PLoS ONE: Arsentrioxid genaktiverer Proteasome-Dependent Nedbrydning af Mutant p53 protein i cancerceller i del via Øget ekspression af Pirh2 E3 Ligase

abstrakt

p53-genet er muteret i mere end 50% af humane tumorer. Mutant p53 udøver en onkogen funktion og er ofte højt udtrykt i cancerceller på grund af unddragelse af proteasom-afhængige nedbrydning. Således reaktivering proteasom-afhængig nedbrydning af mutant p53-protein er en attraktiv strategi for kræftbehandlingen. Tidligere fandt vi, at arsentrioxid (ATO), et lægemiddel til akut promyelocytisk leukæmi, nedbryder mutant p53 protein gennem en proteasomforløb. Men det er uklart, hvad der er E3 ligase, der er målrettet mutant p53 for nedbrydning. I aktuelle undersøgelse, søgte vi at identificere en E3-ligase er nødvendig for ATO-medieret nedbrydning af mutant p53. Vi fandt, at ATO inducerer ekspression af Pirh2 E3 ligase ved det transkriptionelle niveau. Vi fandt også, at knockdown af Pirh2 hæmmer, mens ektopisk udtryk for Pirh2 forstærker, ATO-induceret nedbrydning af mutant p53 protein. Desuden fandt vi, at Pirh2 E3 ligase fysisk interagerer med og henvender mutant p53 for polyubiquitination og efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning. Interessant fandt vi, at ATO samarbejder med HSP90 eller HDAC-inhibitor til fremme af mutant p53 nedbrydning og vækstsuppression i tumorceller. Sammen antyder disse data, at ATO fremmer mutant p53 nedbrydning i en del via induktion af Pirh2-afhængige proteasom vej

Henvisning:. Yan W, Jung YS, Zhang Y, Chen X (2014) Arsentrioxid genaktiverer Proteasome- afhængig Nedbrydning af Mutant p53 protein i cancerceller i del via Øget ekspression af Pirh2 E3 Ligase. PLoS ONE 9 (8): e103497. doi: 10,1371 /journal.pone.0103497

Redaktør: Yi Li, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: April 30, 2014, Accepteret: 3 juli 2014; Udgivet: 12. august 2014

Copyright: © 2014 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Grant CA 121.137 og CA 076069. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

missense mutationer af p53 gen, primært grupperet i kernen DNA-bindende domæne, forekomme i en stor fraktion af humane tumorer [1]. Disse mutationer producere p53 proteiner med en ændret sekvens-specifikke DNA-bindende aktivitet, som ikke kan inducere et array af målgener af vildtype p53 til tumorsuppression [2]. Derudover er mutante p53-proteiner vist sig at have oncogene aktiviteter, defineret som forstærkning af funktion (GOF) [3], [4].

Virkningerne af mutant p53 på tumorudvikling og progression er vidtrækkende. Sammenlignet med p53-nul-mus, mutant p53 knock-in-mus udviser signifikant forskellig tumor spektre og høj forekomst af tumormetastaser [5] – [7]. Vigtigst har kliniske undersøgelser vist, at et højt niveau af mutant p53 er korreleret med mere aggressive tumorer og dårligere behandlingsresultater [8] – [10]. Desuden mutant p53 er klinisk signifikant, fordi dens udtryk gør celler resistente over for kemoterapeutiske lægemidler [11], [12]. Tilsyneladende gevinst på funktion af mutant p53 er delvist afhængig af dens transkriptionelle aktivitet [5], [13] – [18], og sin dominerende negative aktivitet mod p53 familien [19] – [23].

i modsætning vildtype p53, er mutant p53 protein, der findes at unddrage proteasom-afhængige nedbrydning [24] – [28], hvilket fører til dens hyperstabilization i tumorer [29]. Adskillige mekanismer kan forårsage mutant p53 protein til at unddrage proteasom-afhængig nedbrydning. En mulighed er, at tumorassocieret stress kan fremkalde interaktionen af ​​mutant p53 med chaperoneproteiner, såsom HSP70 og HSP90, som inaktiverer E3 ligaser MDM2 og chip og dermed stabiliserer mutant p53 [24] – [27]. Faktisk inhibering af HSP90-ekspression eller aktivitet frigiver MDM2 og CHIP at nedbryde mutant p53 [26], [30]. En anden mulighed er, at mutant p53 kan danne amyloide aggregater i tumorer, som er resistente over proteasomalaktivitet nedbrydning [27], [31]. Evnen af ​​mutant p53 stabilisering præsenterer en fundamental gåde i terapeutisk intervention for kræftpatienter med en mutant p53. Således effektiv reaktivering af proteasomet-afhængige nedbrydning af mutant p53 i cancerceller har en terapeutisk signifikans.

