PLoS ONE: Kombination af α-Tomatine og Curcumin inhiberer vækst og fremkalder apoptose i Human prostatacancerceller

Abstrakt

α-Tomatine er en glycoalkaloid findes i tomater og curcumin er en stor gul pigment af gurkemeje. I den foreliggende undersøgelse blev den kombinerede virkning af disse to forbindelser på prostatacancerceller undersøgt. Behandling af forskellige prostatacancerceller med curcumin eller α-tomatine alene resulterede i væksthæmning og apoptose i en koncentrationsafhængig måde. Kombinationer af α-tomatine og curcumin hæmmede synergistisk vækst og apoptose i prostatacancer PC-3-celler. Virkninger af kombinationen α-tomatine og curcumin var forbundet med synergistisk inhibering af NF-KB-aktivitet og en potent fald i ekspressionen af ​​sin nedstrøms gen Bcl-2 i cellerne. Endvidere blev stærke fald i niveauerne af phospho-Akt og fosfor-ERK1 /2 findes i PC-3-celler behandlet med α-tomatine og curcumin i kombination. I dyreforsøg blev SCID-mus med PC-3 xenotransplantattumorer behandlet med α-tomatine og curcumin. Kombination af α-tomatine og curcumin hæmmede mere potent væksten af ​​PC-3 tumorer end alene enten agent. Resultater fra den foreliggende undersøgelse viser, at α-tomatine i kombination med curcumin kan være en effektiv strategi til inhibering af væksten af ​​prostatakræft

Henvisning:. Huang H, Chen X, Li D, He Y, Li Y, du Z, et al. (2015) Kombination af α-Tomatine og Curcumin inhiberer vækst og fremkalder apoptose i Human prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (12): e0144293. doi: 10,1371 /journal.pone.0144293

Redaktør: Hong Wang, Rutgers, staten Univesity i New Jersey, USA

Modtaget: 7. oktober, 2015; Accepteret: November 16, 2015; Udgivet: December 2, 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Guangdong-provinsen, Leadership tilskud 2011 (https://pro.gdstc.gov.cn/egrantweb/), National Natural Science Foundation of China, 81.272.452, 21.102.020 og 21.272.043 (http : //www.nsfc.gov.cn/), National Cancer Institute, P30-CA072720 (https://www.nih.gov/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er en af ​​de mest almindelige cancerformer i europæiske og amerikanske mænd og har en høj dødelighed [1]. De fleste patienter demonstrere en første reaktion på hormonal manipulation, men desværre langt størstedelen af ​​patienterne fremskridt at udvikle hormon-refraktær sygdom. Mens nyere anti-androgen og kemoterapi er tilgængelige for patienter med androgen-uafhængig prostatacancer, disse midler er af væsentlig toksicitet og er kun midlertidigt effektiv [2-5]. Derfor roman og mindre giftige metoder til behandling af prostatacancer ville være til stor gavn for patienterne.

Curcumin (figur 1) er en stor gul pigment af gurkemeje

Curcuma longa

Linn. Gurkemeje er en fælles krydderi i asiatiske fødevarer og har en lang tradition for medicinsk anvendelse i de asiatiske lande. Curcumin har omfattende biologiske og farmakologiske funktioner, herunder anticancer, anti-inflammatorisk, og antioxidant [6-8]. Curcumin er blevet evalueret i kliniske forsøg til behandling af leversygdomme, leddegigt, infektionssygdomme og kræft [9, 10]. På trods af sin lovende biologiske effekt i prækliniske studier, er den kliniske anvendelighed af curcumin mindskes ved sin ringe biotilgængelighed [11]. Selvom mange curcumin analoger er blevet udviklet for at forbedre den terapeutiske effektivitet, biotilgængelighed og toksiske bivirkninger af disse forbindelser behøver yderligere undersøgelser [12-18]. Kombinere curcumin med andre anticancermidler er en effektiv strategi til at forbedre dets anticancer effekt, og faktisk tidligere studier har vist, at kombinationer af curcumin med andre anticancermidler har forbedret anticancer effektiviteter [19-21].

