PLoS ONE: Distinct methylering Forandringer på IGF2-H19 Locus i Medfødte Vækst Disorders og kræft

Abstrakt

Baggrund

Differentielt denatureret regioner (DMRs) er forbundet med mange prægede gener. Hos mus methylering på en DMR opstrøms for

H19

gen kendt som Imprint kontrolområdet (IC1) erhverves i den mandlige kimcellelinje og påvirker status for methylering af DMRs 100 kb væk i den tilstødende Insulin-lignende vækstfaktor 2 (

Igf2)

gen gennem langtrækkende interaktioner. Hos mennesker kimlinie-afledt eller post-zygotically erhvervet prægning defekter på IC1 er forbundet med afvigende aktivering eller undertrykkelse af

IGF2

, hvilket resulterer i de medfødte vækstforstyrrelser Beckwith-Wiedemann (BWS) og Silver-Russell (SRS) syndromer, henholdsvis. I Wilms tumor og kolorektal cancer, biallelisk udtryk for

IGF2

er blevet observeret i forbindelse med tab af methylering på en DMR i

IGF2.

Denne DMR, kendt som DMR0, har vist sig at være methylerede på den tavse moderens

IGF2

allel formentlig med en rolle i undertrykkelsen. Effekten af ​​

IGF2

DMR0 methylering ændringer i ætiologi BWS eller SRS er ukendt.

Metode /Principal Fund

Vi analyserede status methylering af DMR0 i BWS, SRS og Wilms tumor patienter med konventionel bisulfit sekventering og pyrosekventering. Vi viser her, at i modsætning til tidligere rapporter,

IGF2

DMR0 er faktisk methyleres på den aktive faderlige allel i perifert blod og nyrer. Dette svarer til den IC1 methylering status og er i strid med den foreslåede lyddæmpende funktion af moderens

IGF2

allel. Beckwith-Wiedemann og Silver-Russell patienter med IC1 methylering defekter har lignende methylering defekter på

IGF2

DMR0, i overensstemmelse med IC1 regulerer methylering på

IGF2

i

cis

. I Wilms tumor, men methylering profiler af IC1 og

IGF2

DMR0 er tegn på methylering forandringer på begge forældrenes alleler snarere end i

cis

.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater understøtter en model, hvor DMR0 og IC1 har modsatte modtagelighed til global hyper og hypometylering under tumorigenese uafhængig af moderselskabet oprindelseslandet aftryk. I modsætning hertil under embryogenese DMR0 er methyleret eller demethyleret ifølge kimcellelinje methylering aftryk på IC1, hvilket indikerer forskellige ordninger for prægning tab i neoplastiske og ikke neoplastiske celler

Henvisning:. Murrell A, Ito Y, Verde G , Huddleston J, Woodfine K, Silengo MC, et al. (2008) Særskilte methylering Forandringer på

IGF2-H19

Locus i Medfødte Vækst Disorders og kræft. PLoS ONE 3 (3): e1849. doi: 10,1371 /journal.pone.0001849

Redaktør: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA

Modtaget: December 14, 2007; Accepteret: 19 feb 2008; Udgivet 26. marts, 2008

Copyright: © 2008 Murrell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CRUK Senior Cancer Research Fellowship (AM) og Società Italiana di Cancerologia og Fondazione Pezcoller fællesskab (FC) og tilskud fra AICR (AM), MIUR PRIN 2005 (AR), Istituto Superiore di Sanità (AR), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AR og DP), Telethon-Italia Grant No. GGP04072 (AR), og Associazione Bianca Garavaglia, Busto Arsizio, Varese, Italien (DP)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerer eksisterer interesser.

Introduktion

Aberrant prægning af Insulin-lignende vækstfaktor 2 (

IGF2

) gen spiller en rolle i patogenesen af ​​overvækst uorden Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS, OMIM # 130.650), at væksten-restriktion tilstand Russell-Silver syndrom (SRS, OMIM # 180.860), samt forskellige menneskelige kræftformer, herunder Wilms tumor, rabdomyosarkom, hepatoblastoma, colorectal og bryst karcinomer [1] – [6] .