For nylig fandt vi, at arsen mål mutant p53 for nedbrydning, hvilket fører til væksthæmning i faste tumorceller [32] . Arsen er et metalloid med en betydelig effekt og moderat bivirkninger hos patienter med akut promyelocytisk leukæmi, myelom, og myelodysplastisk syndrom [33]. Interessant fandt vi, at arsen inducerer ekspression af vildtype p53, TAp73, og TAp63 i tumorceller [32], [34]. Disse aktiviteter af arsen giver en strategi for at mindske mutant p53 dominant-negativ funktion og andre GOF aktiviteter. Selvom arsen nedsætter stabiliteten af ​​mutant p53-protein gennem en proteasomforløb [32], E3 ligase, som målretter mutant p53 til nedbrydning fortsat ukendt. I denne undersøgelse vil vi tage fat på dette spørgsmål for at fremme udviklingen af ​​arsentrioxid (ATO) som en potentiel anticancer stof kontrolforanstaltninger tumorer med mutant p53.

Materialer og metoder

Cell Culture

menneskelig pankreatisk cancercellelinie MIA PaCa-2 (indeholdende mutant R248W) og human keratinocytcellelinje HaCaT (indeholdende mutant H179Y /R282W) blev dyrket som tidligere beskrevet [35].

plasmider og siRNA

Humant fuldlængde Pirh2, Pirh2-DN (en E3 ligase defekt mutant), og Pirh2-ΔRING (RING finger domænet deletionsmutant) blev anvendt som tidligere beskrevet [36]. Alle Pirh2 proteiner blev FLAG-mærket i N-terminalen. FLAG-mærket ubiquitin ekspressionsvektor pcDNA3 blev anvendt som tidligere beskrevet [36].

To små interfererende RNA’er (siRNA’er) mod Pirh2, 5′-CAU GCC CAA CAG ACU UGU G DTDT-3 ‘og 5’ -GGA AGU GCA GUG CAU AAA C DTDT-3 ‘, og to krypterede siRNAs, 5′-GCA GUG UCU CCA CGU ACU A DTDT-3′ og 5’-GGC CGA UUG UCA AAU AAU U DTDT-3 ‘, blev købt fra Dharmacon RNAi Technologies. De siRNA’er blev transficeret ind i celler ved anvendelse SilentFect (Bio-Rad) ifølge fabrikantens protokol. Celler blev høstet på de angivne tidspunkter efter transfektion til yderligere eksperimenter.

Antistoffer

Rabbit anti-p53 (FL-393) blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology Inc. Kanin polyklonalt anti-Pirh2 blev købt fra Bethyl Laboratories Inc. Mouse monoklonalt anti-FLAG M2 og kanin-anti-actin blev købt hos Sigma.

Reverse transcription PCR-assay

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af et Iscript ™ cDNA Synthesis kit (Bio-Rad). Til måling Pirh2 mRNA, blev RT-PCR udført med fremadrettet primer 5′-CTGCGAGCACTATGACAGAG-3’and revers primer 5′-TTCATAGCTAGGCATAAGTTAC-3 ‘. Actin blev amplificeret med fremadrettede primer 5’-TCCATCATGAAGTGTGACGT-3 ‘og revers primer 5′-TGATCCACATCTGCTGGAAG-3’.

proteosomspecificitet inhiberingsassay

Celler blev podet i 24 timer, ubehandlede eller forbehandlet med proteasominhibitor MG132 (4 uM) i 2 timer, og derefter behandlet med ATO i 6 timer.