α -Tomatine (figur 1) er et naturligt forekom steroide glycoalkaloid i tomater (

Lycopersicon

esculentum). Umodne grønne tomater indeholder op til 500 mg α-tomatine /kg frisk frugt vægt. Stoffet er delvist nedbrudt som tomat modnes indtil modenhed niveauer i røde tomater er omkring 5 mg /kg frisk frugt vægt [22]. I planter, kan α-tomatine tilvejebringe forsvar mod patogene svampe, bakterier og vira [22]. De anticancer aktiviteter α-tomatine og dets virkningsmekanismer er blevet undersøgt i de senere år. In vitro studier viste, at α-tomatine hæmmede væksten af ​​forskellige humane cancerceller [23-25]. Nylige undersøgelser viste også, at α-tomatine hæmmede væksten af ​​brystkirtler og prostatatumorer hos mus [26, 27]. En kombination af α-tomatine og paclitaxel blev fundet synergistisk øge apoptose af humane prostata kræftceller [28].

Der er stigende interesse for at bruge en kombination af lave doser af anticancer midler, der adskiller sig i deres virkemåder snarere end indgivelse af et enkelt middel med en høj dosis. Kombinationer af anticancermidler, som har forskellige virkningsmekanismer kan have synergistisk virkning på inhibering af væksten og inducere apoptose i prostatacancerceller. Selvom den inhiberende virkning af α-tomatine eller curcumin på prostatacancer var blevet undersøgt, har ingen undersøgelser undersøgt den kombinerede virkning af disse to midler på prostatacancerceller dyrket in vitro og dyrket som xenotransplantattumorer in vivo. Undersøgelser viste, at virkningen af ​​curcumin og α-tomatine på cancerceller var forbundet med inhibering af NF-KB-aktivering [7, 17, 24, 26]. Vi antager, at kombinationen af ​​lave koncentrationer af curcumin og α-tomatine vil synergistisk hæmme NF-KB-aktivering fører til stærk vækst hæmning og apoptose induktion i prostata kræftceller. Den foreliggende undersøgelse blev derfor designet til at undersøge virkningen af ​​α-tomatine i kombination med curcumin ved lave koncentrationer på vækst og apoptose i humane prostatacancerceller. Virkninger af α-tomatine og curcumin i kombination på NF-KB og relaterede molekylære veje blev bestemt. Vores undersøgelse forudsat den første bevis på, at en kombination af lave koncentrationer af α-tomatine og curcumin stærkt hæmmet prostatakræft celler dyrket in vitro og dyrkes som xenotransplantattumorer i immunsvækkede mus.

Materialer og metoder

celledyrkning og reagenser

RWPE-1, LNCaP, VCap og PC-3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Curcumin, α-tomatine, propylenglycol, polysorbat 80, benzylalkohol, ethanol og DMSO var fra Sigma (St. Louis, MO). Matrigel blev opnået fra BD Biosciences (Bedford, MA). RPMI-1640 vævskulturmedium, penicillin-streptomycin, L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) var fra Gibco (Grand Island, NY). RWPE-1-celler blev opretholdt i serumfrit keratinocyt-medium (K-SFM, 17.005-042) fra Gibco (Grand Island, NY). LNCaP, VCap og PC-3-celler blev holdt i RPMI-1640 dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS, der blev suppleret med penicillin (100 enheder /ml) -streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin (300 ug /ml). Dyrkede celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og blev passeret to gange om ugen.

Bestemmelse af antallet af levedygtige celler

Antallet af levedygtige celler efter hver behandling blev bestemt ved anvendelse af et hæmacytometer under et lysmikroskop (Nikon Optiphot, Japan). Cellelevedygtighed blev bestemt ved trypanblåt-udelukkelse assay, som blev udført ved at blande 80 pi cellesuspension og 20 pi 0,4% trypan blå opløsning i 2 min. Blue-celler blev talt som døde celler og de celler, som ikke absorberer farvestof blev talt som levende celler.

