PLoS ONE: NMe2 Reducerer spredning, migration og invasion af Gastric kræftceller til at begrænse Metastasis

Abstrakt

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og har en høj grad af metastaser. Vi hypotesen, at

NMe2

(nukleosid Diphosphate Kinase 2), som tidligere er blevet betragtet som en anti-metastatisk gen, spiller en rolle i invasivitet af gastriske cancerceller. Brug af et væv chip teknologi og immunhistokemi, vi demonstreret, at NMe2 ekspression blev forbundet med niveauer af differentiering af gastriske cancerceller og deres metastaser i lymfeknuderne. Når

NMe2

gen produkt blev overudtrykt af

in vitro

stabil transfektion, celler fra BGC823 og MKN45 gastrisk cancer cellelinjer havde nedsatte satser for spredning, migration og invasion gennem kollagen matrix, hvilket antyder en inhibitorisk aktivitet af NMe2 i formering og invasion af mavekræft. NMe2 kunne derfor alvorlig som en risiko markør for mavekræft invasiv og et potentielt nyt mål for genterapi til at forbedre eller inducere NMe2 udtryk

Henvisning:. Liu YF, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, Zhang L, et al. (2015) NMe2 Reducerer spredning, migration og invasion af Gastric Cancer Cells til Limit Metastase. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10,1371 /journal.pone.0115968

Academic Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, UNITED STATES

Modtaget: April 18, 2014 Accepteret: December 3, 2014; Publiceret: 20 feb 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af programmet understøtter for Chang-Jiang Lærde og Innovative Research Team i University (PCSIRT: IRT1137) og basisforskningsmidler for de centrale universiteter (lzujbky 2013-ct06). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller tilberedning af dette manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft forbliver som en førende dødsårsag, der tegner sig for 14,1 millioner nye tilfælde og 8,2 millioner dødsfald i 2012 [1]. Antallet af nye tilfælde forventes at stige 70% på verdensplan til 22 millioner inden for de næste to årtier [2]. Kræftformer i lunger, mave, lever, colon og bryster har den højeste dødelighed [3]. Gastriske cancerceller direkte kan spredes til tilgrænsende organer (lokal invasion), såsom pancreas, den tværgående colon, leveren og milten samt til fjerne lymfeknuder, lungerne og knoglevæv. Mens være to forskellige patologiske processer, er lokal invasion og fjern metastase sammenkoblet hvor førstnævnte ofte fremmer og udbreder den sidstnævnte. Genetiske mutationer og deres afvigende produkter er centrale kendetegnende og formidlere af kræftceller til spredning, modstandsdygtighed over for apoptose, lokal invasion, metastase, immun unddragelse, angiogenese og respons på DNA-skade.

NME

(nukleosid Diphosphate kinase 2 eller ikke-metastatiske celler) repræsenterer en gruppe af kræft-associerede og /eller cancer-regulerende gener.

NME

består af en familie af 10 gener, der også er kendt som den

nM23

gener [4], og er blevet forbundet med at undertrykke cancer metastaser og invasion til lokale væv [5]. Blandt medlemmerne af dette gen familie,

NME1

og

NMe2

er blevet grundigt undersøgt for deres kræft-undertrykke aktiviteter.

NMe2

, som er kortlagt på kromosom 17q21 [6,7], koder for B-underenheden af ​​nukleosidet diphosphat (NDP) kinase [4]. Dets produkt er blevet rapporteret at inhibere metastase af brystcancer og melanom-celler; og et fald i sit udtryk var korreleret med en større metastatisk potentiale af disse kræftformer [8,9]. Imidlertid

NMe2

overekspression var også forbundet med dårlig prognose for neuroblastom og osteosarkom [10,11]. Desuden blev

NMe2

gen ikke korreleret med metastase af endometrie hepatocellulært og thyreoideakarcinom [12-14]. Disse tilsyneladende modstridende data antyder, at NMe2 kan have forskellige virkninger på forskellige typer af kræftceller og deres evne til lokalt invadere omgivende væv eller metastaserer til fjerntliggende organer.