immunfældning og Western blot-analyse

immunfældning forsøget blev udført som tidligere beskrevet [37]. Kort fortalt blev HaCaT og MIA PaCa-2-celler behandlet med 5 eller 7,5 uM ATO i 6 timer. Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand, lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris-CI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40 og 0,4 mM PMSF), sonikeret, og klaret ved centrifugering . Cellelysater (500 ug af totale proteiner) blev inkuberet i 4 timer ved 4 ° C med de angivne antistoffer koblet til protein A-agarose-perler (Sigma) og derefter vasket med lyseringspuffer. Immunopræcipiteret protein komplekser og hel-cellelysater blev underkastet SDS-PAGE. For hvert sæt blev 5% af hel-cellelysat anvendes som input kontrol. IgG-antistof blev anvendt som en negativ kontrol. Immunoblots blev visualiseret ved SuperSignal West Femto kemiluminescens detektionsreagenser (Pierce).

GST-fusionsprotein forberedelse

Glutathion-S-transferase (GST) -mærket Pirh2, Pirh2-ΔRING eller Pirh2-DN var udtrykt af pGEX-4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech). De rekombinante GST-mærkede proteiner blev oprenset som tidligere [37] beskrevne. Kort fortalt blev GST-fusioner af Pirh2, Pirh2-ΔRING, og Pirh2-DN udtrykt i E. coli BL21 (DE3) (Novagene) efter induktion med 0,5 mM IPTG i 4 timer ved 37 ° C. Bakterieceller blev høstet og derefter resuspenderet i GST lysisbuffer (200 mM Tris-CI, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 og 0,4 mM PMSF). Efterfølgende blev cellelysater sonikeret og klaret ved centrifugering. GST-fusionsproteiner blev oprenset ved anvendelse glutathion-Sepharose-perler (Amersham Pharmacia Biotech) ifølge fabrikantens protokol.

p53 ubiquitinering assay

35S-mærkede vildtype p53 eller mutant p53 ( R175H og R273H) proteiner blev syntetiseret ved in vitro transkription og translation ved anvendelse af TNT T7 koblet reticulocytlysat-system (Promega). 5 pi (ca. 2 × 10

4 cpm) af in vitro-translateret p53 blev tilsat til GST-Pirh2 (2 ug) og blandet på is i 1 time til dannelse af GST-Pirh2-p53-komplekser. Komplekserne blev tilsat til ubiquitinering puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 2 mM ATP, 5 mM MgC

2, 2 mM DTT og 1 × energigenvinding opløsning (ERS)) indeholdende E1 (100 ng) , E2 (200 ng), og ubiquitin (2 ug) og inkuberet ved 30 ° C i 2 timer. Endelig blev reaktionsblandingerne separeret på SDS-PAGE og analyseret ved autoradiografi. E1, E2, ERS, og ubiquitin blev købt fra Boston Biochem.

Statistik

To gruppe sammenligninger blev analyseret ved tosidet Students

t

test.

s

værdier blev beregnet, og

s

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Arsentrioxid nedbryder mutant p53 protein via proteasomet-afhængige pathway

Det er velkendt, at i tumorceller, er hyperstabilization af mutant p53-protein tilskrives unddragelse af proteasom-afhængige nedbrydning [24] – [27], [31], [38]. Således reaktivering af proteasom-afhængig nedbrydning af mutant p53 i tumorceller har en terapeutisk signifikans. Tidligere fandt vi, at ATO nedsætter stabiliteten af ​​mutant p53-protein gennem en proteasomforløb [32]. Vigtigst, viste vi, at knockdown af endogen mutant p53 sensibiliserer, hvorimod ektopisk ekspression af mutant p53 desensibiliserer, tumorceller arsen behandling [32]. Konsekvent, en anden undersøgelse viste, at arsen-induceret nedbrydning af mutant p53 inhiberer proliferation af p53R273H-udtrykkende celler på en dosis-afhængig måde [39]. Men det er uklart, hvilket E3 ligase er ansvarlig for arsen-induceret mutant p53 nedbrydning. For at teste dette, har vi bekræftet, at arsen-induceret nedbrydning af mutant p53 er via proteasomet-afhængige vej. Til dette formål HaCaT celler ubehandlet eller behandlet med 4 pM MG132, en inhibitor af 26S proteasom, i fravær eller nærvær af ATO. Vi fandt, at arsen-induceret mutant p53 nedbrydning blev fuldstændig afskaffet ved MG132 (fig. 1A). Ligeledes fandt vi, at arsen-induceret nedbrydning af mutant p53-protein blev inhiberet af MG132 i MIA PaCa2 celler (Fig. 1B). Desuden fandt vi, at i modsætning virkningen af ​​proteasomforløb på vildtype p53-protein [40], inhibering af proteasomet pathway alene var i stand til at øge niveauet af mutant p53-protein (fig. 1A-B), i overensstemmelse med en tidligere rapport [41]. Samlet set viser disse resultater bekræftede, at arsen reaktiverer proteasom-afhængig nedbrydning af mutant p53 i tumorceller.

Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (A) og MIA PaCa-2 (B) celler, der var ubehandlet eller forbehandlet med 4 pM MG132 i 2 timer, og derefter ubehandlet eller behandlet med ATO i 6 timer.

Arsentrioxid nedbryder mutant p53 protein via induktion af Pirh2 E3 ligase

Tidligere, fandt vi, at arsen inducerer ekspression af Pirh2 E3 ligase at nedbryde ΔNp63 onkogen protein, et medlem af p53 familien [34]. Pirh2 vides at være en E3 ligase målretning vildtype p53 protein til nedbrydning [42], [43]. Vi udforskede således, om ATO inducerer ekspressionen af ​​Pirh2 i tumorceller, der bærer en mutant p53. Vi fandt, at efter behandling med ATO blev niveauet af Pirh2 transkripter signifikant forøget i MIA PaCa-2 og HaCaT celler (Fig. 2A), samtidig med en stigning på Pirh2 protein (fig. 2B). Disse data antydede, at ATO transkriptionelt kan inducere ekspressionen af ​​Pirh2 at nedbryde mutant p53 i tumorceller.

(A) Niveauet for Pirh2 udskrift øges ved ATO. RT-PCR-analyse blev udført med total RNA isoleret fra MIA Paca-2 og HaCaT celler ubehandlede eller behandlet med 7,5 uM ATO for 2-6 timer. Actin-mRNA blev amplificeret som en loading kontrol. (B) Western blots blev forberedt med ekstrakter fra MIA Paca-2 og HaCaT celler ubehandlede eller behandlet som i (A), og derefter undersøgt med antistoffer mod Pirh2 og actin, henholdsvis.

Næste, vi undersøgt, om ektopisk ekspression af Pirh2 forbedrer arsen-induceret nedbrydning af mutant p53-protein. Vi fandt, at ektopisk ekspression af Pirh2 eller ATO behandling alene reducerede signifikant niveauet af mutant p53 i HaCaT og MIA PaCa-2-celler (fig. 3A-B). Vigtigst, fandt vi, at en kombination af ektopisk ekspression af Pirh2 og ATO behandlingen yderligere faldt niveauet af mutant p53 (fig. 3A-B). Disse data antydede, at mutant p53 kan nedbrydes af Pirh2 E3 ligase, og aktiviteten af ​​Pirh2 kan forbedres ved ATO behandling via ukendte mekanismer.

(A-B) Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (A ) og MIA PaCa-2 (B) celler, som blev transficeret med pcDNA3 eller pcDNA3-FLAG-Pirh2 i 24 timer og derefter behandlet med 5 eller 7,5 uM ATO i 6 timer. Blottene blev derefter probet med antistoffer mod FLAG-mærke, p53, og actin, henholdsvis. (C) Skematisk præsentation af Pirh2 protein sammen med placeringer af Zn Finger og RING-domæner, to substitutionsmutationer C145S og C148S i ringen domæne (Pirh2-DN), og sletning af RING domæne Pirh2 (Pirh2-ΔRING). (D-E) Ektopisk udtryk for Pirh2-DN eller Pirh2-ΔRING har ringe eller slet ingen effekt på niveauet af mutant p53. Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (D) og MIA PaCa-2 (e) celler, der blev transficeret med pcDNA3, pcDNA3-FLAG-Pirh2-DN, pcDNA3-FLAG-Pirh2-ΔRING eller pcDNA3-FLAG-Pirh2 for 24 timer. Blottene blev derefter probet med antistoffer mod FLAG tagged Pirh2, p53, og actin, henholdsvis.