Bedømmelse af apoptotiske celler

Apoptose blev bestemt ved morfologisk vurdering i celler farvet med propidiumiodid ( PI) [29]. Apoptotiske celler blev identificeret ved klassiske morfologiske funktioner, herunder cellekernekondensation, celleskrumpning, og dannelse af apoptotiske legemer [29]. Apoptose blev også bestemt ved Annexin V /PI dobbelt farvning-assay under anvendelse fluoresceinisothiocyanate (FITC) -mærket Annexin V /PI apoptose detektion kit (BD Bioscience, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler efter behandling opsamles, vaskes i koldt phosphatbufret saltvand (PBS) to gange, farvet med FITC-konjugerede Annexin V og PI farvestoffer. Eksternalisering af phoshotidylserine og permeabilitet til PI blev evalueret ved FACS Calibur flowcytometer (BD Bioscience, San Jose, CA). Data fra 10.000 gated hændelser pr prøve blev indsamlet. Celler i tidlige stadier af apoptose var positivt farvet med Annexin V. Celler i sen apoptose blev positivt farvet med både Annexin V og PI.

Western blot-analyse

Efter behandling de cellelysater blev forberedt som tidligere beskrevet [30]. Proteiner blev underkastet natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulose-membran. Efter blokering specifikke bindingssteder med blokerende buffer blev membranen inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer (# 4051 for fosfor-Akt og # 4376 for fosfor-ERK1 /2-, både fra Cell Signaling Co., Beverly, MA; 05 -729 til Bcl-2 fra Millipore Co., Billerica, MA). Den β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Efter fjernelse af det primære antistof blev membranen vasket tre gange med TBS (PBS indeholdende 0,05% Tween 20) puffer ved stuetemperatur og derefter inkuberet med fluorochrom-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA). Membranen blev derefter vasket med TBS tre gange. Final detektion blev udført med Li-Cor Odyssey infrarød billeddannelse-system (Li-Cor Bioteknologi, Lincoln, NE).

NF-KB-afhængig reporter genekspression assay

NF-KB transkriptionel aktivitet var målt ved NF-KB-luciferase reportergenekspression assay. En NF-KB luciferase konstruktion blev stabilt transficeret ind i PC-3-celler og en enkelt stabil klon, PC-3 /N [17], blev anvendt i den foreliggende undersøgelse. Kort fortalt blev PC-3 /N-celler behandlet med curcumin eller α-tomatine alene eller i kombination i 24 timer, og NF-KB-luciferase-aktiviteter blev målt under anvendelse af luciferase assay kits fra Promega (Madison WI, USA). Efter behandlingerne blev cellerne vasket med iskold phosphatpufret saltopløsning (PBS) og høstet i 1 x reporter lysis buffer. Efter centrifugering blev 10 pi prøver af supernatanterne målt for luciferaseaktivitet ved anvendelse af et luminometer fra Turner Designs Instrument (Sunnyvale, CA, USA). Luciferaseaktiviteten blev normaliseret mod kendte proteinkoncentrationer og udtrykt som procent af luciferaseaktivitet i kontrolcellerne, som blev behandlet med DMSO opløsningsmiddel. Proteinniveauet blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay Kits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Dannelse og vækst af PC-3 tumorer i immundefekte mus

Male svær kombineret immundefekt (SCID) mus (6-7 uger gamle) blev opnået fra Taco Farms Inc (Germantown, NY). Dyrene blev huset i sterile filter-capped microisolator bure og forsynet med steriliseret mad og vand. Prostatacancer PC-3-celler (2 x 10

6 celler /0,1 ml /mus) suspenderet i 50% Matrigel (Collaborative Research, Bedford, MA) i RPMI 1640 medium blev injiceret subkutant i den højre flanke af musene. Efter ca. 4 uge blev mus med etablerede xenotransplantattumorer injiceret med vehikel, α-tomatine (5 mg /kg), curcumin (5 mg /kg), eller α-tomatine (5 mg /kg) + curcumin (5 mg /kg ) en gang hver tredje dag i 30 dage. Hver gruppe havde 9 mus og alle dyr fik samme mængde vehikel (5 pl /g kropsvægt), som bestod af propylenglycol, polysorbat 80, benzylalkohol, ethanol og vand (40: 0,5: 1: 10: 48,5). Tumorstørrelse (længde x bredde) og kropsvægt blev målt hver tredje dag. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev musene aflivet, tumorerne blev udskåret, vejet og anbragt i phosphatpufret formalin ved stuetemperatur i 48 h og derefter placeret i ethanol i 48 timer, før der udarbejdes paraffinsnit som tidligere beskrevet [31]. Dyret Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institute of Health. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra Rutgers (RU02-001). Denne protokol er godkendt vores nuværende dyreforsøg udnytte SCID mus xenograft model til at bestemme virkningerne af naturligt forekom forbindelser (α-tomatine og curcumin) på væksten af ​​prostata tumorer.