På grund af disse forskellige NMe2 aktiviteter på forskellige typer kræft, vi analyserede væv fjernes kirurgisk fra patienter med mavekræft og tilhørende den NMe2 udtryk i disse væv med deres patologiske karakteristika. Denne patologi undersøgelse blev suppleret af

in vitro

eksperimenter, hvor vi undersøgte satser proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller, der er blevet stabilt transficeret med et menneske

NMe2

cDNA at overudtrykke sit produkt . Disse

in vitro

eksperimenter er designet til at forstå invasiv af cancerceller, der udtrykker forskellige niveauer af NMe2.

Materialer og metoder

Denne undersøgelse blev godkendt af etik udvalg om udførelse menneskelige forskning af Lanzhou University, School of Medicine. Patienter eller deres værger, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke før rekrutteres til undersøgelsen.

Tissue immunhistokemi

Vi analyserede NMe2 udtryk i mavekræft og tilstødende normale væv kirurgisk fjernet fra 139 patienter indlagt på hæren Regional Hospital i byen Lanzhou fra 2011 til 2012. Ingen patienter fik kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Disse fjernes kirurgisk cancer væv blev forarbejdet til hematoxylin og eosin (HE) -farvning. Kort fortalt blev en voks modul udstansede 42 blænde huller (6 × 7 huller /chip) på 2 mm hver. Vævsblokke blev indlejret i disse huller (én prøve /hul). Denne voks modul blev derefter sektioneret, så væv fra 40 patienter kunne undersøges samtidigt på en enkelt dias for at sikre pletten ensartethed. Til kontrol blev første og sidste huller indlejret med væv fra ikke-kræft lever og nyre, hhv. NMe2 ekspression blev påvist under anvendelse af et kommercielt immunhistokemi kit (Beijing ZSGB Biotechnology Co., Ltd.) med et kanin-anti-humant NMe2 antistof (1: 300 fortynding, Beijing Biosyntese Biotechnology Co., Ltd.) ifølge producentens anvisninger. Niveauer af NMe2 udtryk blev numerisk scoret som vist i tabel 1 ved en patolog, der var blindet til den kliniske information af disse patienter.

Cell kultur og cDNA transfektion

Celler fra BGC823 og MKN45 gastrisk cancer cellelinjer blev købt fra Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Celler i BGC823 linje var oprindeligt fra en 62-årig mand med dårligt differentieret adenocarcinom i maven og dem i MKN45 linje afledt af en metastatisk masse af leveren fra en 62-årig japansk kvinde med en udifferentieret adenocarcinom maven. Celler fra begge linjer havde resterende niveauer af NMe2 udtryk og er derfor ideel til at studere effekten af ​​overekspression dette gen produkt på mavens kræftceller

in vitro

.

Cellerne blev dyrket i en DMEM-medium (Sigma, St. Louis, MO, USA), der indeholder 10% af føtalt kalveserum (Hangzhou Holly blade biologiske Engineering Materials Co, Ltd, Hangzhou, Kina) ved 37 ° C med 5% CO

2 og 95 % luft. Ved 70-80% konfluens, blev disse celler transficeret med et cDNA for det humane

NMe2

gen, der blev klonet i en pcDNA3.1-vektor (Shanghai GenePharma Co., Ltd. Shanghai, Kina) under anvendelse af Lipofectamine 2000 som DNA bærer (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Celler, der stabilt udtrykker NMe2 (betegnet NMe2) blev udvalgt ved at dyrke de transficerede celler i DMEM-medium indeholdende 1 mg /ml G418. Kontrol celler blev transficeret med pcDNA vektor uden

NMe2

cDNA indsats (betegnet som mock) og gennemgik den samme valg. Un-transficerede parentale celler blev også undersøgt som baseline kontroller. En overekspression af NMe2 blev bestemt ved RT-PCR for at kvantificere niveauet af

NMe2

mRNA og ved immunoblots af transficerede cellelysater under anvendelse af et polyklonalt NMe2 antistof (1:. 100 fortynding, Beijing Biosyntese Biotechnology Co., Ltd.)