Det er kendt, at Pirh2 kræver sin RING domæne til ubiquitinere vildtype p53 til proteasomalaktivitet nedbrydning [44]. For at bestemme om E3-ligaseaktivitet af Pirh2 kræves til regulering mutant p53 udtryk, to FLAG-mærket Pirh2 mutanter, Pirh2-ΔRING (mangler RING finger domæne) og Pirh2-DN (indeholdende to substitutionsmutationer C145S og C148S i ringen domæne), blev anvendt (fig. 3C). Vi viste, at i modsætning til vildtype Pirh2, ektopisk ekspression af Pirh2-ΔRING eller Pirh2-DN var ude af stand til at nedsætte niveauet af mutant p53-protein i HaCaT og MIA PaCa-2-celler (fig. 3D-E).

for yderligere at undersøge, om endogene Pirh2 medierer arsen-induceret nedbrydning af mutant p53 protein, blev HaCaT og MIA PaCa-2 celler forbigående transficeret med en kodet siRNA (Scr-1 og -2) eller en siRNA mod Pirh2 (siPirh2-1 og -2) i 3 dage, og derefter mock-behandlet eller behandlet med ATO. Vi viste, at niveauet af Pirh2 blev signifikant reduceret med Pirh2, men ikke krypteret, siRNA’er (fig. 4A-B). Vigtigere, fandt vi, at Pirh2 knockdown kunne redde arsen-induceret nedbrydning af mutant p53 (fig. 4A-B). Vi bemærkede også, at arsen behandling steg Pirh2 ekspression, samtidig med en reduceret ekspression af mutant p53 (fig. 4A-B).

Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (A) og MIA PaCa-2 (B ) celler, som blev transfekteret med scrambled siRNA # 1 (SCR-1) (bane 1-2), Scr-2 (bane 5-6), siRNA mod Pirh2-1 (siPirh2-1) (bane 3-4), eller siPirh2-2 (bane 7-8) og derefter behandlet med ATO i 6 timer. Blottene blev derefter undersøgt med antistoffer mod Pirh2, p53, og actin, henholdsvis.

Pirh2 fysisk interagerer med mutant p53 protein til polyubiquitination

Som E3 ligase ofte fysisk interagerer med sine substrater vi undersøgte, om Pirh2 fysisk forbinder med mutant p53. For at teste dette blev HaCaT og MIA PaCa-2-celler behandlet med ATO i 6 timer, og derefter endogen mutant p53 og Pirh2 i celler blev immunfældet med antistoffer mod p53 og Pirh2 hhv. Vi viste, at endogent Pirh2 blev detekteret i mutant p53 immunkomplekser (fig. 5A). Desuden blev mutant p53 detekteret i Pirh2 immunkomplekser (fig. 5B). IgG blev anvendt som en negativ kontrol under immunfældning og ude af stand til immunfældning mutant p53 eller Pirh2 (fig. 5A-B).

(A) HaCaT og MIA PaCa-2-celler blev behandlet med 5 eller 7,5 uM ATO for 6 timer. Celleekstrakter fra HaCaT (til venstre) og MIA PaCa-2 (højre) celler blev immunfældet med anti-p53 eller kontrol IgG. Immunkomplekserne blev derefter anvendt til at detektere mutant p53 og Pirh2 sammen med helcellelysater som input kontrol. (B) Eksperimentet blev udført som beskrevet i (A), bortset fra at anti-Pirh2 antistof blev anvendt i immunpræcipitering. (C-E) In vitro syntetiseret

35S-mærkede vildtype p53 (C), R175H (D), og R273H (E) blev blandet med GST, GST-mærket Pirh2, Pirh2-DN, eller Pirh2-ΔRING . Komplekserne blev derefter blandet med en puffer indeholdende E1, E2 (UBCH5b), og Ub og derefter inkuberet ved 30 ° C i 2 timer. Ubiquitineret p53 blev analyseret ved SDS-PAGE og påvist ved autoradiografi. (F) En model af Pirh2-medieret nedbrydning af mutant p53 fremkaldt af ATO.

