PLoS ONE: Kombination Paclitaxel med ABT-263 Har en synergistisk effekt på Paclitaxel Resistant prostatakræft Cells

Abstrakt

Vi vurderede evnen til paclitaxel, en af ​​de taxaner, at fremkalde døden i to prostatakræft linjer, LNCaP og PC3. Paclitaxel kørte en apoptotisk vej hos LNCaP, men ikke i PC3-celler, som respons på G2 /M arrest. En undersøgelse af de niveauer af anti-apoptotiske proteiner afslørede, at Bcl-xl var meget højere i PC3 celler end i LNCaP celler og Bcl2 kunne påvises kun i PC3 celler, ikke i LNCaP celler. Knocking ned Bcl-xl forbedret paclitaxel-induceret apoptose i LNCaP celler, mens vi var ude af stand til at vælte Bd-XL effektivt i PC3 celler. Betydeligt, en sammenligning af ABT-263, en specifik inhibitor af Bcl2 og Bcl-xl, med ABT-199, en Bcl2 selektiv inhibitor, beskrevet, at kun ABT-263, ikke ABT-199, kunne inducere apoptose i LNCaP og PC3-celler. Resultaterne viser, at Bcl-xl har en beskyttende rolle mod paclitaxel-induceret apoptose i LNCaP og PC3-celler, og dets overekspression forårsager paclitaxel modstand set i PC3-celler. Interessant, at kombineret paclitaxel med ABT-263 behandling LNCaP og PC3-celler demonstrerede synergistisk apoptose aktivering, hvilket indikerer, at ABT-263 kunne øge paclitaxel-induceret apoptose i LNCaP-celler og overvinde Bcl-xl overekspression at udløse paclitaxel-induceret apoptose i PC3-celler. Vi observerede også, at aktiveringen af ​​apoptose i LNCaP-celler var mere effektiv end i PC3-celler som reaktion på paclitaxel plus ABT-263 eller ABT-263 alene, hvilket antyder, at apoptose pathway i PC3-celler kan have yderligere forskelle fra den i LNCaP-celler selv efter regnskabsmæssigt Bcl-xl overekspression

Henvisning:. Wang C, Huang SB, Yang MC, Lin YT, Chu IH, Shen YN, et al. (2015) at kombinere Paclitaxel med ABT-263 Har en synergistisk effekt på Paclitaxel Resistant prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10,1371 /journal.pone.0120913

Academic Redaktør: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: 3 maj 2014; Accepteret: 9. februar 2015; Udgivet 26. marts, 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Grant EX99-9935EI (til CHC) fra National Health Research Institutes of Taiwan; Grant KMU-M103005 (til CW) fra Kaohsiung Medical University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Erhvervet resistens over for taxan-relaterede kemoterapi fortsat et stort problem for maligne tumorer, der viser en initial terapeutisk gavn af taxan behandling. Cancerceller med taxan resistens kan overudtrykke et multidrug-resistensgen kodet for P-glycoprotein pumpe til at forøge udstrømningen af ​​taxan, hvilket fører til minimal intracellulære taxan-koncentrationer [1]. Desuden, ændring af mikrotubuli funktioner, primært ved forøgelse af den dynamiske aktivitet af mikrotubuli efter taxan behandling, kan også ændre reaktionsevne til taxaner og nedsætte deres effektivitet [2,3]. Mutationer af tubulin gener i mikrotubuli bindingssted af taxaner kan ændre taxan bindende affinitet, hvilket resulterer i betydelige tab af effektivitet [4,5]. Gain-of-funktion til at modvirke apoptotiske veje kan også bidrage til multiresistens i kræft [6,7].