Immunhistokemi

immunhistokemisk farvning af prolifererende cellekerneantigen (PCNA) blev anvendt til at bestemme proliferationen af ​​PC-3-tumorceller. I korte træk blev paraffinsnit af tumorvæv fremstilles og forarbejdes til immunhistokemisk farvning. Tumor snit blev inkuberet med et primært PCNA-antistof (MAB424, Millipore Corp. Billerica, MA, USA) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), blev sektionerne inkuberet med et biotinyleret sekundært antistof i 30 minutter efterfulgt af inkubering med peberrod peroxidase konjugeret-avidin opløsning i 30 minutter ved anvendelse af Elite ABC-kittet (PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). PCNA farvning i tumorceller (brun farve i kernen) blev undersøgt under et mikroskop (Nikon Optiphot, Nikon, Tokyo, Japan). Mindst 1000 celler blev talt for hver sektion.

statistiske analyser

Den potentielle synergistiske virkning af α-tomatine eller curcumin blev vurderet af isobolen metode [32], ved hjælp af ligningen Ac /Ae + Bc /Be = kombination index (CI). Ac og Bc repræsenterer koncentrationen af ​​lægemiddel A og stof B anvendes i kombination, og Ae og Be repræsenterer koncentrationen af ​​lægemiddel A og B, der producerede den samme størrelsesorden af ​​virkning ved anvendelse alene. Hvis CI er 1, så de stoffer anses for at virke synergistisk. Hvis CI er 1 eller = 1, så de lægemidler virker på en antagonistisk eller additiv måde, hhv. Variansanalyse (ANOVA) model med Tukey-Kramer justering blev anvendt til sammenligning af apoptose i PC-3-celler mellem forskellige behandlingsgrupper, og til sammenligning af legemsvægt, tumorstørrelse, tumorvægt og tumorproliferation i dyr blandt forskellige behandlingsgrupper i slutningen af ​​forsøget.

Resultater

α-Tomatine og curcumin hæmmer væksten af ​​prostata kræftceller

i indledende undersøgelser, virkningerne af α-tomatine eller curcumin alene i forskellige prostatacancerceller blev bestemt. Human prostatacancer LNCaP, VCap (androgen-afhængige) og PC-3 (androgen-uafhængige) -celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af α-tomatine og curcumin i 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved trypanblåt-udelukkelse assay. Som vist i figur 2A, behandling af forskellige prostatacancerceller med α-tomatine resulterede i en koncentrationsafhængig reduktion i antallet af levedygtige celler. Behandling af cellerne med curcumin resulterede også i en koncentrationsafhængig reduktion i antallet af levedygtige celler (figur 2B). Virkningerne af curcumin og α-tomatine på cellevækst var ens blandt de testede tre prostata cancer cellelinjer. Som vist i fig 2C, α-tomatine og curcumin i kombination havde mere potent inhibitorisk virkning på LNCaP, VCap og PC-3-celler. Kombinationen indeks (Cl) for IC

50 blev beregnet som 0,69, 0,72 og 0,48 for LNCaP, VCap og PC-3-celler, hhv. Dette resultat viser, at kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin synergistisk hæmmer væksten af ​​dyrkede prostatacancerceller. Curcumin og α-tomatine alene eller i kombination havde en lille inhiberende virkning på væksten af ​​ikke-tumorigene prostata epitel RWPE-1-celler (figur 2C).