Mus modeller er blevet brugt til at påvise, at påtrykt udtryk for tæt knyttet

Igf2

H19

gener styres af specifikke forskelligt methylerede regioner (DMRs) [7 ] – [10]. En af disse DMRs (

H19

DMR) er placeret 5 ‘af

H19

promotor methyleres på faderlig kromosom og er kendt som den prægning kontrolområdet IC1, fordi det fungerer som en isolator medieret af CCCTC bindende faktor (CTCF) [11] – [14]. Sletning af de maternelle IC1 resultater i aktivering af den normalt tavse maternal

Igf2

allel og i nedregulering af

H19

[9]. Desuden findes en sådan et hierarkisk forhold mellem methylering på IC1 og

Igf2

at sletning eller mutation i IC1 resulterer også i methylering ændringer DMRs i

Igf2

gen [15]. Vi har tidligere vist, at IC1 faktisk interagerer med

IGF2

DMRs i hinanden og forælder oprindelsesland specifik måde påvirket af CTCF binding og DNA methylering [16], [17]. Anvendelsen af ​​denne model til mennesket har været hæmmet af forskelle i den genomiske organisering af

IGF2

DMRs i mus og menneske. Specifikt

IGF2

DMR0, placeret 5 ’til den vigtigste

IGF2

promotorer methyleres på den maternelle allel kun i placentaer i musen [18], men har differentiel methylering i alle væv hos mennesker [19]. Methylering af DMR0 på moderens

IGF2

allel blev udledt ved hjælp af cellelinjer afledt fra en BWS patient med faderlig uniparental disomi på 11p15.5 loci (UPD) [19] og i Wilms tumor nyrepatienter med tab af heterozygositet af moderens allel [20]. Methylering analyse af

IGF2

DMR0 er udført i mange kræft studier efter påvisningen af, at hypometylering af denne DMR er forbundet med tab af prægning i Wilms tumor [20] og kolorektal cancer [21]. Den nuværende fortolkning af disse resultater er, at tabet af methylering på

IGF2

DMR0 spiller en rolle i reaktivering af den tavse maternelle allel [21].

Den molekylære basis af BWS er ​​heterogen med 5 % af patienter, der udviser gevinst på methylering på IC1 med biallel aktivering af

IGF2

biallel lyddæmpning af

H19.

anden gruppe BWS patienter har normal IC1 methylering men unormal methylering på IC2, et moderen denatureret prægning kontrol region i

KCNQ1

KCNQ1OT1

gen-klynge, som synes at operere uafhængigt af

IGF2

H19

[2]. BWS patienter med IC1 defekter har en særlig høj disposition til at udvikle Wilms tumor, mens de patienter med IC2 defekter er tilsyneladende mere udsatte for andre tumorer [2], [22]. Hypermethylering på IC1 er også en hyppig funktion i ikke-syndromisk Wilms tumor patienter, som sammen med de forskellige tumor disposition profiler i BWS patienter tyder på, at lignende epigenetiske defekter fører til soma-dækkende overvækst og cancer. SRS har også en kompleks heterogen molekylær ætiologi og en delmængde af individer har tab af methylering på IC1 med biallel lyddæmpning af

IGF2

biallel aktivering af

H19

[6].

til dato har der ikke været nogen rapporter om status methylering af

IGF2

DMR0 region i BWS og SRS patienter, og det vides ikke, i hvilket omfang den foreslåede lyddæmpende funktion af denne DMR bidrager til ætiologi BWS og SRS. Vi undersøgte derfor forælder oprindelsesland methylering på DMR0 i forskellige undertyper af BWS og SRS patienter og også i en kohorte af Wilms tumor prøver. Vores resultater viser, at den aktive faderlige

IGF2

allel methyleres på DMR0 i

cis

med

H19

methylering i normale individer, og at i SRS og BWS den DMR0 og IC1 har lignende methylering abnormiteter. I modsætning hertil i Wilms tumorprøver DMR0 methylering er negativt korreleret med IC1 methylering. Disse resultater indebærer

IGF2

prægning defekter i medfødte vækstforstyrrelser og Wilms tumorer opstår gennem forskellige epigenetiske mekanismer.