RNA isolering og RT-PCR

Total RNA blev isoleret fra transfekterede og ikke-transficerede celler ved hjælp af et kommercielt RNA isolation kit (Takara bioteknologi, Dalian, Liaoning, Kina) i henhold til producentens anvisninger. RNA (2 ug) fra hver prøve blev revers-transskriberet under anvendelse af en PrimeScript RT Kit ifølge producentens protokol. Den komplementære DNA baglæns transkriberet fra RNA ekstraheret fra disse celler blev amplificeret ved en Taq-polymerase under anvendelse af følgende primere for

NMe2

cDNA: 5′-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 ‘(fremad) og 5’-GGTCTCCCCAAGCATCACTC-3 ‘(tilbage). Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev også amplificeret som kontrol under anvendelse af følgende primere: 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘(fremad) og 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’ (revers). Amplifikationsreaktionen blev initieret ved denaturering DNA ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af skabelon denaturering ved 94 ° C i 1 min, primerannealing ved 60 ° C i 1 min, og primerforlængelse ved 72 ° C i 1 min. Den NMe2 overekspression blev kvantitativt defineret som en stigning i

NMe2

mRNA ved to gange eller mere fra baseline fastsat af fingeret transficerede celler.

Immunofluorescens farvning af

NMe2

produkt

Celler stabilt transficeret med

NMe2

cDNA og et køretøj vektor blev udpladet på dækglas og får lov at vokse, indtil konfluens. De blev skyllet to gange med iskold phosphatbufret saltvand (PBS), fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 og inkuberet med 1% bovint serumalbumin (BSA) i 30 min for at blokere ikke-specifik binding. Cellerne blev derefter inkuberet med et kanin-antistof mod humant NMe2 (1: 100, Beijing Biosyntese Biotechnology) i 24 timer ved 4 ° C efterfulgt af inkubation med et FITC-konjugeret sekundært antistof (1: 100, Beijing Biosyntese Biotechnology) i 1 time . Alle antistoffer blev fortyndet i PBS indeholdende 1% BSA. Kerner blev modfarvet med DAPI (1: 100 i PBS, 10 minutter ved stuetemperatur).

Cellecyklusanalyse Salg

Celler, der stabilt udtrykker NMe2 og kontrolceller i kultur blev opsamlet og fikseret med 70% iskold ethanol ved 4 ° C i 24 timer, vasket to gange med iskold PBS og derefter behandlet med RNase A (20 ug /ml) i 30 min ved 37 ° C. De blev inkuberet med propidiumiodid (10 ug /ml slutkoncentration) i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur inden analyse ved flowcytometri til DNA ploidi.

Colony-formation assay

Transficerede og kontrolceller blev dyrket ved en initial densitet på 1.000 celler pr 100-mm dyrkningsskål i et komplet DMEM-medium i op til 4 uger. De blev derefter farvet med methyl violet. Alle cellekolonier, der var større end 2 mm i diameter (indeholdt ≥ 50 celler) blev talt i tre separate skåle og udtrykt som gennemsnit ± SEM. Med henblik på validering af data, vi tælles også levedygtige celler, som var blevet dyrket i op til 96 timer. Kort fortalt blev parentale BCG823 og MKN45 celler og celler, som var stabilt transficeret med enten en human

NMe2

cDNA eller vektoren køretøj (PC-DNA 3.1) udpladet med en tæthed på 2 x 10

4 celler /ml. De blev løsrevet 48-96 timer efter indledende podning med 1% trypsin og centrifugeret ved 1600 x g. Cellepellets blev resuspenderet i PBS og inkuberet med 0,04% af trypanblåt i 3 min. Overlevende celler blev talt på et hæmocytometer.

Analyser for celle migration

To komplementære analyser blev udført for at måle effekten af ​​overekspression NMe2 på hastigheden af ​​celle migration. Første var en sårhelende assay hvor cellerne blev udpladet i plader med 6 brønde og lodes vokse til ≥ 95% sammenflydende. Efter vask cellerne to gange med PBS, blev en steril pipettespids anvendes til at ridse cellemonolaget (4-5 parallelle ridser /plade). Celler blev vasket igen med PBS, fotograferet for at markere ridsede spor, og inkuberet med 2,5 ml serumfrit DMEM-medium. Ved en basislinie på cellemigration blev et ridset område delvist dækket af celler migreret ind i det skadede område 24-48 timer efter skaden, hvilket resulterer i en mindre celle-frit område. Fordi denne sårhelende assay er semikvantitativ blev resultaterne yderligere valideret af en Transwell cellemigrationsassay. Kort fortalt, 6 × 10

