diagnose og klinisk opfølgning. Vi har registreret, at aktiviteten af ​​DPPIV målt ved fluorimetriske metoder blev signifikant reduceret i plasmaet fra CRC patienter. Derimod fandt vi, at denne aktivitet ikke var korreleret med metastatisk status eller med enhver anden patologisk variabel.

De høje forskelle i antallet af patienter mellem grupperne med og uden metastaser kan være på oprindelsen af ​​denne delvise uoverensstemmelse. Andre årsager bør også overvejes, fordi det er blevet beskrevet at flere biologiske fænomener kan påvirke aktiviteten af ​​cirkulerende DPPIV /CD26 uden at påvirke proteinniveauet. I denne forstand er rapporteret tilstedeværelsen af ​​cirkulerende molekyler, der ændrer aktiviteten af ​​dette enzym [37,38]. Nazarian et al. [38] har vist i en helt ny undersøgelse, at metastatisk prostatacancer patienter meddelte nedsat cirkulerende DPPIV-aktivitet, mens protein niveauer var ens med hensyn til patienter med lokaliseret primær tumor. Dette fund pegede på en cirkulerende lille peptid som en mulig årsag til denne inhibering [38] og åbner nye perspektiver for yderligere undersøgelser for at klarlægge den potentielle nytte af den kombinerede analyse af DPPIV aktivitet og proteinniveauer i serum /plasma hos cancerpatienter.

Da plasmaniveauer og aktiviteter PEP og FAP er også blevet korreleret med overlevelsen af ​​CRC patienter [19,25], en Hovedformålet med vores undersøgelse var at analysere fremadrettet korrelationen mellem plasma aktivitet sin homologe DPPIV og overlevelse 5-års af patienterne. Data viste, at patienter med højere plasmatiske DPPIV aktiviteter havde dårligere samlet og sygdomsfri overlevelse. Disse data viste bedre følsomhed, men dårligere specificitet end dem, der opnås med CEA. Den multivariate analyse viste, at DPPIV er en uafhængig prognostisk faktor CRC patient overlevelse. Derfor er der overbevisende beviser, at fastlæggelsen af ​​cirkulerende DPPIV kan være nyttige i tidlig diagnose [14,17-19,21] og også i prognosen for CRC.

Oprindelsen af ​​cirkulerende DPPIV i patienter med kræft er et kontroversielt emne. Aktuelle hypoteser placere sin oprindelse i leveren og de immunceller [14], og i tumor mikromiljø [8,14,19,38]. Vi udførte immunhistokemisk analyse hele adenom-carcinom-sekvensen til at kende placeringen af ​​DPPIV i de kolorektale væv. Ikke neoplastiske celler af kolorektal slimhinde farvede ikke med DPPIV. Derimod adenom og CRC celler viste positiv cytoplasmatisk immunfarvning med luminal membran forstærkning. Denne immunhistokemisk mønster enig med højere aktivitet og mRNA-niveauer, vi har også fundet i neoplasmer. Derudover fandt vi immunfarvning med DPPIV i de inflammatoriske celler i lamina propria i normalt og neoplastisk slimhinde. Dette resultat kunne antyde, at DPPIV frigives fra både immun- og neoplastiske celler i CRCs.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viser, at DPPIV opreguleres i adenomatøse og CRC væv sammenlignet med den uengagerede slimhinde. Plasma DPPIV aktivitet er lavere end hos raske forsøgspersoner og uafhængigt forbundet med dårligere 5-års overlevelsen i CRC patienter. Den DPPIV aktivitet beslutsomhed i plasma er en sikker, minimalt invasiv og billig metode, og kan være et supplement til bestemmelse af CD26 protein niveauer CRC patienter. Nye studier med større antal patienter, indsamle den præoperative og postoperative plasmaprøver på flere tidspunkter [21], bør udføres for at bekræfte den prædiktive værdi af disse resultater på diagnostisk tid og under patienternes opfølgning.

tak

Vi vil gerne takke Arantza Pérez (UPV /EHU) for hendes teknisk bidrag til denne undersøgelse, og til professor Juan Bilbao (UPV /EHU) for hans statistisk støtte.