Resultater

IGF2 DMR0 methylering status i BWS og SRS patienter

Vi undersøgte status for methylering af DMR0 i perifert blod leukocyt DNA afledt fra BWS patienter med IC1 hypermethylering (n = 7), IC2 hypometylering (n = 37) eller normal methylering både IC1 og IC2 (n = 27) og SRS patienter med IC1 hypometylering (n = 2), under anvendelse af bisulfit og pyrosekventering analyse. Det analyserede region er vist i figur 1A. Til vores overraskelse, 6/7 BWS patienter med hypermethylering på IC1 havde også hypermethylering på DMR0 (Median methylering 69,2%, interkvartile område (IQR) 60,5%, 75,1%) og 2/2 SRS med IC1 hypometylering også havde DMR0 hypometylering (28,2% og 36,28%). Patienter med normal methylering på IC1 eller hypometylering på IC2 havde normale methylering niveauer DMR0 (Median methylering 53%; IQR 48,2%, 57,1%). Disse resultater antyder, at enten methylering ændringer i BWS og SRS foregik i

trans

eller at methylering ved DMR0 er på paternelle allel.

A. Placering af DMR0 inden for

IGF2

gen i forhold til den faderligt methylerede prægning kontrol region IC1 der er opstrøms for

H19.

Pyrosequencing blev brugt til at analysere methylering på seks CpG’er i DMR0 regionen (NCBI 36 : 11, fra 2.125.904 til 2.126.160, indeholdende SNP rs3741210). Bisulfit (BSQ) og pyrosekventering (PSQ) primerpositioner er som angivet. Denne region indeholder CpG’er (nummereret 15,16,17) markeret med gråt som tidligere er blevet offentliggjort til at blive hypomethylated i kolorektal cancer [21]. Lodrette linje viser

Msp

I /

Hpa

II steder i DMR0. B. Box plot viser medianer, IQR, max. og min. værdier for

IGF2

DMR0 methylering niveauer målt ved pyrosekventering af bisulfit omdannede DNA opnået fra perifere blodprøver fra BWS og SRS patienter. Methylering procenter afspejle den andel af bisulfit omdannede cytosiner på CpG’er målt i assayet. Normale methylering niveauer for præget DMRs er 45-55% (se C). Kategorier af BWS patienter inkluderet dem med: ingen prægning defekt på IC1 region og IC2-regionen (NM); lav methylering (LM) på IC2 (IC2-LM); øget faderlig 11p15 gennem faderlig duplikering eller uniparental disomi (pUPD); og hypermethylering på IC1 (IC1-HM). SRS patienter omfattede to hver af maternel dobbeltarbejde 11p15 (Mat Dup) og hypometylering på IC1 (IC1-LM). BWS med hypermethylering på IC1, har også hypermethylering på DMR0, mens SRS med hypometylering IC1 har hypometylering på DMR0. C. Parent oprindelsesland specifik methylering i normal, BWS og SRS patienter. De BWS og SRS patienter har prægning defekter på IC1. Bisulfit omdannet DNA blev amplificeret med allel-specifikke primere til rs3741210 polymorfi i

IGF2

DMR0 før pyrosekventering for methylering. T-allelen er vist med kvadrater og C-alleler vist ved trekanter i plottene. Cirkler viser procentdelen af ​​den samlede methylering af CpG’er analyseret. Den paternelle allel er mere methyleret på DMR0 end den maternale allel. Begge alleler hypermethyleret i BWS og begge alleler er hypomethylated i SRS.