5 celler suspenderet i 500 pi serumfrit medium indeholdende 0,1% BSA blev udpladet i en Transwell (BD Biosciences), der blev anbragt i en plade med 24. Bundkammeret indeholdt 500 pi komplet DMEM-medium. Celler lodes vokse i øverste kammer i 24 timer for at lette cellemigrering fra topkammeret til bundkammeret. I slutningen af ​​denne inkubationsperiode blev membranen i det øverste kammer fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 minutter, vasket med Distill vand og lufttørret. Celler på den modsatte side af kammeret (transmigrated) blev farvet med 0,1% af methyl violet (Dade-Behring, Newark, DE) i 30 minutter, vasket, og betragtes under en up-højre mikroskop (x 400, NIKON). Cellemigrering defineret som antal celler på membranen i 5 tilfældige anmeldelse felter.

Assay for celle invasion

Transwell kamre blev belagt med rotte hale type I fibrillære kollagen [15] i 30 min ved 37 ° C. Overskydende væske blev fjernet, og overtrukne kamre blev lufttørret i 1 time i et sterilt miljø. Celler blev suspenderet i 500 pi serumfrit DMEM-medium indeholdende 0,1% BSA til en endelig densitet på 6 x 10

5 og udpladet på collagen matrix i et transwell der blev anbragt i en plade med 24. Bundkammeret indeholdt 500 pi komplet DMEM-medium. Celler forblev på membranoverfladen var forsigtigt fjernet 24 timer efter Celler blev podet og membranen blev fikseret og farvet for celler, der var transmigrated gennem collagenmatrix til den modsatte side af transwell membran.

Statistiske analyser

Alle data blev analyseret under anvendelse af SPSS 20.0 statistiske program. Kvantitative værdier blev udtrykt som middelværdi og SEM. De følgende statistiske analyser blev anvendt i undersøgelsen: Fishers eksakte test eller chi-square test for den indbyrdes forbindelse mellem NMe2 ekspression og patologiske karakteristika kræftvæv; envejs-ANOVA for gruppe sammenligning blandt parentale celler og celler transficeret med enten et køretøj vektor eller et menneske

NMe2

cDNA; og Pearson analyse for korrelation mellem NMe2 udtryk og differentiering og metastase af kræftceller.

Resultater

Foreningen af ​​NMe2 udtryk med histologiske karakteristika af mavekræft

Vi indsamlede kirurgisk prøve fra 139 patienter med gastrisk adenocarcinom. Tabel 2 viser de demografiske oplysninger af disse patienter og histologiske karakteristika for kræft væv fra disse patienter. NMe2 udtryk var svag eller ikke påvist i dårligt differentieret væv, men var intensivt i godt differentieret væv på et niveau, der kan sammenlignes med tilstødende normale væv (fig. 1). Et højt niveau af NMe2 ekspression blev associeret med en signifikant nedsat metastase til lymfeknuderne (

s

= 0,038), men ikke med størrelsen af ​​primær tumor og dybde af cancer invasion. En Pearson korrelationsanalyse viste, at NMe2 udtryk uafhængigt var forbundet med satserne for celledifferentiering (r = 0,436,

s

= 0,000) og bredte sig til de lokale lymfeknuder (r = -0,281,

p

= 0,001, tabel 1).

En immunhistokemisk påvisning af NMe2 ekspression i væv fra dårligt (A), moderat (C), godt (E) differentieret gastrisk cancer og tilstødende normalt væv (G). Intensiteten af ​​NMe2 ekspression i godt differentieret væv svarer til den for normalt væv. Panelet B, D, F, H er HE farvning af væv fra den samme prøve blokke (Bar = 100 um). Disse billeder er repræsentative for væv slides fra 139 patienter i dette studie.