Dernæst undersøgte vi, om Pirh2 fungerer som en E3 ligase til ubiquitinering af mutant p53. For at teste dette, in vitro ubiquitinering assay blev udført med

35S-mærkede mutant p53R175H eller p53R273H sammen med rekombinant GST-Pirh2, GST-Pirh2-DN, eller Pirh2-ΔRING. Vi viste, at mutant p53’ere blev polyubiquitinated af Pirh2 men ikke af Pirh2-DN og Pirh2-ΔRING (fig. 5D-E, sammenlign bane 3 med bane 4 og 5). Eftersom vildtype p53 er et kendt mål for Pirh2, blev vildtype p53 anvendes som en positiv kontrol. Ligeledes viste vi, at vildtype p53 blev polyubiquitinated af Pirh2 men ikke af Pirh2-DN og Pirh2-ΔRING (fig. 5C, sammenlign bane 3 med bane 4 og 5). Sammen viser disse data, at Pirh2 kan polyubiquitinating mutant p53.

Arsentrioxid samvirker med HSP90 eller HDAC-inhibitor til fremme af mutant p53 nedbrydning og vækstsuppression i tumorceller

Tidligere undersøgelser viste, at i tumorceller, chaperone protein HSP90 interagerer med mutant p53 til dannelse MDM2-p53-HSP90 kompleks og dermed stabiliserer mutant p53 [24], [26], [45]. Følgelig HSP90 hæmmere 17AAG og geldanamycin forstyrre MDM2-p53-HSP90-kompleks til at nedbryde mutant p53 [26], [30], [45]. Desuden SAHA, en inhibitor af HDAC, viste sig at formindske ekspressionen af ​​mutant p53 via inhibering HDAC8-medieret mutant p53 transkription [46] og HDAC6-medieret mutant p53 protein stabilitet [30]. For yderligere at undersøge, om inhibitorer af HSP90 og HDAC’er er stand til at inducere Pirh2 ekspression at nedbryde mutant p53, blev HaCaT og MIA PaCa-2-celler behandlet med 17AAG eller SAHA. Vi viste, at 17AAG eller SAHA behandling havde ringe eller slet ingen virkning på ekspression af Pirh2 protein i HaCaT (fig. 6A) og MIA PaCa-2-celler (fig. 6B). Resultatet antyder, at ATO og inhibitorer af HSP90 og HDAC’er kan forringe mutant p53 protein via forskellige veje. Således har vi den hypotese, at ATO kan samarbejde med HSP90 eller HDAC-inhibitor til fremme af mutant p53 nedbrydning og vækstsuppression i tumorceller. For at teste dette blev HaCaT og MIA PaCa-2-celler behandlet med ATO, 17AAG eller SAHA, alene eller i kombination. Vi fandt, at mutant p53 protein markant var faldet med ATO, 17AAG eller SAHA, og yderligere faldet med kombination af ATO med 17AAG eller SAHA (fig. 6C-D). Konsekvent, fandt vi, at proliferation af HaCaT (fig. 6E) og MIA PaCa-2-celler (fig. 6F) var signifikant inhiberet af ATO, 17AAG eller SAHA, og længere inhiberes ved kombination af ATO med 17AAG eller SAHA. Disse data antyder, at kombinationen af ​​ATO med andre anti-cancermidler, såsom inhibitorer af HSP90 og HDAC’er, kan opnå synergistiske terapier for tumorer huser en mutant p53.

(A-B) Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (A) og MIA PaCa-2 (B) celler, der var ubehandlet eller behandlet med 1 uM 17AAG eller 2 pM SAHA i 12 timer. Blottene blev derefter probet med antistoffer mod Pirh2 og actin, henholdsvis. (C-D) Western blots blev fremstillet med ekstrakter fra HaCaT (C) og MIA PaCa-2 (D) celler, der var ubehandlet eller behandlet med 7,5 pM ATO, 1 uM 17AAG eller 2 pM SAHA, alene eller i kombination til 12 h. Blottene blev derefter probet med antistoffer mod p53 og actin, henholdsvis. (E-F) HaCaT (E) og MIA PaCa-2 (F) celler blev behandlet som i (C-D) i 24 timer. Overlevende celler fra både kontrol- og behandlede grupper blev talt og præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre separate forsøg. *,