For at skelne mellem disse muligheder, vi undersøgte 13 BWS patienter med overskydende kopier af faderlig 11p15.5 (12 patienter havde faderlig UPD og én patient havde en 11p15.5 dobbeltarbejde) og to SRS patienter med maternelle 11p15.5 gentagelser. Vi har også bestemt direkte forældrenes oprindelse methylering på

IGF2

DMR0 i nogle af vores BWS og SRS patienter og 6 kontrolpersoner med henblik på at bekræfte vores resultater. Patienterne med maternal dobbeltarbejde havde reduceret niveauer methylering (44%), mens alle de fædrene UPD og faderlige dobbeltarbejde patienterne havde hypermethylering ((Median methylering 60.2%; IQR 56,1%, 64,3%), Fig 1B.). I alle informative familier var vi i stand til at bekræfte, at faderlige allel fortrinsvis blev methyleret ved DMR0 (især CpG’er 15-17) i

cis

med methylering på IC1 (fig. 1C og fig. S1). Disse resultater antyder derfor, at methylering på IC1 påvirkninger methylering på

IGF2

DMR0. BWS og SRS tilfælde med methylering defekter på IC1 erhverve den samme methylering defekt på DMR0 i kimcellelinje eller tidlig fosterudvikling, således at moderens

IGF2

allel gevinster methylering og aktiveres (BWS) eller fædrene allel svigter at blive methylerede og bragt til tavshed (SRS). Disse allel-specifikke methylering ændringer have den virkning, et aftryk switch således at begge alleler ligne enten en paternel allel (BWS) eller en maternel allel (SRS). Pyrosekventering resultater blev verificeret ved bisulfit sekventering (fig. S1).

IGF2 methylering analyse i Wilms Tumorprøver

Vi analyserede DMR0 methylering i to Wilms tumor patienter, der var opstået i individer ramt af BWS og en række ikke-syndromisk Wilms tumor patienter. En af de BWS patienter havde konstitutionel hypermethylering på IC1, den anden havde paternelle UPD. De ikke-syndromisk Wilms tumor patienter består af individer, der havde tumorspecifik IC1 hypermethylering (n = 10), 11p15.5 LOH med tab af den maternale allel (n = 13) eller normal methylering (n = 10) på IC1. Bemærkelsesværdigt, alle tumorer med hypermethylering på IC1, og de fleste af dem med LOH, herunder dem, opstået hos personer ramt af BWS, viste reduceret methylering på DMR0 (Median methylering 24,8%, IQR 16,52, 34,9), mens dem med normal IC1 methylering havde normal DMR0 methylering (Median methylering 45,1%, IQR 34,2; 52,3) (fig 2A-B.). Faktisk kunne en signifikant omvendt korrelation (Pearson r = 0,7118, CI -8.718-,4146) vises mellem DMR0 og IC1 methylering niveauer i Wilms tumor patient (fig. 2C). Som i blodleukocytter, tilstødende non tumorvæv viste fremherskende methylering af paternelle allel (fig. 2D og data ikke vist). Disse resultater viser tydelige epigenetiske ændringer i Wilms tumor sammenlignet med medfødte vækstforstyrrelser.

Box plot viser medianer, IQR, max. og min. værdier for

IGF2

DMR0 methylering niveauer målt ved pyrosekventering perifert blod (åben kasse), normal nyre (skraveret boks) og tumorbiopsier (grå kasse) fra Wilms Tumor patienter, der ikke har BWS. Methylering procenter afspejle den andel af bisulfit omdannede cytosiner på CpG’er målt i assayet. Normale methylering niveauer for præget DMRs er 45-55% (se D). Wilms Tumor patientprøver omfatter perifert blod og tumor-DNA fra patienter med normal methylering på IC1 i deres tumorer (NM); perifert blod, normale nyre og tumor DNA-prøver fra patienter med hypometylering af IC1 i deres tumorer (IC1-HM); og tumor DNA-prøver fra patienter med tab af heterozygositet (LOH) i deres tumorer. Påfaldende, Wilms Tumor patienter med hypermethylering på IC1 har hypometylering på DMR0 i deres tumorer. B methylering niveauer i perifert blod, upåvirket nyrevæv og Wilms tumor nyrevæv fra to BWS patienter (en med IC1 hypermethylering og et med pUPD). Begge patienter har hypometylering af

IGF2

DMR0 i deres tumorer. C Lineær regression kurve, der viser omvendt forhold mellem methylering niveauer på IC1 og DMR0 i Wilms Tumor. Tumorer med hypermethylering på IC1 har tab af methylering på DMR0. D. Perifert blod og nyrevæv fra en patient med Wilms tumor, der ikke har hypermethylering på IC1. Den C-allel hypermethyleret, mens T-allelen er hypomethylated i både blod og nyre-indikerer lignende forælder oprindelsesland methylering i disse væv.