Effekt af NMe2 om spredning af gastriske cancerceller i kultur

For yderligere at undersøge sammenslutning af NMe2 udtryk med patologiske karakteristika af gastriske kræftceller, vi studerede celler fra BGC823 og MKN45 mavekræft linjer, som udtrykte NMe2 svagt på et niveau i forhold til dårligt differentieret kræftvæv (fig. 1). Disse celler blev transficeret med en human

NMe2

cDNA til overudtrykke NMe2 som kvantitativt målt ved en stigning i

NMe2

mRNA (kvantitativ RT-PCR) og NMe2 proteinprodukt (immunofluorescens, fig. 2 )

A B: RT-PCR profiler af

NMe2

mRNA i mock og

NMe2

transficerede BGC823 og MKN45 gastrisk kræftceller (forældrenes BGC823 og MKN45 celler som basislinjer [BL]). Niveauer af

NMe2

mRNA fra 3 separate sæt af transfektioner blev kvantificeret ved densitometri (ANOVA, n = 3, *

s

0,05, sammenlignet med baseline). Immunofluorescens farvning af NMe2 i utransficerede (C F), mock (D H) transficeret BGC823 og MKN45 celler (Bar = 200 um). Et flertal af NMe2-transficerede celler farves positive for kinasen, som er intensivt farvet som dispersive og /eller kornet grøn fluorescens primært i cytoplasmaet, men også påviselige i kernen. Mønstrene og niveauer af NMe2 udtryk afvige lidt i at NMe2 i BGC823 celler mere jævnt fordelt i cytoplasmaet med mere intensiv kerne farvning (E indsæt), hvorimod NMe2 i MKN45 celler var mere detaljeret i distributionen, med relativt mindre kerne farvning (H indsætte, n:. kerne)

Vi derefter undersøgt, hvordan overudtrykker NMe2 reguleret cellevækst ved måling af DNA-ploidi og kolonidannelse af disse celler. Vi har registreret nogen forskel i DNA ploidi mellem celler, der overudtrykker NMe2 og de ikke-transficerede og mock-transficerede celler fra begge linjer (tabel 3 og S1 Fig.), Hvilket antyder, at en stigning i NMe2 ekspression havde ingen effekt på cellecyklus. Imidlertid NMe2-overudtrykker celler havde en signifikant reduceret evne til at danne kolonier i kulturen sammenlignet med sham transficerede og ikke-transficerede celler (fig. 3). Denne observation blev bekræftet af resultaterne fra en celle-tælling metode (fig. 3C)

MKN45 (A) og BGC823 (B) celler transficeret med en human

NMe2

cDNA eller et køretøj vektor ( mock), og utransficerede celler (BL) blev dyrket i 14 dage og derefter kvantitativt analyseret for antal dannede kolonier (ANOVA, n = 3, *

s Restaurant 0,05 sammenlignet med parentale celler [bl]). (C) antallet af levedygtige BCG823 celler i kultur af disse tre typer celler i op til 96 timer (ANOVA, n = 3 /celletype på hvert tidspunkt, *

s Restaurant 0,05 sammenlignet med parentale celler ).

Effekt af NMe2 på celle migration og invasion

Vi næste evaluerede evne NMe2-overekspression celler til at migrere, fordi en retningsbestemt migration er en vigtig forudsætning for invasion af cancerceller til omgivende væv. Denne retningsbestemte migration blev undersøgt ved hjælp af en sårhelende assay, som måler hastigheden af ​​migration celler ind i området for skader skabt af en skarp genstand. Som vist i fig. 4A og 4B, bredden af ​​en skadet område efter 48 timer i kulturer var større for

NMe2

transficerede celler end for ikke-transficeret og mocktransfekterede celler. Den langsomme migrering blev fundet i celler fra begge cellelinier, hvilket antyder, at celler, der overudtrykker NMe2 migrerede meget langsommere. Fordi denne sårhelende assay er semi-kvantitativ, vi også kvantitativt at måle hastigheden af ​​cellemigrering ved anvendelse af et Transwell assay. Overensstemmelse med den sårhelende assay NMe2 overudtrykker celler migrerede ved -50% af ikke-transficerede eller fingeret transficerede celler (fig. 4).

Parental BGC823 (A) og MKN45 (B) celler og celler der var stabilt transficeret med enten et køretøj vektor (mock) eller et menneske

NMe2

cDNA migrere mod scratch områder (defineret ved prik linjer) 48hrs efter skade (paneler er repræsentative billeder fra 3 separate sæt af eksperimenter). C D, Migrationen af ​​disse celler blev også kvantitativt målt i en transwell assay (ANOVA, n = 3 /gruppe, *

s

0,05 sammenlignet med forældrenes celler [BL]).