Det specifikke apoptose regulatoriske mønster i kræftceller kan være en afgørende faktor for følsomheden af ​​kræftceller til flere forskellige kemoterapimidler [8]. Intrinsic eller mitokondrie apoptose forekommer normalt i kræftceller reagerer på kemoterapi-induceret cellecyklusstop, herunder lægemiddelinduceret mitosestandsning [9,10]. The Bcl2 familie, der består af tre grupper af proteiner, herunder anti-apoptotiske proteiner, pro-apoptotiske proteiner og BH3-only proteiner, er afgørende for denne iboende apoptose [9]. Bcl2, Bcl-xl, Mcl-1 og Bfl1 er anti-apoptotiske proteiner. Både Bax og Bak er pro-apoptotiske proteiner. BH3-kun proteiner omfatter Bad, Bik, Bim, Bid, Noxa, HRK og BMF. De anti-apoptotiske proteiner indeholder alle fire konserverede sekvensmotiver, Bcl-2-homologi (BH) domæner, som omfatter BH1, BH2, BH3 og BH4 [10]. Deres rolle er at bevare integriteten af ​​mitokondrier til at støtte celle overlevelse. De pro-apoptotiske proteiner deler bemærkelsesværdig lighed med anti-apoptotiske proteiner, især i de strukturelle træk ved alle fire BH regioner, mens de forstyrrer mitokondrie integritet til at udløse apoptose. Endelig BH3-only proteiner har kun et BH3-domæne til at dele med hinanden og med de anti-apoptotiske og pro-apoptotiske proteiner [11]. Interessant, den fælles BH3-domænet af BH3-only proteiner udgør ca. 26 rester aminosyrer og danner en amfipatisk α-helix at interagere med og inaktivere anti-apoptotiske proteiner [12]. Det muligvis også forbigående binder Bax og Bak til deres aktivering [13].

For nylig har flere forbindelser blevet udviklet som BH3 mimetiske at inducere apoptose gennem hæmning af de anti-apoptotiske proteiner [12,14]. Hidtil har de mest potente inhibitorer er de dårlige-lignende BH3 mimetika, ABT-737 og dens oralt aktiv analog, ABT-263 [15-17]. De binder til Bcl-2, Bcl-XL og Bcl-w med meget høj affinitet, men med meget lavere affinitet til Mcl-1 eller Bcl2A1 [14,18]. Prækliniske undersøgelser har vist, at både ABT-737 og ABT-263 kan forskyde pro-apoptotiske proteiner fra anti-apoptotiske proteiner, i overensstemmelse med et BH3-mimetisk mekanisme aflivningstidspunktet [19]. Den apoptose induceret af ABT-737 via BAX eller BAK foreslås at være en on-target-aktivitet [20]. Endvidere er følsomheden af ​​cellen reaktion på BH3 peptiderne BH3-only proteiner stærkt korreleret med følsomheden af ​​cellerne truet med ABT-737 apoptose [21]. Betydeligt, har kliniske forsøg med ABT-263 blevet udført og er blevet observeret nogle fordele, især i kronisk lymfatisk leukæmi [22]. Derudover kan både ABT-737 og ABT-263 anvendes som værktøjer til mekanistiske undersøgelser af apoptose [14,23]. For nylig, en ny ABT, ABT-199, er blevet udviklet med påvist selektivitet specielt til Bcl2 [24].

I den aktuelle undersøgelse, vi udforskes apoptotiske veje i prostatacancerceller som respons på paclitaxel, ABT 199, ABT-263 og paclitaxel plus ABT-263, ved hjælp LNCaP- og PC3 celler. LNCaP og PC3 repræsenterer den androgen-respons og androgen-uafhængige prostatacancer-cellelinie, hhv. Vi først fundet, at paclitaxel forårsagede G2 /M anholdelse i både LNCaP- og PC3 celler, men apoptose resulterede kun i LNCaP celler. Desuden observerede vi Bcl2 og Bcl-xl overekspression i PC3-celler sammenlignet med LNCaP-celler, der har lave og ikke-detekterbare niveauer af Bd-XL og Bcl2 hhv. SiRNA knockdown af anti-apoptotiske protein Bcl-xl øget apoptose i LNCaP, men det kunne ikke knockdown i PC3-celler effektivt. Vi sammenlignede evnen hos ABT-199 og ABT-263 til at inducere apoptose og fandt, at kun ABT-263, ikke ABT-199, kunne inducere apoptose. Vi viste også, at paclitaxel i kombination med ABT-263 havde synergistiske virkninger på apoptose i både LNCaP og PC3-celler. Dette antyder, at ABT-263 kan måske forbedre terapeutiske udfald for både paclitaxel-følsomme og paclitaxel-resistente prostatakræft. Aktivering af apoptose var mere effektiv i LNCaP-celler end PC3-celler som reaktion på paclitaxel plus ABT-263 eller ABT-263 alene, hvilket antyder, at apoptose pathway i PC3-celler kan afvige yderligere fra den i LNCaP-celler selv efter personbiler er ansvarlige for Bcl-xl .