Diskussion

Resultaterne af vores genetiske undersøgelser viser, at DMR0 methyleres på fædrene allel modsiger konklusionerne af to tidligere undersøgelser, som har rapporteret, at DMR0 methylering er på den maternelle allel [19], [20]. I den første rapport methylering blev undersøgt for hele

IGF2

gen i Wilms tumor prøver med og uden tab af prægning [20]. I denne undersøgelse blev differentiel methylering ved DMR0 regionen vist i normal nyre og i tumorer med monoallelisk ekspression, hvorimod tumorer med tab af prægning, blev hypomethylated [20]. De CpG’er, vi analyserede i vores methylering analyser blev også undersøgt af disse forfattere at bruge

Msp

I

/Hpa

II restriktionsanalyse (figur 1) og regionen er udspændt af sonde 9 i figur 1 og 3 i [20]. I fire tilfælde med tab af heterozygositet af 11p15.5 hvor den maternelle allel var tabt, blev bibeholdt paternelle allel fundet at være ikke-methyleret og dermed den maternelle allel blev udledt til at være den normalt methyleret allel [20]. Vi undersøgte 13 sager med LOH og viste lignende hypometylering mønstre, som tyder på, at celler med LOH er tilbøjelige til methylering ændringer på DMR0 som følge af at være tumorer. Den anden undersøgelse at rapportere, at DMR0 er moderen methylerede karakteriserede nye udskrifter af

IGF2

under udviklingen. Disse forfattere undersøgte en cellelinje etableret fra pUPD patient og fandt, at DMR0 blev hypomethylated [19]. Vi har fundet, at DMR0 tendens til at blive demethyleres i hybridomacellelinier med et enkelt humant kromosom 11, uanset parental oprindelse (upubliceret observation) og antage, at dette kan være en cellekultur fænomen.

Funktionen af ​​DMR0 er stadig ukendt. Det er blevet postuleret, at rollen som DMR0 methylering er at bevare tavshed om den maternelle

IGF2

allel. Men den viden, at forældrenes oprindelse

IGF2

DMR0 methylering er faderlig eliminerer en rolle i methylering-medieret repression af moderens

IGF2

allel. Faktisk stedet fungerer som en autonom regulator af prægning, vores resultater antyder, at DMR0 methylering påvirkes af IC1 methylering i ikke neoplastiske celler. Således under embryogenese, forælder Oprindelsesland specifikke methyleringsmønstre på mennesket

IGF2

-.

H19

locus er etableret i

cis

ligner observationer i mus [15]

Hos mus, hvor CTCF steder er blevet muteret, er udelukkelsen af ​​CTCF fra moderens IC1 resulteret i methylering af IC1 [23] og

IGF2

DMRs [16]. Desuden i voksne mus choroidea plexus, en hjernevæv, hvor

Igf2

udtrykkes fra begge alleler og

H19

ikke udtrykkes, IC1 og

IGF2

DMRs er denatureret på begge forældrenes kromosomer [24]. Vi viser her, at afvigende gevinst eller tab af methylering på IC1 er koblet til forandring samme methylering på

IGF2

DMR0. Den væsentligste forskel er, at mus har en DMR1 og en placenta specifik DMR0, mens i mennesker, er DMR1 mangler og DMR0 synes at opføre sig mere ligner mus DMR1. Det ultimative effekt af IC1 påvirke

IGF2

methylering er, at epimutation af IC1 har den konsekvens af både parentale alleler udviser en faderlig aftryk i tilfælde af BWS eller en maternel aftryk i sagen SRS (fig. 3).

i normale individer,

IGF2

udtryk er fra fædrene allel og

H19

er fra den maternelle allel. IC1 og DMR0 methyleres på faderens kromosom. I BWS, er det epigenotype og udtryk mønster af moderens kromosom konverteret til faderlige og SRS, er det epigenotype og udtryk mønster af faderlige kromosom konverteret til moderens (aftryk skift). I Wilms tumor,

IGF2

aktivering og

H19

lyddæmpning er forbundet med forstyrrelser af både mødrene og fædrene aftryk (somatisk tab af prægning).