Humane prostatacancerceller (LNCaP, VCap og PC-3 ) og ikke-tumorigene prostata epithelceller (RWPE-1) blev podet ved en densitet på 0,2 x 10

5 celler /ml i 35 mm vævskulturskåle og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af alene eller i kombination i 72 timer α-tomatine og curcumin. Levedygtige celler blev bestemt ved trypanblåt-udelukkelse assay. (A) Procent cellelevedygtighed i de forskellige cellelinjer behandlet med α-tomatine. (B) Procent cellelevedygtighed i de forskellige cellelinjer behandlet med curcumin. (C) Procent cellelevedygtigheden i de forskellige cellelinjer blev behandlet med α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 uM) alene eller i kombination. Hver værdi repræsenterer gennemsnit ± SE fra tre separate forsøg.

α-Tomatine og curcumin inducere apoptose i PC-3 celler

Effekten af ​​α-tomatine og curcumin på induktion af apoptose i prostatacancerceller blev bestemt under anvendelse morfologisk vurdering og Annexin V /PI dobbelt farvning. Som vist i tabel 1, behandling af prostatacancer LNCaP, VCap og PC-3-celler med α-tomatine eller curcumin resulterede i mindre stigning i antallet af apoptotiske celler. Kombinationer af α-tomatine og curcumin havde mere potent stimulerende virkning på apoptose end hvert middel anvendt alene. Curcumin og α-tomatine alene eller i kombination havde en lille til moderat effekt på stimulering af apoptose i ikke-tumorigene prostata epitel RWPE-1-celler (tabel 1). Statistisk analyse for synergi viste, at α-tomatine og curcumin havde en stærkere synergistisk effekt på PC-3-celler (CI = 0,77) end på LNCaP (CI = 0,90) og VCAP (CI = 0,96) celler. Da kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin havde en stærkere synergistisk effekt på apoptose induktion i androgen-uafhængige PC-3 celler, vi valgte PC-3 linje for yderligere

in vitro

in vivo

undersøgelser. Induktion af apoptose i PC-3-celler behandlet med α-tomatine og curcumin blev også bestemt ved forsøg med Annexin V /PI dobbelt farvning. I disse analyser blev cellerne i de tidlige stadier af apoptose farves positivt med Annexin V, mens celler i sene stadier af apoptose blev farvet positivt med både Annexin V og PI. Fig 3A viser et repræsentativt resultat fra flowcytometer analyse. Som vist i fig 3B, α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 uM) havde lille til moderat effekt på stimulering af apoptose, og kombinationen af ​​de to midler forårsagede en væsentlig stigning i apoptose. Statistisk analyse ved anvendelse af ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste, at procentdelen af ​​apoptotiske celler i kombinationen var væsentligt højere end i α-tomatine-behandlede gruppe (

s Restaurant 0,001), og at i curcumin-behandlede gruppe (

s Restaurant 0,001).

PC-3-celler blev podet ved en densitet på 0,5 x 10

5 celler /ml i 100 mm vævskulturskåle og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med alene eller i kombination i 48 timer α-tomatine og curcumin. Apoptose blev bestemt ved Annexin V /PI dobbelt farvning-assay under anvendelse af FITC-mærket Annexin V /PI apoptose afsløring kit og flowcytometer analyse. (A) repræsentativt resultat fra flowcytometer analyse er vist. (B) Procentdel af tidlig fase apoptotiske celler (venstre), sent stadium apoptotiske celler (i midten) og totale apoptotiske celler (til højre). Hver værdi repræsenterer gennemsnit ± SE fra tre separate forsøg.

hæmmende virkning af α-tomatine og curcumin på NF-KB og dens downstream-target Bcl-2