Materialer og metoder

Forbindelser

Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ABT-199 (Selleck) og ABT-263 (Selleck) blev købt fra kommercielle kilder som angivet . Forbindelserne blev opløst i DMSO først og fortyndet ved dyrkningsmedium i yderligere forsøg.

Cellekultur og synkronisering

PC3 og LNCaP-celler blev erhvervet fra Bioresource Indsamling og Research Center (BCRC) i Taiwan . Cellerne blev podet ved 4 × 10

5-6 × 10

5 celler pr petriskål (10 cm) i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og dyrket ved 37 ° C under 5% CO

2. Cellerne blev dyrket enten ikke-synkront eller synkront. Til synkronisering blev PC3-celler udsået i serum-rige RPMI 1640 medium med 2 mM thymidin og inkuberes i 19 timer. Cellerne blev frigivet ved vask tre gange med PBS og re-fed med frisk serum-rigt medium i 8 timer. Derefter blev cellerne fodret igen med frisk medium indeholdende 2 mM thymidin i 16 timer. Cellerne blev vasket af PBS tre gange før efterfølgende trin. LNCaP-celler blev udsultet i serumfrit RPMI 1640 medium i 48 timer efter at være udsået i serum-rigt medium i 24 timer.

Flowcytometrisk cellecyklusanalyse

PC3 og LNCaP-celler blev behandlet ved paclitaxel ved de angivne tidspunkter efter synkronisering i G1 /S-fase. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og /eller adskilt i adhærente og fritliggende fraktioner. Cellerne blev centrifugeret, vasket med PBS og opsamlet ved centrifugering. Cellerne blev fikseret med iskold 70% ethanol i 30 minutter, vasket med PBS og centrifugeret for at fjerne supernatanten. Cellerne blev resuspenderet i PBS indeholdende 0,05% Triton X-100 og RNase A (40 ug /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 1 time, og propidiumiodid (PI) blev tilsat til cellesuspensionen til en slutkoncentration på 50 ug /ml i yderligere 1 times inkubation. Cellerne blev høstet ved centrifugering, vasket med PBS og centrifugeret for at fjerne supernatanten. Endelig blev cellerne resuspenderet af PBS og analyseret ved flowcytometer (BD Biosciences) med software (BD Biosciences).

Immunofluorescensanalyse med et konfokalt mikroskop

Om 5 × 10

4 PC3 og 1 × 10

5 LNCaP-celler blev udpladet på sterile 18-mm dækglas. Celler blev synkroniseret under betingelserne beskrevet ovenfor i celle synkronisering afsnittet. Celler blev dyrket med forskellige forbindelser på de angivne tidsforløb, faste i methanol (-20 ° C, 10 min) og perforeret med 0,1% Triton X100 (25 ° C, 2 min). Celler blev blokeret i 3% bovint serumalbumin-TBS og derefter farvet med primær α-tubulin monoklonalt antistof (Sigma-Aldrich) efterfulgt af sekundære antistoffer, konjugeret med fluorophor (Invitrogen). Dækglassene blev monteret med antifade reagens med DAPI (Invitrogen) med bunden i vejret på objektglas. Konfokal mikroskopi billeder blev opnået ved hjælp af et konfokalt mikroskop-system (Olympus) og forstærkes hundrede gange.

Apoptose Assay

Om 1 × 10

5 PC3 celler eller 2 × 10

5 LNCaP-celler blev podet på en 10 cm petriskål. Både PC3 og LNCaP celler blev synkroniseret og udsat for de angivne sammensatte behandlinger for 48 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og adskilt i adhærente og fritliggende fraktioner. Cellerne blev resuspenderet og farvet i 100 pi Annexin V-bindingsbuffer med 100 ug /ml propidiumiodid og 100 ug /ml FITC-konjugeret Annexin V-antistof (Strong Biotech) i 15 minutter ved stuetemperatur før FACS-analyse.

