PLoS ONE: CLPTM1L er overudtrykt i lungekræft og associeret med Apoptosis

Abstrakt

CLPTM1L menes at være forbundet med lungekræft. Men der er lidt information om dets ekspression og funktion. Her ved hjælp af immunhistokemi, fandt vi, at CLPTM1L ekspression blev markant forøget i lungekræft væv i forhold til normale væv, især i lunge adenocarcinom. CLPTM1L ekspression blev ikke fundet at være forbundet med faser, rygerstatus, lymfeknudemetastase eller T-lymfocyt-infiltration men med differentiering fase. Vi fandt CLPTM1L at være beriget i den mitokondriske sammenlignet med plasma membran proteinekstrakter. CLPTM1L-EGFP transfektion viste, at molekylet produkt blev udtrykt i cytoplasmaet og indikerede mitokondrie lokalisering farves med mitokondrie markør MitoTracker. CLPTM1L overført lungecancer-cellelinje 95-D viste ingen vækstinhibering eller celle apoptose, men det gjorde show hæmmede følsomhed over for cis-diammindichlorplatin (II) (cisplatin, CDDP). Knockdown af CLPTM1L af RNAi ikke forstyrre celledeling, men det gjorde stigning celle følsomhed over for CDDP og aktivering af caspase-9 og caspase-3/7. Disse data indikerer CLPTM1L er en mitokondrier protein, og at det kan være forbundet med anti-apoptotisk mekanisme, som påvirker lægemiddel-resistens igen

Henvisning:. Ni Z, Tao K, Chen G, Chen Q, Tang, J., Luo X, et al. (2012) CLPTM1L er overudtrykt i lungekræft og associeret med apoptose. PLoS ONE 7 (12): e52598. doi: 10,1371 /journal.pone.0052598

Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Tyskland

Modtaget: September 5, 2012; Accepteret: November 16, 2012; Udgivet: 26 december, 2012 |

Copyright: © 2012 Ni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Videnskab og Teknologi Udvalg Shanghai (No.09JC1412900, No.10411969100), Educational Udvalg Shanghai (No.10YZ54), den Putuo District Videnskab og Teknologi Udvalg Shanghai (2010), og Innovation Program for Shanghai Municipal Education kommission (13ZZ096). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Palate transmembrane 1-lignende (CLPTM1L), også kaldet

c

isplatin

r

esistance

r

opstemt gen 9 (CRR9), blev identificeret blandt de gener involveret i resistens over for anticancer lægemiddel cisplatin i ovariecancerceller [1]. CLPTM1L er placeret ved 5p15.33 locus nær telomerase-revers transkriptase [TERT]. Nylige genetiske undersøgelser afslørede, at dette locus er en modtagelighed region for lunge og flere andre kræftformer [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Det forekommer sandsynligt naturligt, at genetiske varianter ville forårsage unormal ekspression på proteinniveauet og at dette kan påvirke genfunktion i lungekræft. Flere undersøgelser har vist CLPTM1L at være stærkt udtrykt i renal carcinom cellelinje og larynx pladecellekræft [17], [18].

Det faktum, at CLPTM1L er så højt konserveret angiver, at det er nok vigtigt for nogle grundlæggende fungere. Men lidt om hvad CLPTM1L og dets produkt eller produkter, der faktisk gør. Molekylet har imidlertid vist sig at være et lægemiddel-resistens faktor [1]. Ekspressionen af ​​CLPTM1L viste sig at være opreguleret i alle cisplatin-resistente celle undersøgte linjer. Overekspressionen af ​​CLPTM1L i en cisplatin-sensitive cellelinie blev fundet at forårsage apoptose og CLPTM1L overekspression blev fundet at have nogen virkning på cisplatin-resistente celler.