En luciferase reportergenekspression assay blev anvendt til at bestemme virkningen af ​​α-tomatine og curcumin på aktivering af NF-KB. PC-3 /N er en cellelinie afledt fra stabil transfektion af PC-3-celler med en NF-KB luciferase-konstruktion [17]. PC-3 /N-celler blev behandlet med alene eller i kombination i 24 timer α-tomatine og curcumin. Behandling af PC-3 /N-celler med α-tomatine (1-5 uM) eller curcumin (5-20 uM) alene resulterede i fald i luciferaseaktivitet i koncentrationsafhængig måde (figur 4). Lavere koncentrationer af α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 eller 10 uM) havde lille til moderat hæmmende på luciferaseaktivitet, og kombinationerne af α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 eller 10 uM) havde meget stærkere virkninger end enten alene agent (Fig 4). Statistisk analyse for synergi viste, at α-tomatine og curcumin i kombination havde en synergistisk virkning på formindskelse af NF-KB luciferaseaktivitet (CI = 0,56). Virkningen af ​​α-tomatine og /eller curcumin på niveau af anti-apoptotisk protein Bcl-2, som er en nedstrøms target af NF-KB blev bestemt ved Western blot analyse. Behandling med α-tomatine eller curcumin alene havde ringe eller ingen virkning på størrelsen af ​​Bcl-2, mens kombinationen havde en stærk inhibitorisk virkning på ekspressionen af ​​dette protein (figur 5). måling Bandet tæthed viste, at niveauet af Bcl-2 i forhold til kontrol (1,00) var 0,89 i celler behandlet med curcumin, 0,92 i celler behandlet med α-tomatine og 0,41 i celler behandlet med kombinationen af ​​α-tomatine eller curcumin (Fig 5).

PC-3 /N-celler blev podet ved en densitet på 0,2 x 10

5 celler /ml medium i 12-brønds plader og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med α-tomatine alene eller i kombination med curcumin i 24 timer. NF-KB transkriptionel aktivitet blev målt ved en luciferaseaktivitet assay. Hver værdi repræsenterer middelværdi ± SE fra tre separate forsøg.

Cellerne blev podet ved en densitet på 1 x 10

5 celler /ml medium i 100 mm dyrkningsskåle og inkuberet i 24 timer . Cellerne blev derefter behandlet med α-tomatine eller curcumin alene og i kombination i 24 timer (til analyse af fosfor-Akt og phosphor-ERK1 /2) og 48 timer (til analyse af Bcl-2). Niveauerne af Bcl-2, phospho-Akt og phospho-ERK1 /2 blev bestemt ved Western blot analyse. Bandet tæthed blev målt og normaliseret til actin.

Effekter af α-tomatine og curcumin på niveauet af phospho-Akt og phospho-ERK1 /2

Niveauet af aktiveret ERK1 /2 og Akt i PC-3-celler blev vurderet ved Western blot-analyse ved anvendelse af anti phospho-ERK1 /2 og phospho-Akt antistoffer. Behandling af PC-3-celler med α-tomatine (1 uM) resulterede i en moderat til stærk nedgang i niveauet af phospho-Akt mens curcumin (5 uM) alene havde ringe eller ingen virkning (figur 5). En kombination af α-tomatine og curcumin havde en potent virkning på formindskelse af niveauet af phospho-Akt. målemærke tæthed viste, at niveauet af phospho-Akt forhold til kontrol (1,00) var 0,99 i celler behandlet med curcumin, 0,51 i celler behandlet med α-tomatine og 0,26 i celler behandlet med kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin (Fig 5 ). Behandling af PC-3-celler med α-tomatine (1 uM) eller curcumin (5 uM) alene resulterede i små til moderat fald i niveauet af phospho-ERK1 /2, og kombinationen af ​​α-tomatine (1 uM) og curcumin (5 uM) forårsagede en stærkere fald i niveauet af phospho-ERK1 /2 end enten alene middel (figur 5). Niveauet af phospho-ERK1 forhold til kontrol (1,00) som bestemt ved måling band tæthed var 0,66 i celler behandlet med curcumin, 0,75 i celler behandlet med α-tomatine og 0,31 i celler behandlet med kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin (Fig 5). Niveauet af phospho-ERK2 forhold til kontrol (1,00) var 0,58 i celler behandlet med curcumin, 0,69 i celler behandlet med α-tomatine og 0,30 i celler behandlet med kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin (Fig 5).