Immunoblotting

Celler blev lyseret i lysisbuffer (250 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% NP-40, 1 mM EDTA, 10 mM β-glycerophosphat, 0,1 mM Na

3VO

4H, 1 tablet proteaseinhibitorcocktail, 1 mM NaF, 50 mM HEPES, pH 7,4, i 50 ml). Proteinkoncentration blev bestemt ved en BCA Protein Assay Kit (Pierce). Ca. 100 ug protein pr brønd blev underkastet SDS-PAGE. Efter elektroforese blev proteinerne overført til en nitrocellulosemembran. De overførte membraner blev blokeret i 5% (w /v) fedtfri tørmælk eller 5% (vægt /volumen) BSA i TBS (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 7,4) med 0,1% (v /v) Tween 20 og probet for det første antistof, efterfulgt af inkubation med et sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (anti-kanin, anti-mus, Jackson ImmunoResearch) og visualisering med en påvisning kit (Pierce) ved fremkaldelse af fotografiske film. De første antistoffer anvendt i denne undersøgelse, var som følger: anti-actin-antistof (Millipore), anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) og -α-tubulin-antistof (GeneTex), anti-Bcl-xl-antistof (Abcam), Anti-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (A), – caspase 7 (A), – Mcl-1, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og-PARP (C) antistof (Cell Signaling). Immunoblot billeder blev kvantificeret ved kvantitativ software (NIH).

co-immunpræcipitationseksperimenter

I alt cellelysater af paclitaxel-behandlede eller kontrollere LNCaP eller PC3 celler blev fremstillet i Chaps buffer (5 mM MgCl

2, 137 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% CHAPS, 20 mM Tris-HCI (pH 7,5)), og proteaseinhibitorer. Ca. 500 ug af proteiner blev immunpræcipiteret med Bcl-xl-antistof (Abcam) ved 4 ° C i 2 timer. Immunpræcipitater blev erobret af 50 pi af opslæmningen af ​​protein A-magnetiske perler (Millipore) i Chaps puffer ved 4 ° C natten over. Immunpræcipitater blev derefter isoleret ved magnetisk stativ og vasket tre gange i 1% CHAPS puffer. Immunpræcipitater blev elueret ved SDS-PAGE-prøvebuffer, blev underkastet SDS-PAGE og derefter immunoblotting.

Bcl-xl, Bim og Mcl-1 banke ned af siRNA

PC3 eller LNCaP-celler var podet ved 4 × 10

5-6 × 10

5 celler pr petriskål (10 cm) i 24 timer i 7 ml RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum og dyrket ved 37 ° C under 5% CO

2. Bim (Qiagen), Bcl-xl og MCL-1 (Invitrogen) siRNA blev præinkuberet i 1 ml dyrkningsmedium uden serum før transfektion, og derefter 40 pi transfektionsreagens (Qiagen) blev sat til det samme dyrkningsmedium, blandet ved vortex og inkuberet i 5 ~ 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade dannelse af transfektionskomplekser. Den endelige siRNA koncentration var omkring 5 til 10 nM efter tilsætning komplekserne drop-klogt at PC3 og LNCaP celler. Efter 24 timer blev PC3 og LNCaP celler behandlet med 50 nM paclitaxel og høstet på de angivne tidsforløb.

Statistisk analyse

En parret t-test blev anvendt til at vise den statistiske signifikans af resultaterne ved hjælp SigmaPlot 10. ** P 0,01 blev betragtet som signifikant. Data fra to uafhængige forsøg blev analyseret.

Resultater

Paclitaxel førte til mitosestandsning ved G2 /M i både PC3 og LNCaP celler

Synkroniserede PC3 eller LNCaP celler ved G1 /S blev behandlet med 50 nM paclitaxel over forskellige tidsforløb og høstet for cellecyklus analyse med flowcytometri. Vi fandt, at cellecyklus fortsatte i PC3-celler, der normalt gennem S-fasen og blev standset på det tidspunkt punkt mellem 8 og 12 timer (fig. 1A). På grund af sin langsomme proliferationshastighed, LNCaP-celler tog længere tid end PC3 at reagere til forbindelse behandling, viser cellecyklusstop mellem 36 og 48 timer (fig. 1A).

(A) Flowcytometrisk analyse af synkroniseret PC3 eller LNCaP celler behandlet med paclitaxel gennem de angivne tidsforløb. Analyser var i tre eksemplarer og repræsentative histogrammer er vist. X- og Y-akserne repræsenterer DNA-indhold og celleantal, hhv. (B) Immunofluorescens mikrograf af mikrotubuli fra synkroniserede PC3 eller LNCaP celler behandlet med paclitaxel i løbet af de angivne tidsforløb. Analyser blev duplikeret og repræsentative immunofluorescens mikrografer vises. a-tubulin blev vist ved grøn farve. DNA blev vist ved rød farve.