Et fald i cellemigrering kunne potentielt reducere evnen af ​​disse celler til at invadere omgivende væv. For at undersøge denne mulighed, måler vi invasionen af ​​kræftceller til collagen matrix i en veletableret transwell kammer assay. BGC823 celler, overeksprimeres NMe2 væsentligt reduceret deres evne til at invadere en collagenmatrix til 60% af ikke-transficerede og mock-transficerede celler (fig. 5). Hastigheden for invasion blev ligeledes reduceret i MKN45 celler transficeret med

NMe2

cDNA sammenlignet med parentale celler og dem transfekteret med et køretøj vektor (fig. 5).

Parental, mock- og

NMe2

cDNA transficerede BCG823 (a) og MKN45 (B) celler blev målt ved lokal invasion gennem collagen matrix i et Transwell assay. Paneler A (BCM823) og C (MKN45) er snap billeder af celler, der invaderede gennem collagen-matrix til bagsiden af ​​membranen i Transwell kamre. Paneler B (BGC823) og D (MKN45) er kvantitative resuméer af flere eksperimenter (ANOVA, n = 3, *

s

0,05 sammenlignet med forældrenes celler [BL])

diskussion

Vi har undersøgt forholdet mellem NMe2 ekspression og karakteristika gastrisk cancer i væv fjernet kirurgisk fra patienter og i dyrkede celler fra to kendte mavekræft linjer. Undersøgelsen er nødvendig, fordi

NMe2

blev oprindeligt identificeret som den første metastase suppressor gen, men dens evne til at blokere kræft lokal invasion og remote metastase synes at være celletypespecifik blandt cancere, der hidtil er blevet undersøgt [8- 14]. For eksempel, en analyse af 35 patienter med skjoldbruskkirtlen papillær carcinom og 11 i metastatiske lymfeknuder viste en signifikant reduceret niveau af

NME1

mRNA i metastatiske lymfeknuder, hvorimod

NMe2

mRNA blev ikke ændret i den oprindelige tumor og lymfeknuder [14], hvilket tyder på differentierede roller NME1 og NMe2 i kræft invasion og metastase. En meta-analyse af 278 patienter med tyktarmskræft, 177 med brystkræft, 137 med kræft i æggestokkene og 77 med lungekræft fandt også en reduceret niveau af NMe2 udtryk i metastatisk cancer sammenlignet med ikke-metastatisk cancer [17]. Til trods for en negativ sammenhæng mellem NME1 /NMe2 ekspression og cancer invasion til den lokale lymfeknuder og endometrisk infiltration, NME ekspression var ikke forbundet med TNM scoringer og differentieringen af ​​intrauterin membran carcinom og livmoderhalskræft [16]. Her giver vi flere linjer af beviser for, at NMe2 begrænser spredning, migration og invasion til den ekstracellulære matrix af gastriske kræftceller.

Først et højere niveau af NMe2 udtryk findes i godt differentieret og mindre invasiv væv fra mavecancer kirurgisk fjernet før kemoterapi og strålebehandling i en stor patient kohorte (tabel 1 . figur 1). Den metastaser af kræft til lokale lymfeknuder blev oftere fundet i cancer væv, der havde et lavt niveau af NMe2 udtryk og denne korrelation mellem NMe2 udtryk og differentiering /metastaser i disse patientgrupper væv består, efter at data blev stratificeret for alder, køn, størrelse primær tumor og dybden af ​​invasion (tabel 1 og 2. gennemløb). Disse resultater er i overensstemmelse med en nylig rapport, at NMe2 binder telomer repeat bindende faktor 2 i kernen for at reducere telomerase-aktivitet [37], hvilket tyder på en mekanistisk forbindelse mellem NMe2 udtryk og overlevelse af kræftceller.