Virkninger af α-tomatine og curcumin på væksten af ​​PC-3 tumorer i SCID-mus Salg

SCID mus, der bærer PC-3 xenotransplantattumorer blev behandlet med IP injektioner med vehikel (5 pl /g legemsvægt) , α-tomatine (5 mg /kg), curcumin (5 mg /kg), eller α-tomatine (5 mg /kg) + curcumin (5 mg /kg) tre gange om ugen i 30 dage. Som vist i figur 6A, behandling med α-tomatine eller curcumin alene havde en moderat inhibitorisk virkning på væksten af ​​PC-3 tumorer mens kombinationen havde en potent virkning på inhibering af væksten af ​​tumorerne. Middelværdien ± S.E. for procent indledende tumorstørrelse ved afslutningen af ​​forsøget var 277,6 ± 18,6 for kontrolgruppen, 217,3 ± 10,5 til α-tomatine-behandlede gruppe, 207,3 ± 15,6 til curcumin-behandlede gruppe, 151,2 ± 9,6 for kombinationen-behandlede gruppe. Statistisk analyse ved hjælp ANOVA med Tukey-Krama multipel sammenligning test viste statistisk signifikante forskelle i den gennemsnitlige tumorstørrelse mellem kontrolgruppen og α-tomatine-behandlede gruppe (

s

0,05), mellem kontrolgruppen og curcumin-behandlede gruppe (

s

0,01), og mellem kontrolgruppen og kombinationen-behandlede gruppe (

s

0,001). Den gennemsnitlige tumorstørrelse i kombinationen var væsentligt mindre end i α-tomatine-behandlede gruppe (

s Restaurant 0,05), og at i curcumin-behandlede gruppe (

s Restaurant 0,05).

Male SCID-mus blev injiceret subkutant med PC-3-celler (2 x 10

6 celler /0,1 ml) suspenderet i 50% Matrigel i RPMI-medium. Efter ca. 4 uger blev mus med PC-3 xenograft tumorer (0,6-1,0 cm bred og 0,6-1,0 cm lange) ip injiceret med vehikel, α-tomatine (5 mg /kg legemsvægt), curcumin (5 mg /kg legemsvægt vægt), og en kombination af α-tomatine (5 mg /kg legemsvægt) og curcumin (5 mg /kg legemsvægt) hver tredje dag i 30 dage. Immunhistokemisk farvning af PCNA blev gjort for at bestemme virkningen af ​​de forskellige behandlinger på tumorcelleproliferation. (A) Tumorstørrelse blev udtrykt som procent af oprindelige tumorstørrelse. (B) Vægten (g) af hver tumor blev målt ved afslutningen af ​​forsøget i mus efter aflivning. (C) Kropsvægt blev udtrykt som procent af oprindelig legemsvægt. (D) Procentdel af PCNA-positive celler i tumorer fra dyr behandlet med bærer, α-tomatine, curcumin eller kombinationen af ​​α-tomatine og curcumin. Repræsentative mikrografer af PCNA immunhistokemisk farvning i tumorer fra kontrolgruppen (E), α-tomatine-behandlede gruppe (F), den curcumin-behandlede gruppe (G) og kombinationen-behandlede gruppe (H) er vist. Sorte pile angiver positiv PCNA farvning og hvide pile angiver negative PCNA farvning.

Vægten af ​​hver tumor blev også målt i hver mus ved afslutningen af ​​forsøget efter aflivning. Tumorvægt af individuelle mus i hver behandlingsgruppe er vist i fig 6B. Middelværdien ± S.E. for tumorvægt (g) blev 0,69 ± 0,05 for kontrolgruppen, 0,52 ± 0,04 for α-tomatine-behandlede gruppe, 0,50 ± 0,04 for curcumin-behandlede gruppe, 0,33 ± 0,04 for kombinationen-behandlede gruppe. Statistisk analyse ved anvendelse af ANOVA med Tukey-Krama multiple sammenligningstest viste, at den gennemsnitlige tumorvægt i kombinationen var væsentligt lavere end i α-tomatine-behandlede gruppe (

s Restaurant 0,05), og at i curcumin-behandlede gruppe (

s

0,05). En god relation mellem tumorstørrelse (målt i levende dyr før aflivning) og tumor vægt (foranstaltning efter aflivning) i de enkelte mus blev opnået (

r

= 0,804). Virkningen af ​​de forskellige behandlinger på kropsvægt er vist i Fig 6C. Statistisk analyse ved hjælp ANOVA med Tukey-Krama multipel sammenligning viste, at forskellene i procent af oprindelige kropsvægt mellem kontrolgruppen og nogen af ​​behandlingsgruppen ikke var statistisk signifikant (

s

0,05).