Så vi overvåget adfærd både mikrotubuli og kromosomer ved immunofluorescens billeddannelse med en konfokal mikroskop i samme tidsforløb. Vi observerede at paclitaxel påvirket mikrotubuli ved 4 timer og 8 timer i PC3-celler, der viser unormalt tætte mikrotubulus fordeling omkring kernen (fig. 1B). Disse unormale mikrotubuli mistet evnen til at udføre normale spindel samling, hvilket resulterer i tætte multipolære spindler ved 12 timer (fig. 1B). Virkningen af ​​paclitaxel på LNCaP-celler lignede virkningen på PC3-celler (fig. 1B). Alligevel grund af den lange overlapning cirka LNCaP, den unormale spindeldannelse i LNCaP-celler meget senere end i PC3-celler (fig. 1B).

Vores resultater tydede på, at celler behandlet med paclitaxel stadig kunne gå fremad gennem G2 og sandsynligvis indtaste G2 /M til dannelse af den defekte spindel-kromosom kompleks, bringes derefter cellecyklusstandsning ved denne fase.

Paclitaxel kørte et apoptotisk respons gennem caspase-afhængig apoptotiske veje i LNCaP, men ikke i PC3 celler, som respons på G2 /M arrest

Paclitaxel forårsagede cellecyklusstandsning ved G2 /M, omkring 8-12 timer i PC3-celler og 36-48 timer i LNCaP-celler. Dernæst undersøgte vi de apoptotiske responser udløst af paclitaxel ved at vurdere aktiveringen af ​​caspase 3 og nedbrydningen niveau af PARP. Vores resultater viste, at paclitaxel forårsagede aktiveringen af ​​caspase 3 og PARP nedbrydning i LNCaP celler til at blive vist først på 48 timer, lige efter G2 /M anholdelse, og nåede et betydeligt niveau på 72 timer (fig. 2A). I modsætning hertil vi registreret hverken aktiveringen af ​​caspase 3 eller nedbrydningen af ​​PARP i PC3-celler ved paclitaxel ved G2 /M arrest (fig. 2A). Konkluderede vi, at paclitaxel aktiveret en apoptotisk respons meget svarer til dens virkning på G2 /M anholdelse i LNCaP celler, men ikke i PC3 celler.

(A) Immunoblotanalyse af cellelysater fra synkroniseret LNCaP- og PC3 celler behandles ved paclitaxel i løbet af de angivne tidspunkter kurser til påvisning af caspase 3 og PARP med dets nedbrydningsprodukt. (B) Immunoblotanalyse af cellelysater fra de klæbede eller fritliggende fraktioner af LNCaP eller PC3 celler efter paclitaxel behandling frem tidsforløb til påvisning af spaltning form af PARP. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. PARP (c):. Spaltningen form af PARP

Paclitaxel kostede PC3 celler kun fritliggende status

Vi fandt, at paclitaxel ikke aktivere en apoptotisk respons svarende til G2 /M anholdelse i PC3 celler. Hvad er skæbnen for de PC3 celler fast i denne fase? Efter paclitaxel behandling, vi observeret, at nogle LNCaP eller PC3 celler frigjort fra bunden af ​​dyrkningsskålen. Således høstede vi celler efter inkubation med forbindelserne over forskellige tidsforløb, og samlet og analyseret de klæbede og løsrevne celler separat. Vi kiggede ind i nedbrydningen af ​​PARP i de klæbede og løsrevne fraktioner af LNCaP og PC3 celler på forskellige tidsforløb. Spaltningen form af PARP dukkede op i klæbet og løsrevne fraktioner af LNCaP-celler (fig. 2B). Denne formular kun dukkede op i de løsrevne brøkdel af PC3 celler på 48 timer (Fig. 2B).

Vi udførte også Annexin-V-FITC /PI farvning til at evaluere celledød i LNCaP eller PC3 celler. Mest adhærerede PC3 celler forblev i live, mens den vedhæftede del af LNCaP-celler viste en signifikant procentdel falder i tidlig apoptose (S1 Fig.). For fritliggende fraktion, LNCaP og PC3-celler viste sig i slutningen apoptose og nekrose (S1 Fig.).

Vi konkluderede, at timingen af ​​den tidlige apoptose i klæbet del af LNCaP-celler svarer til G2 /M arrest mens de PC3 celler har faktisk vise en resistens fænotype til paclitaxel behandling. Død i de løsrevne fraktioner af LNCaP og PC3 syntes relateret til celle løsrivelse samt cellulære stress forårsaget af paclitaxel.