For det andet, vi undersøgte effekten af ​​overekspression NMe2 om satserne for spredning, migration og invasion til den ekstracellulære matrix

in vitro

af celler fra de to velundersøgte mavekræft cellelinjer BGC823 og MKN45 [18-21]. Transfektionen med et menneskeligt

NMe2

cDNA resulterede i en to-fold eller større grad af NMe2 ekspression i disse celler sammenlignet med mock-transficerede celler (fig. 2). Denne NMe2 overekspression ændrede ikke DNA ploidi (tabel 3), men væsentligt bremset kolonidannelse af disse celler (fig. 3), hvilket antyder, at overekspression NMe2 forsinker en overgang fra DNA-replikation til mitose. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at NMe2 ikke påvirker væksten af ​​dyrkede kræftceller og er ikke forbundet med størrelsen af ​​primær kræft implanteret i dyr [22-27]. Men det er uforeneligt med rapporter om, at NMe2 fremmer [28,29] eller reducerer [30] spredning af andre typer af kræftceller. Præcise årsager til uoverensstemmelsen stadig undersøges nærmere, men antyder disse data celle typespecifikke virkninger af

NMe2

gen på patogenesen af ​​kræft.

For det tredje, i modsætning til en minimal virkning på proliferationen af ​​gastriske cancerceller, overekspression af NMe2 resultater en signifikant reduktion i celle migration og invasion gennem collagen matrix som demonstreret i tre forskellige, men komplementære assays (fig 4 . 5). Vores data understøtter tidligere konstateringer af lignende inhibitoriske virkninger på brystcancer [8], oral pladecellekræft [28] og melanomceller [9], selv om undtagelser igen blev bemærket i hepatocellulært [13,29] og colorektale carcinomer celler [31]. Det er endnu ikke bestemt som om nedsat migration og invasion af NMe2-overekspression celler skyldes en nedsat evne af disse celler til proliferation.

Vores resultater identificeret gastrisk kræftceller så følsom over for overudtrykt NMe2, men en kritiske spørgsmål forbliver som hvad regulerer disse forskellige NMe2 aktiviteter blandt forskellige typer af kræftceller. En potentiel mekanisme er, at en NMe2 aktivitet afhænger af up- og downstream molekyler der interagerer med NMe2 i en given celletype. Flere molekyler er tidligere blevet identificeret til at interagere eller regulere NMe2, såsom EGFR,

c-erbB-2

,

c-erbB-3

og køn steroid receptor i ovariecarcinomer [32]. Plakoglobin blev rapporteret til at interagere med NMe2 at fremme dets ekspression i celler fra human tunge pladecellekræft [33]. NMe2 viste sig også at interagere med MDM2 (Mouse dobbelt minut 2-homolog) for at reducere motilitet renale carcinomaceller [34]. MDM2 er en E3 ubiquitin-protein-ligase og tjener som en negativ regulator af p53 tumor suppressor. Forholdet mellem

NMe2

gen og gener af

myc

familie ser ud til at være mere kompliceret. Produkter fra

NME1

NMe2

gener er blevet foreslået at være den nedstrøms for c-

myc

regulatoriske vej [7], og er involveret i nedregulering af cdc42 funktion i neuroblastom [35]. NMe2 er også rapporteret at interagere med G-quadruplex DNA i nuklease overfølsomme element i

c-myc

promotor til at inducere c-myc-ekspression [36]. Et system biologi tilgang til at undersøge disse specifikke veje i stedet for enkelte molekyler kan være nødvendigt at dissekere roller

NMe2

gen og dets produkt i forskellige typer af kræft.

Sammenfattende vi har vist at en overekspression af NMe2 reducerer migration og invasion af gastrisk kræftceller til den cellulære matrix

in vitro

. Som følge heraf er NMe2 ekspression forbundet med godt differentieret og mindre invasitve histologi af gastrisk cancer. Disse resultater tyder på, at

NMe2

gen og dets produkt kan tjene som en potentiel markør til at forudsige invasiv af mavekræft og også som et terapeutisk target, der kan opreguleret gennem genterapi.

Støtte oplysninger

S1 fig. Virkning af NMe2 overekspression på gastrisk cancerceller cellecyklus.

DNA ploidi celler transficeret med

NMe2

cDNA blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et kommercielt kit ifølge producentens instruktioner. Panelerne A-C var for forældrenes BCG823 celler og dem transficeret med

NMe2

cDNA eller vektor. Panelerne D-F var for MKN45 celler med de samme behandlinger

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115968.s001

(DOC)