Primært lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i de fleste industrialiserede lande [19]. Den kraftfulde genetiske sammenhæng mellem CLPTM1L og lungekræft inspireret os til at tage fat på udtryk og funktion af dette gen i detaljer. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi omfanget af CLPTM1L immunhistokemisk ekspression i lungekræft tumorprøver, og vi analysere forholdet mellem deres ekspression og klinisk-patologiske variabler. Vi udfører også en retssag for at bestemme den mulige funktion af dette gen.

Materialer og metoder

Patientens Kendetegn

Primære tumor prøver blev opnået kirurgisk fra 151 lungekræftpatienter (110 mænd, alder 39-81, median alder på diagnosetidspunktet 67 år, 41 kvinder, alder 36-85, median alder på diagnosetidspunktet 64 år), der ikke havde gennemgået nogen præoperativ behandling. Kirurgi blev udført på Shanghai Changning Central Hospital, Shanghai, Kina, mellem 2003 og 2010. Disse tumorer omfattede 55 tilfælde af adenocarcinom, 63 tilfælde af pladecellekræft, 13 tilfælde af skællede-adenocarcinom, 5 tilfælde af småcellet lungekræft og 15 tilfælde af store celle lungekræft. Patienterne blev iscenesat i henhold til de kirurgiske og patologiske fund baseret på de retningslinjer, der er beskrevet i

American fælles udvalg om kræft Iscenesættelse Manuel

[20]. Tyve-to patienter blev bestemt til at være i fase Ia, 51 i fase Ib, 6 i fase IIa, 16 i fase IIb og 56 i fase IIIa. Af alle disse patienter, registreringer af kirurgi, de i-patient journaler, bryst x-ray film, hele kroppen computertomografi (CT) film og knogle scanning film blev revideret. Parrede normale væv blev udtaget til at matche prøver. Undersøgelsen blev godkendt af etik udvalg af Putuo Hospital, Shanghai University of traditionel kinesisk medicin, og alle patienter skal skriftligt informeret samtykke.

Cell Line og vedligeholdelse

Menneskelig lunge cancer cellelinjer 95-D blev købt fra Institut for Cellebiologi (Shanghai, Kina) og opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS.

CLPTM1L Expression Analyse ved hjælp af real-time kvantitativ PCR

Total RNA blev isoleret fra dyrkede celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Shanghai, Kina), i henhold til manufactuery protokol. Første streng cDNA blev fremstillet under anvendelse tilfældig hexamer primer i henhold til instruktionerne, der følger med den SuperScriptIII ™ første streng syntese (Invitrogen). Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse af en Universal Master Mixer (Roche Applied Science, Shanghai, Kina) på en 7300 Real-time PCR System (Applied Biosystems, Shanghai, Kina). Primerne og proberne anvendt, var som følger: fremadrettet, 5′-TGCATTACCTGCCCATCCT -3 ‘; Reverse, 5’CGCCCCAGTGAGACCTTG -3 « Probe, 5’-fami- TCATCGACCAGCTCAGCAACCGC -TAMRA-3 ‘. GAPDH tjente som kontrol, F: 5’CCACTCCTCCACCTTTGAC -3 ‘, R: 5’ACCCTGTTGCTGTAGCCA -3′, Probe: 5’-fami- TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC -TAMRA-3 ‘. Hvert assay blev udført tre gange. PCR-betingelserne, der anvendes i alle reaktioner var som følger: 10 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 40 totrins-cykler (95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min). De relative ekspressionsniveauer af CLPTM1L genet blev normaliseret mod GAPDH og analyseret af 2

-ΔΔCt metode [ΔΔCt = (Ct

CLPTM1L – Ct

GAPDH) prøve – (Ct

CLPTM1L – Ct

GAPDH) kontrol].