Ekspression af Bim, Bak, Bax, Bcl2, Bcl-xl og Mcl-1 i LNCaP og PC3 celler efter behandling med paclitaxel

for at spørge, hvorfor caspase 3-afhængig apoptose forekommer i LNCaP, men ikke i PC3 celler som reaktion på G2 /M anholdelse, vi kontrollerede det protein niveau af Bim, Bak, Bax, BCL2, Bcl-xl og Mcl-1. Vores resultater viste, at proteinniveauet af Bim aftog med tiden efter paclitaxel behandling i LNCaP og PC3-celler (fig. 3A). I modsætning hertil proteinniveauet af Bak, Bax, Bcl-xl og Mcl-1 ikke ændres væsentligt under de samme betingelser (fig. 3A og B). Vi kunne ikke afsløre eventuelle Bcl2 proteiner i LNCaP-celler (fig. 3B). Interessant, PC3-celler udtrykte en betydelig mængde Bcl2 proteiner med eller uden paclitaxel behandling (fig. 3B). Vi derefter sammenlignet proteinniveauet af Bim, Bcl-xl og Mcl-1 mellem LNCaP og PC3-celler. Resultaterne afslørede, at ekspression af Bd-XL og Mcl-1 i PC3-celler er langt højere end i LNCaP-celler (fig. 3C). Derfor kan overekspressionen af ​​Bcl2, Bcl-xl og Mcl-1 i PC3-celler bidrage til deres paclitaxel modstand.

(A) Ekspressionen af ​​BH3-only protein Bim og pro-apoptotiske proteiner, herunder både Bak og Bax, i LNCaP og PC3-celler. (B) Ekspression af anti-apoptotiske proteiner, herunder Bcl2, Bcl-xl og Mcl-1 i LNCaP eller PC3-celler. Immunoblotanalyse af cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med paclitaxel over tid som angivet. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. (C) Sammenligning af Bim, Bcl-xl og Mcl-1 mellem LNCaP og PC3 celler med /uden paclitaxel behandling. Immunoblotanalyse af cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet i 48 timer. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. Immunoblot billeder af Bim, Bcl-xl, Mcl-1 og α-tubulin i LNCaP og PC3 med /uden paclitaxel behandling blev kvantificeret ved ImageJ. De udlæsninger, defineret som arbitrære lysenheder, af Bim, Bcl-xl og Mcl-1 normaliseret til udlæsning af α-tubulin er vist på højre side. (**) Statistisk signifikans mellem to udlæsninger.

Bim niveau LNCaP- eller PC3 celler faldt drastisk efter paclitaxel behandling, og korreleret med celledød (fig. 3A). Vi spurgte, hvorfor niveauet af Bim blev signifikant reduceret efter paclitaxel behandling. Igen, vi indsamlet og analyseret data for de klæbede og løsrevne celler separat. Reduceret Bim optrådte kun i den fritliggende fraktion, mens det forblev konstant i klæbet fraktion i både LNCaP- og PC3 celler efter paclitaxel behandling (S2 Fig.). Således kan det reducerede Bim-niveau ikke relateret til dets rolle i den apoptotiske vej.

Dernæst spurgte vi, hvis Bim indebærer i paclitaxel-induceret apoptose pathway i prostatakræft ved RNAi knockdown og co-immunpræcipitationseksperimenter, da Bim er en main BH3-only protein kræves for paclitaxel-induceret apoptose i brystcancere [25]. Forskellig fra brystcancer, vores resultater viste, at Bim knockdown ikke kan påvirke paclitaxel-induceret apoptose i LNCaP-celler (S3 Fig.). Desuden blev ingen signifikant interaktion mellem Bim og Bcl-xl observeret i undersøgelsesperioden (S3 Fig.). Disse resultater antydede, at Bim ikke er et afgørende BH3-only protein er ansvarlig for paclitaxel-induceret apoptose i prostatakræft.

Bcl-xl eller Mcl-1 knockdown øger apoptose i LNCaP-celler, men ikke PC3-celler

for at spørge, om overekspression af Bcl2, Bcl-xl og Mcl-1 i PC3 celler kan bidrage til deres paclitaxel modstand, vi først udforsket, hvilken af ​​dem kan engagere sig i apoptotiske vej. Resultaterne viste, at Bcl-xl knockdown af siRNA signifikant øget aktivering af caspase 3 og nedbrydningen af ​​PARP i LNCaP-celler (fig. 4). MCL-1 knockdown også øget aktivering af caspase 3 og nedbrydningen af ​​PARP i LNCaP-celler, men dens virkning var ikke så god som Bcl-xl knockdown (Fig. 4). Disse resultater antydede, at Bcl-xl kan være en vigtig faktor, der påvirker paclitaxel-inducerede apoptosecyklus i LNCaP-celler.