s

. 0,05

Diskussion

Under normale forhold, er vildtype p53 udtrykt på et lavt niveau på grund af nedbrydning medieret af flere E3 ligaser , herunder MDM2, Pirh2, COP1, ARF-BP1, og WWP1 [43]. I modsætning hertil mutant p53 ofte akkumulerer til høje niveauer i tumorceller, skønt dets ekspression i normale væv også holdes på lave niveauer gennem virkningen af ​​MDM2 [28]. Det tumorspecifikke hyperstabilization af mutant p53 er en kritisk faktor for dens GOF. Faktisk nedregulering af mutant p53 af siRNA hæmmer spredning af humane tumorceller [16], [47]. Således rettet mod mutant p53 til nedbrydning giver et rationale for attraktive anticancer strategier til at dæmpe spredningen af ​​kræftceller. For nylig blev det foreslået, at der i nonproliferating tumorceller, undertrykke macroautophagy fremmer omsætningen af ​​mutant p53 protein gennem chaperone-medieret autophagy i et lysosom-afhængig måde [29]. Desværre er kravet om betingede spredning af tumorceller begrænser potentialet af chaperone-medieret autophagy til klinisk anvendelse. Desuden tiden tilgængelige kemoterapier er i stand til at depletere mutant p53. For eksempel har mange frontline anticancermidler øge både vildtype p53 og mutant p53 og kan fremme tumordannelse og progression i tumorer med mutant p53 [28], [48]. Således stabilisering af mutant p53 ved kemoterapeutiske midler paradoksalt begrænser effektiviteten af ​​disse behandlinger.

Tidligere fandt vi, at ATO, et lægemiddel klinisk foretrukket til akut promyelocytisk leukæmi, nedsætter stabiliteten af ​​mutant p53-protein gennem en proteasomforløb og blokering af proteasomforløb kan mindske arsen-inducerede mutant p53 nedbrydning [32], [49]. I denne undersøgelse fandt vi, at ATO inducerer ekspressionen af ​​Pirh2 E3 ligase. Desuden fandt vi, at knockdown af Pirh2 inhiberer, hvorimod ektopisk ekspression af Pirh2 forbedrer, arsen-induceret nedbrydning af mutant p53-protein. Vores fund tyder på, arsen-induceret ekspression af Pirh2 i cancerceller reaktiverer proteasomet-afhængige mutant p53 nedbrydning (fig. 5F). Selvom mutant p53 kan målrettes ved MDM2 i normale celler, kan MDM2 ikke polyubiquitinate mutant p53 i cancerceller [28]. Denne defekt skyldes sandsynligvis øgede niveauer af HSP70 og HSP90 i kræftceller, som danner komplekser med mutant p53 protein [24] – [26], [45]. Desuden kan overudtrykt MDM2 isoform B i cancerceller interagere med fuld længde MDM2 og inhiberer MDM2-medieret mutant p53 ubiquitinering [38]. Disse ændringer giver mulighed for at målrette tumorer huser en mutant p53. , Fandt vi faktisk, at ATO samarbejder med 17AAG eller SAHA at inhibere mutant p53-ekspression og tumorcelleproliferation.

Selvom ektopisk ekspression af Pirh2 eller ATO behandling alene signifikant kan formindske niveauet af mutant p53, kombinationen af ​​ektopisk ekspression af Pirh2 og ATO behandlingen yderligere nedsætter niveauet af mutant p53 (fig. 3A-B). Dette indebærer, at evnen til Pirh2 E3 ligase at nedbryde mutant p53 kan forbedres ved ATO behandling. En mulighed kan skyldes ATO-inducerede posttranslationelle modifikationer af mutant p53 og Pirh2. Faktisk blev det rapporteret, at efter administration af arsen i akut promyelocytisk leukæmi (APL), PML-RARa fusionsoncoprotein undergår SUMOylation af små ubiquitin-lignende modifikatorer (SUMO) og underkastes derefter RNF4-medieret proteasomalaktivitet nedbrydning [50], [51 ]. Inaktivering af SUMOylation helt blokerer PML nedbrydning [52]. Således er yderligere undersøgelser berettiget at undersøge, om Pirh2 og /eller mutant p53 modificeres ved SUMO, som kan forbedres ved behandling af ATO i tumorceller.