Kloning og sekventering af humane CLPTM1L

Totalt RNA blev isoleret fra 95-D-celler ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) og anvendt som en skabelon for første streng cDNA-syntese ved anvendelse af en RT-PCR SuperScriptIII ™ første-streng syntese kit (Invitrogen). Den CLPTM1L åbne ramme (1617 bp, Genbank NM_030782) blev amplificeret ved PCR fra cDNA genereret ved revers transkription af mRNA. Primerne anvendt til at amplificere CLPTM1L genet var som følger: F: 5′- GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3 ‘; R: 5’AGACGTCGACGTCCGTGTGGGGCGCC -3 “. Det amplificerede produkt blev oprenset og klonet i en pMD18-T Simple Vector (Takara, Shanghai, Kina). Sammensætningen af ​​plasmidet blev bekræftet ved sekventering.

Plasmidkonstruktion og gentransfektion

CLPTM1L CDS region blev ekstraheret fra pMD18-T- CLPTM1L plasmider ved restriktionsfordøjelse og klonet i en pEGFP-N3 vektor. Det konstruerede plasmid blev opkaldt pEGFP-N3-CLPTM1L og det blev brugt bestemme den cellulære lokalisering af CLPTM1L. Primere (F: 5′- GGAAGATCTACCATGTGGAGCGGCCGCAG -3’and R: 5′-CCGCTCGAGTCAGTCCGTGTGGGGCGCC-3 ‘) blev anvendt til at amplificere CLPTM1L CDS region for konstruktion af pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L vektor. Det amplificerede produkt blev oprenset og spaltet under anvendelse af BglII og Xhol Den blev derefter klonet i pcDNA3.1 (+) vektor spaltet med BamHI og Xhol Det konstruerede plasmid blev benævnt pcDNA3.1 (+) -CLPTM1L og anvendes til CLPTM1L overekspression. 3 × 10

5 95-D-celler blev derefter kortvarigt transficeret med enten pEGFP-N3-CLPTM1L eller pEGFP-N3 ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Shanghai, Kina) i 24 timer. Celler blev derefter høstet for celledeling eller cisplatin følsomhedsanalyse.

Fluorescens mikroskopi

For at bestemme den subcellulære lokalisering af CLPTM1L-EGFP, cellerne blev først kortvarigt transficeret med pEGFP-N3-CLPTM1L hjælp Lipofectamine 2000. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne inkuberet med MitoTracker farvestof (Invitrogen) i 30 minutter under vækstbetingelser. Efter inkubation blev cellerne observeret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop.

Immunhistokemi

resektion vævsprøver blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin, skåret i 4 um serielle snit, og derefter monteret på objektglas. Antigen genfinding blev udført under anvendelse citratpuffer (0,01 mmol /l, pH 6. 0) .Efter hentning af antigenet blev objektglassene vasket tre gange med PBS og inkuberet i 10% normalt gedeserum til at blokere ikke-specifik baggrundsfarvning. Snit blev derefter natten over inkuberet med kanin-anti-humane CLPTM1L antistoffer (Sigma, Shanghai, Kina) ved 4 ° C. Snittene blev vasket tre gange med PBS og inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -anti-kanin IgG (Maixin Bio, Fuzhou, Kina) i 30 min. De blev derefter vasket tre gange med PBS. Snittene blev visualiseret under anvendelse diaminobenzidin opløsning (DAB). Slides blev evalueret samtidig af to patologer ved hjælp af en dobbelt-ledes lysmikroskop. De patologer blev ikke informeret om hver patients kliniske rekord. CLPTM1L ekspression var semi-kvantitativt scoret baseret på intensiteten af ​​farvning og relative antal celler farvet. Ufarvede væv blev scoret som 0, svag farvning, moderat eller stærk farvning i 25% af celler blev scoret som 1, var moderat farvning eller stærk farvning i 25-50% af cellerne scoret som 2 og stærk farvning i 50% celler blev scoret som 3. Celletællinger blev udført ved × 400 i mindst fem felter i tilfældigt udvalgte ondartede områder.

for at undersøge forholdet mellem CLPTM1L og niveauet af tIL infiltration, valgte vi marken med den største mængde CLPTM1L udtryk, og tælles antallet af CD45

+ celler per 1000 samlede kerner.