Hvis lang -range interaktioner mellem DMRs på dette locus er ens hos mus og mennesker, ville dette forklare prægning defekter, der findes i overvækst lidelser BWS og SRS. Men prægning defekter i Wilms tumor er fortsat vanskeligt at forene med forstærker konkurrence- og langtrækkende DMR interaktion modeller. I vores analyse af denne udvalgte gruppe af Wilms tumor patienter, er methylering på DMR0 tabt på fædrene allel, mens IC1 gevinster methylering på den maternelle allel. DMR0 methylering niveauer er særligt lav i nogle af tumorerne, hvilket indikerer en næsten fuldstændig udryddelse af methylering på dette sted sandsynligvis fra begge alleler (fig. 2A-C). Epigenetisk omprogrammering sker således på begge forældrenes kromosomer i stedet for i

cis

, hvilket indikerer, at forskellige mekanismer styrer

IGF2

prægning i neoplastiske og ikke-neoplastiske celler (fig. 3). Soma-dækkende IC1 hypermethylering i BWS prædisponerer Wilms tumor og lignende epigenetiske ændringer forekommer i nyrerne som præ-neoplastiske begivenheder i Wilms tumorigenese [25]. Det er muligt, at DMR0 hypometylering er forbundet med en mere vedvarende aktivering af

IGF2

i tumorceller som et resultat af alternativ højt chromatin konformation fremmes af tumorspecifikke aktivatorer.

Under tumorigenese global hypometylering forekommer i gentagne rige regioner, LINE og SINE elementer, mens CpG øer forbundet med promotorer er underlagt hypermethylering [26]. DMRs methylerede i mikrobelinien og DMRs methylerede i de somatiske celler kan variere i deres evne til at blive omprogrammeret under tumorigenese. Yderligere sammenligning af forskellige DMRs i form af kimcellelinje versus somatiske og moderen versus faderligt methylerede samt genetiske og epigenetiske egenskaber bør føre til dybere forståelse af epigenetisk omprogrammering i kræft. Forud for vores studier, tab af methylering er den eneste beskrevne epimutation på DMR0 i kræftformer, mens både hyper og hypometylering er blevet beskrevet på IC1 [21], [27]. Desuden er det ikke alle rapporter viser en direkte sammenhæng mellem

IGF2

udtryk og DMR0 methylering ændringer på dette locus, og vi har rapporteret undtagelser i brystkræft (Ito

et al.

Indsendt), mens andre har indberettede undtagelser i æggestokkene og blærekræft [28], [29]. Disse undersøgelser, der gør viser en sammenhæng mellem tab af DMR0 methylering og tab af prægning behøver at blive genfortolket fordi methylering på DMR0 regionen er tabt fra den aktive faderlige allel snarere end fra den tavse allel.

Sammenfattende vi viser tre forskellige omprogrammering begivenheder på

IGF2-H19

locus og forbundet med prægning tab i BWS, SRS og Wilms Tumor. I de lidelser vækst, kimlinie allelspecifikke methylering ændringer have den virkning, et aftryk switch således at begge alleler ligne enten en paternel allel (BWS) eller en maternel allel (SRS), mens i cancer både parentale varemærker er tabt, og omprogrammeres. Vores resultater viser, at tabet af

IGF2

prægning er et komplekst fænomen, der opstår med forskellige mekanismer i human sygdom, sandsynligvis afspejler forskellige molekylære årsager og svar.

Materialer og metoder

emner

85 BWS og 3 SRS sager blev rekrutteret fra forskellige italienske børneafdelinger og blev klinisk diagnosticeret ifølge kriterierne beskrevet i litteraturen (https://www.geneclinics.org). Undersøgelsen omfattede også 40 Wilms Tumor patienter indskrevet ved Pædiatrisk Oncology Units tilknyttet Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediátrica (AIEOP). Alle tumorer blev histologisk diagnosticeret.