Bcl-xl og Mcl-1 knockdown forårsagede øget apoptose som bestemt ved aktiveringen af ​​caspase 3 og PARP nedbrydning i LNCaP-celler, men ikke i PC3-celler. LNCaP eller PC3-celler blev transient transficeret med Bim, Bcl-xl eller Mcl-1 siRNA eller krypteret siRNA i 24 timer. Celler blev behandlet med /uden 50 nM paclitaxel i 48 timer, og derefter underkastet immunoblotanalyse. Caspase 3 (a): den aktive form af caspase 3. PARP (c): spaltningen form af PARP. Bd-XL (s): den korte eksponering foto af Bcl-xl. Bd-XL (l): den lange eksponering billede af Bcl-xl. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. De respektive udlæsninger af immunblottet billeder af Bd-XL, Mcl-1 og caspase 3 (a) normaliseret til a-tubulin i LNCaP-celler er vist i bunden. Kun knockdown med /uden paclitaxel behandling blev kvantificeret. (**) Statistisk signifikans mellem to udlæsninger.

Vi derefter udførte de samme analyser i PC3 celler. Vi havde svært vælte Bd-XL effektivt i PC3-celler, sandsynligvis på grund af det høje niveau af dette protein (fig. 4). I modsætning hertil blev proteinniveauet af Mcl-1 signifikant reduceret med dens siRNA men denne knockdown havde ingen effekt på aktiveringen af ​​caspase 3 og nedbrydningen af ​​PARP i PC3-celler (Fig. 4).

Overekspressionen af Bd-xl bidrog mest til paclitaxel resistente fænotype i PC3 celler

Da vi ikke effektivt kunne vælte Bcl-xl for at evaluere dens virkning på paclitaxel-induceret apoptose i PC3 celler, vores alternative tilgang var at bruge ABT -263 til kemisk knockdown af Bcl2 og Bd-XL samtidig. Desuden har vi brugt ABT-199, en specifik inhibitor af Bcl2, at skelne mellem Bcl2 og Bcl-xl i PC3-celler. Brug af ABT-263 inducerede nedbrydning af PARP og aktiveringen af ​​caspase 3 i både LNCaP og PC3-celler (fig. 5A). virkningen af ​​ABT-263 på LNCaP-celler var imidlertid ca. 3 gange større end for PC3 i form af caspase 3-aktivering (fig. 5A). Betydeligt, har ABT-199 ikke vise nogen apoptotisk effekt på hverken LNCaP og PC3 celler, udelukker en anti-apoptotisk rolle Bcl2 i PC3.

(A) ABT-263, men ikke ABT-199, kunne effektivt udløse PARP nedbrydning i LNCaP og PC3-celler på en dosisafhængig måde, men det kunne kun aktivere caspase 3 til et påviseligt niveau i LNCaP-celler. Immunoblotanalyse af cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med ABT-199 eller ABT-263 alene i 48 timer ved forskellige koncentrationer blev analyseret som angivet. Caspase 3 (a): den aktiverede form af caspase 3. Caspase 7 (a): aktivering form af caspase 7. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. De udlæsninger af caspase 3 (a) normaliseret til GAPDH mellem LNCaP og PC3-celler behandlet med 5 uM af ABT-263 er vist ved bunden. (**) Statistisk signifikans mellem to aflæsninger. (B) Kombinationen af ​​50 nM paclitaxel med forskellige koncentrationer af ABT-263 havde en synergistisk virkning på apoptose i både LNCaP og PC3-celler. Effekten af ​​ABT-263 i kombination med paclitaxel i LNCaP-celler var højere end i PC3-celler. Immunoblotanalyse af cellelysater fra LNCaP eller PC3-celler behandlet med paclitaxel i kombination med ABT-263 eller ABT-263 alene i 48 timer ved forskellige koncentrationer blev analyseret som angivet. Caspase 3 (a): den aktiverede form af caspase 3. Caspase 7 (a): aktivering form af caspase 7. Forsøg blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater er vist. De respektive udlæsninger af caspase 3 (a) normaliseret til den interne kontrol, α-tubulin eller GAPDH i LNCaP eller PC3 med LNCaP vises nederst. (**) Statistisk signifikans mellem to udlæsninger.