immuncytokemi

Angivelse af CLPTM1L protein blev bestemt ved hjælp af immunocytokemi. Dagen før analysen, blev i alt 1 x 10

5 celler udsået i Millicell EZ Slide (Millipore, Shanghai, Kina). Efter 24 timers inkubation blev cellerne fikseret på objektglas under anvendelse af 4% paraformaldehyd. Cellerne blev permeabiliseret 3 gange i 5 minutter med 0,1% Triton X-100 i PBS og blokeret med blokerende buffer (10% normalt gedeserum, 0,1% Triton X-100) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter blokering blev cellerne vasket med PBS og inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-humane CLPTM1L antistoffer (Sigma, Shanghai, Kina). Den følgende dag blev cellerne vasket 3 gange med PBS og inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -anti-kanin-IgG i 30 minutter. De blev derefter vasket tre gange med PBS. Sektionerne blev visualiseret ved hjælp diaminobenzidin løsning.

mitokondrie Rensning og vestlige Bolt Analyse

Først 2 × 10

7 95-D-celler blev høstet og mitokondrie og cytosolisk fraktioner blev isoleret ved hjælp af en mitokondrie Fraktionering Kit (Activemotif, Shanghai, Kina). De mitochondriske og cytosoliske fraktioner blev separeret på en 10% SDS-PAGE og derefter overført til en PVDF-membran. PVDF-membranen blev blokeret med 5% BSA og vasket to gange med TBST. Membranen blev derefter inkuberet med CLPTM1L antistoffer (Abgent, Shanghai, Kina) natten over ved 4 ° C, og vasket tre gange med TBST efterfulgt af inkubation med anti-kanin IgG peberrodsperoxidase sekundært antistof (Cellsignal, Shanghai, Kina) i 2 timer ved stuetemperatur. Endelig blev påvist immunreaktive bånd under anvendelse af et ECL-reagens (Millipore).

Konstruktion af CLPTM1L RNAi lentivirus

siRNA sekvenser mod det humane CLPTM1L gen (GenBank Accessionsnummer NM_030782) blev designet og syntetiseret ved Genechem (Genechem, Shanghai, Kina). Blandt fire kandidatlande siRNA’er ekspressionskassetter, fandt vi sense siRNA sekvens (5-CAGTTTCTGGAAGAAGAAGAA-3) for at have den bedste forstyrrende effekt i vores 95-D-inficeret celle system. SiRNA blev indsat i pGCSIL-GFP lentiviral vektor. En kontrol siRNA (5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3) blev anvendt som en negativ kontrol. Lentivira kodet med siRNA mod CLPTM1L og kontrollen blev fremstillet ved cotransfektion af 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med standardprotokoller. 5 × 10

4 95-D-celler blev inficeret med enten CLPTM1L siRNA lentivirus eller negativ kontrol siRNA vektor ved en MOI på ca. 100 i 72 timer. Celler blev derefter skiftet til komplet medium. Efter 72 timers dyrkning blev cellerne høstet til celleproliferation, cisplatin følsomhed eller caspase-3/7 og caspase-9-analyse.

Cisplatin Følsomhedsanalyse og celleproliferation Analyse

Først 1 × 10

4 celler pr brønd blev podet i en 96-brønds plade. Efter 24 timers inkubering, 25 pM, 50 pM og 75 pM cisplatin (Sigma) blev tilsat og inkuberet i 24 timer. Efter 24 timer blev levende cellepopulation analyseres under anvendelse Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) ifølge producentens instruktioner. Celleproliferation blev vurderet på forskellige tidspunkter ved hjælp af WST-1.