Etisk godkendelse

Denne undersøgelse blev godkendt af de etiske udvalg i Napolis andet universitet og Istituto Nazionale Tumori, INT, Milano.

Identification af IC1 og IC2 methylering, UPD, LOH og kopiantal abnormiteter

DNA-methylering på IC1 og IC2 blev analyseret ved Southern blotting med følsomme for methylering restriktionsenzymer eller COBRA, som beskrevet [2]. Tre prøver med IC1 hypermethylering stammer fra BWS patienter også havde arvet mikrodeletioner [30], [31]. UPD, LOH og dobbeltarbejde på 11p15.5 loci blev bestemt ved mikrosatellit analyse, som beskrevet [32].

Analyser af DMR0 methylering

Vi har designet en standard pyrosekventering assay for

IGF2

DMR0 region (NCBI36: 11,2125904-2126160), som omfattede seks CpG’er, hvoraf tre tidligere blev rapporteret til at blive hypomethylated i kolorektale patienter med LOI på

IGF2

[21]. De CpG’er i denne region er inkluderet i DMR0 region analyseret ved andre [19], [20]. 100 ng-2 ug af genomisk DNA pr prøve blev bisulfit behandlet under anvendelse EZ DNA-methylering kit (Zymo Research). Bisulfit behandlede DNA blev anvendt til generering af PCR amplificerede templates for pyrosekventering anvendelse af følgende forward primer: 5’TGAGGATGGGTTTTTGTTTGGTAT3 ‘og biotinyleret reverse primer 5’TCCTCAATCCACCCAAAATAATAT3’. 10 pi af det biotinylerede PCR-produkt blev anvendt til hver sekventering assay under anvendelse af følgende sekventeringsprimere 5’GGGGTGGAGGGTGTA 3 ‘og 5′-AAAAGTTATTGGATATATAGT 3’. Pyrosequencing blev udført på PSQ HS 96 System og PyroMark MD System ved hjælp Pyro Gold Reagent kits (Biotage, Uppsala, Sverige). Allelspecifik pyrosekventering blev udført ved at erstatte den ovennævnte biotinylerede primer med allel-specifikke biotinylerede primere, 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAC3 ‘eller 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAT3’ der anerkendte G eller A allel af rs3741210 polymorfi på bagsiden streng efter bisulfit konvertering.

methylering blev kvantificeret ved hjælp af Pyro Q-CpG Software (Biotage, Uppsala, Sverige), der beregner forholdet mellem konverterede C’er (T s) til uomvendte K’er på hvert CpG og udtrykker dette som en procentdel methylering. Gennemsnitlig methylering tværs af DMR0 for alle 6 CpG’er blev beregnet. Median og IQR methylering for forskellige kategorier af patienter blev analyseret ved hjælp af Prism Graphpad software.

Vi verificerede allel-specifik methylering ved konventionel bisulfit sekventering af klonede PCR-produkter i alle vores informative tilfælde.

Støtte Information

Figur S1.

Bisulfit sekventering analyser af IGF2 DMR0 Methylering i normale, medfødte vækstforstyrrelser og Wilms Tumor. IGF2 DMR0 Methylering i normale, medfødte vækstforstyrrelser og Wilms Tumor. Methylering af 6 CpG’er blev bestemt ved bisulfit genomisk sekventering på DNA ekstraheret fra perifere blodleukocytter (Normal, BWS og SRS) eller tumorvæv (Wilms Tumor) individer informative for rs3741210 polymorfi. Udfyldte cirkler repræsenterer methylerede CpG’er og åbne cirkler umethylerede CpG’er. Den maternelle (MAT) og faderlige (PAT) alleler af IGF2 DMR0 regionen er angivet

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001849.s001

(1,33 MB TIF)

Tak

Vi takker bidrag AIEOP Wilms Tumor videnskabelige komité og alle patienterne og deres familier for deres deltagelse i denne undersøgelse.