virkninger af α-tomatine og curcumin om spredning af PC-3 tumorer

virkningerne af α-tomatine og curcumin på udbredelsen af ​​PC-3 tumorer blev undersøgt ved at bestemme ekspressionen af prolifererende cellekerneantigen (PCNA) i tumorceller. Paraffin sektioner af PC-3 tumorer blev farvet med PCNA antistof. Som vist i fig 6D, behandling af musene med α-tomatine eller curcumin alene faldt antallet af PCNA-positive celler i tumorerne. Kombineret behandling med α-tomatine og curcumin havde en mere potent virkning på at reducere antallet af PCNA-positive celler end hvert middel anvendt alene (Fig 6D). Forskellene i antallet af PCNA positive celler var statistisk signifikante mellem kombinationen-behandlede gruppe og α-tomatine-behandlede gruppe (

s

0,01), og mellem kombinationen-behandlede gruppe og curcumin- behandlede gruppe (

s

0,01). En god sammenhæng mellem PCNA positive celler og tumor vægt i de enkelte mus blev fundet (

r

= 0,72).

Diskussion

Selvom tidligere undersøgelser viste, at α-tomatine eller curcumin hæmmede prostatacancerceller [17, 26, 28, 33, 34], virkningerne og mekanismerne i disse to midler sammen på vækst og apoptose af prostata kræftceller

in vitro

in vivo

er ikke blevet rapporteret. I den foreliggende undersøgelse testede vi vores hypotese, at lave koncentrationer af curcumin og α-tomatine i kombination synergistisk inhiberer NF-KB-aktivering fører til kraftig vækstinhibering og apoptose induktion i prostatacancerceller. Vores undersøgelse viste, at α-tomatine og curcumin i kombination synergistisk hæmmede væksten og induceret apoptose i prostatacancer PC-3-celler, og disse virkninger var forbundet med synergi mellem de to forbindelser på faldende NF-KB-aktivitet. Tidligere undersøgelser har vist, at en højere koncentration af curcumin var forpligtet til at hæmme væksten af ​​prostatacancerceller (IC

50 ≈ 20 uM) [16, 35]. Imidlertid er biotilgængeligheden af ​​curcumin er lav [11]. En effektiv strategi er at kombinere en lav koncentration af curcumin med andre anticancermiddel. Kombinationer af lave doser af anticancermidler, der virker ved forskellige mekanismer kan være mere effektiv med mindre toksicitet end individuelle forbindelser ved højere dosisniveauer. I vores undersøgelse fandt vi, at en lav koncentration af curcumin (5 uM) i kombination med en lav koncentration af α-tomatine (1 uM) synergistisk hæmmede væksten af ​​dyrkede prostatacancerceller. Derudover denne kombination inhiberede kraftigt væksten af ​​PC-3 xenograft tumorer hos SCID-mus. Så vidt vi ved, er dette den første rapport indikerer en stærk kombinerede virkning af lave koncentrationer af α-tomatine og curcumin på prostatacancerceller.

transskriptionsfaktoren NF-KB er en vigtig regulator for cellevækst og overlevelse i en række forskellige celler, herunder prostatacancerceller [36-38]. NF-KB er blevet vist at være konstitutivt aktiveret i invasiv prostatacancer [39-41]. Aktivering af NF-KB er relateret til prostatacancer progression grund transkriptionel regulering af sine responsive gener [41]. Desuden NF-KB-aktivering forudsiger en høj risiko for tilbagefald hos patienter med lokaliseret sygdom [40, 42]. Derfor kan NF-KB tjene som et terapeutisk mål til behandling af prostatacancer.