Analyse af caspase-3/7 og Caspase-9 Analyse

De 95-D-celler inficeret med CLPTM1L lentivirus og styre lentivirus blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS. Kort fortalt, 1 x 10

4-celler blev podet i en 96-brønds plade og inkuberet natten over. Efter 24 timer blev 95-D-celler behandlet med 50 pM cisplatin (Sigma) i 24 timer. Efter 24 timer blev 100 pi caspase-Glo 3/7 eller Caspase-Glo 9 reagens (Promega, Shanghai, Kina) tilsat til hver brønd og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer. Efter inkubation blev luminans målt under anvendelse TD 20/20 luminometer (Promega). Hver prøve blev målt i tre eksemplarer.

Statistisk analyse

De associationer mellem ekspression af CLPTM1L og klinisk-patologiske variabler blev analyseret ved hjælp af Fishers eksakte test, chi-square test eller kontinuitet korrektion chi-square test af SPSS16.0 software, og forholdet mellem antallet af tIL og CLPTM1L blev evalueret ved anvendelse af Mann-Whitney test med Instat3.36. Sammenhængen mellem de forskellige markører, var simpel lineær regression udføres ved hjælp Statview SE + Graph.

Resultater

1. Ekspression af CLPTM1L i Human Lung Cancer

ekspressionsmønsteret for de CLPTM1L molekyler på overfladerne af tumorceller optrådte meget diffust i de fleste tilfælde. Mikroskopisk den CLPTM1L molekylet blev fundet i cytoplasmaet (fig. 1). I disse prøver blev infiltrerende mastceller fundet at udtrykke CLPTM1L stærkt, men lymfocytter var ikke. Ud af de 151 patienter, som er fastsat prøver, 136 (86,8%) viste CLPTM1L ekspression og CLPTM1L blev overudtrykt i tumorvæv sammenlignet med tilstødende væv, hvilket var statistisk signifikant forskellige (p = 0,000, tabel 1). Fordelingen af ​​intensiteten af ​​farvning i alle prøver er vist i tabel 1. Et forhold mellem intensiteten af ​​farvning og patologisk klassifikation blev bemærket. Procentdelen af ​​stærk farvning (++ ~ +++) af CLPTM1L ekspression i adenocarcinom var højere end i pladecellekræft (p = 0,000, tabel 1). På grund af den begrænsede omfang af den aktuelle undersøgelse kunne de positive forhold mellem stor-celle karcinom og småcellet lungecancer ikke bestemmes endeligt. Det relative antal mørkt farvede celler var meget højere i adenocarcinom prøver end i kontrollerne. De fleste tilstødende væv udviste enten svag farvning eller slet ingen

(A) Normal lungevæv (× 200).; (B) Afsnit fra lunge adenocarcinom (× 200); (C) Afsnit fra lunge pladecellekræft (× 200); (D) Afsnit fra lunge adenocarcinom (× 400).

2. Forholdet mellem Clinicopathologic Karakteristika og CLPTM1L Expression i lungekræftpatienter

Vi fandt CLPTM1L udtryk var forbundet med de kvaliteter af differentiering (p = 0,046, tabel 2), blev observeret dog ikke signifikant sammenhæng mellem CLPTM1L ekspressionsniveauerne og patientens alder , køn, rygning status eller TMN stadium i 151 lunge prøver (tabel 2). Ingen association blev fundet mellem ekspression af CLPTM1L og lymfocyt infiltration, hvilket indikerede, at ekspressionen af ​​CLPTM1L ikke var relateret til immunsuppression (Data ikke kendt).

3. Mitokondrie Lokalisering af CLPTM1L

Den nøjagtige cellulære lokalisering af CLPTM1L med hensyn til sine roller i lungekræft progression er endnu uklart. Undersøgelse af sekvensen af ​​CLPTM1L hjælp MITOPROT (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot.html) indikerede en 84% sandsynlighed for, at CLPTM1L blev eksporteret til mitokondrierne. For at bestemme placeringen af ​​CLPTM1L proteinet, blev mitokondrie og cytosoliske fraktion af 95-D-celler ekstraheret til Western blot-analyse. Som vist i fig. 2A, CLPTM1L protein blev hovedsagelig fundet i den mitokondriske fraktion af cellerne. For at bekræfte dette, konstruerede vi en CLPTM1L ekspressionsvektor ved at fusionere EGFP ved C-terminalen af ​​CLPTM1L (CLPTM1L-EGFP). Så 95-D-celler blev transient transficeret med CLPTM1L-EGFP-vektor og farvet med det mitokondrielle markør MitoTracker. De fluorescerende billeder klart angivet mitokondrie lokalisering af CLPTM1L protein (figur 2B.)