Kollektivt tyder resultaterne, at Bcl-XL er den vigtigste faktor i apoptose og dets overekspression bidrager til fænotype til paclitaxel behandling i PC3-celler. Derudover fandt vi også, at PC3 celler viser delvis resistens mod ABT-263 behandling, hvis svaret fra LNCaP til den samme behandling betragtes som en fuld respons.

Kombinationen af ​​ABT-263 med paclitaxel viste en synergistisk effekt på apoptose i både LNCaP og PC3-celler

Vi har vist, at ABT-263 alene kan drive paclitaxel-følsomme og paclitaxel-resistente celler mod apoptose, selv om paclitaxel-sensitive LNCaP-cellelinje viser bedre virkninger end de paclitaxel- resistent PC3 cellelinie. Vi vurderes yderligere kombinationen effekt af ABT-263 med paclitaxel. Betydeligt, vores resultater viste, at ABT-263 i kombination med paclitaxel havde en synergistisk virkning på apoptose i både LNCaP og PC3-celler (Fig. 5B). Effektiviteten af ​​denne kombination behandling var større i LNCaP-celler end i PC3-celler (Fig. 5B).

Synergien mellem paclitaxel og ABT-263 til aktivering af apoptose tydeligt vist, ABT-263 kan modvirke Bd-XL i paclitaxel-følsomme og paclitaxel-resistente prostatacancerceller. Målretning anti-apoptotiske proteiner har potentialet til at forbedre kemoterapi for prostatakræft. forskellen i apoptose aktivering mellem LNCaP og PC3-celler for ABT-263 alene eller ABT-263 i kombination med paclitaxel foreslås imidlertid, at den apoptose pathway i PC3-celler kan afvige yderligere fra den i LNCaP-celler selv efter Bcl-xl medregnes.

diskussion

i vores undersøgelse paclitaxel udløste tidlig apoptose i vedhængende brøkdel af LNCaP celler som reaktion på G2 /M anholdelse. I modsætning hertil kunne tidlig apoptose ikke påvises i den samme fraktion af PC3-celler over hele tidsforløbet, hvilket antyder, at PC3-celler ikke reagerer på G2 /M arrest at indlede denne død program. Interessant, PC3 celledød indtraf i en fritliggende status efter paclitaxel behandling primært gennem nekrose. Desuden Bim niveau kun faldt i fritliggende del af begge celler efter paclitaxel-behandling. Hvorvidt faldet i Bim-niveauer er relateret til celledød i fritliggende betingelser stadig mangler at blive løst. En anden undersøgelse viste, at Bim knockdown i prostata og bryst kræftceller forårsagede celle løsrivelse og i sidste ende apoptose [26]. Men vi ikke observere fænomenet er beskrevet i rapporten.

Om celle løsrivelse kan ske

in vivo

i antimitotiske terapier er et interessant spørgsmål, der mangler at blive fastlagt. Logisk set kan cancerceller omgivet af bindevæv være meget svært at løsne sig fra kræftvæv efter antimitotisk kemoterapi. Således celledød som respons på G2 /M standsning i en klæbet tilstand bliver det kritiske punkt for at vurdere, om celler er følsomme eller resistente over for behandling med paclitaxel. I den aktuelle undersøgelse påviste vi, at LNCaP-celler udviser følsomhed over for paclitaxel behandling, hvorimod PC3-celler viser resistens.

Vi viste også, at overekspression af Bcl-xl kan bidrage til apoptose-resistente fænotype af PC3-celler. Det forekommer, at apoptose signalet induceret af paclitaxel behandling kan være ikke tilstrækkeligt til at modvirke overekspression af anti-apoptotiske proteiner, såsom Bcl-xl i PC3-celler. Denne spekulation understøttes yderligere af kombinationen af ​​paclitaxel med ABT-263, som havde synergistiske virkninger på aktiveringen af ​​caspase 3 og forringelsen af ​​PARP sammenlignet med paclitaxel eller ABT-263 alene.

Faktisk en undersøgelse har peget ud at overekspression af Bcl-xl i high-grade prostatacarcinom er forbundet med en hormon-refraktorisk fænotype [27].