(A):. Western blot-analyse for CLPTM1L ekspression i hel-celleekstrakt, cytosol og mitokondrie del af 95-D-celler. (B): 95-D-celler blev kortvarigt transficeret med CLPTM1L-EGFP vektor og farves med mitokondrie markør MitoTracker

4.. Effekt af CLPTM1L Overekspression i Inficerede 95-D-celler

For at bestemme de funktionelle konsekvenser af forhøjet CLPTM1L udtryk i lungekræft, blev CLPTM1L overudtrykt i 95-D-celler. Overekspression blev bekræftet ved hjælp af real-time PCR og immuncytokemi (fig. 3A og 3B). Vi kunne ikke finde væksten hæmmes efter 72 timers overekspression, som bestemt ved spredning analyse. Celler, der overudtrykker CLPTM1L tendens til at være mindre tilbøjelige til at dø, når inkuberet med 25-75 pM cisplatin, selv om denne forskel ikke fandtes at være statistisk signifikant (fig. 3C og 3D).

(A) CLPTM1L mRNA-niveau blev målt ved anvendelse kvantitativ realtids-PCR i pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L eller pcDNA3.1 (+) plasmid transficerede celler. *:

P

0,05 vs kontrolgruppen (p = 0,001). (B) Ekspression af CLPTM1L protein blev undersøgt ved anvendelse af immunocytokemi. (C) Virkninger af CLPTM1L overekspression på celleproliferation i pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L transfekterede celler 95-D-celler i forhold til at kontrollere 95-D-celler. (D) Overekspression af CLPTM1L ændrede ikke kemosensitivitet til cisplatin i humane lungecancer 95-D-celler transficeret med pcDNA3.1 (+) – CLPTM1L forhold til kontroller. Cellerne blev behandlet med de angivne koncentrationer af cisplatin i 24 timer.

5. Effekter af CLPTM1L i Knocked Down 95-D celler inficeret af CLPTM1L shRNA lentivirus

Vi brugte en lentiviral vektor, der indeholder shRNA til specifikt at målrette og stabilt banke ned udtryk for CLPTM1L i lungekræft 95-D-celler. Real-time PCR-analyse viste, at CLPTM1L mRNA-ekspression i shRNA-CLPTM1L-transficerede celler var markant lavere end det for kontrol 95-D-celler (fig. 4A). Nedsat ekspression af CLPTM1L protein blev også bekræftet ved immuncytokemi (fig. 4B).

(A) CLPTM1L mRNA niveau efter RNAi behandling blev målt ved anvendelse kvantitativ realtids-PCR i forskellige grupper. *: P = 0,000 vs NC kontrolgruppe. (B) Ekspressionen af ​​CLPTM1L protein efter RNAi-behandling blev undersøgt under anvendelse af immunocytokemi. (C) Vækst af shRNA-CLPTM1L transfekterede celler 95-D celler og kontrol 95-D-celler i 72 timer. (D) shRNA-CLPTM1L transficerede celler 95-D-celler og kontrol 95-D-celler blev behandlet med angivne koncentration af cisplatin i 24 timer. *: P = 0,003 vs NC kontrolgruppe (25 uM) og #: p = 0,006 vs NC kontrolgruppe (50 uM)

For at demonstrere den biologiske aktivitet af CLPTM1L, vi undersøgte effekten af. faldt CLPTM1L ekspression på lungekræft cellevækst in vitro. Ved hjælp af en celleproliferationsassay, fandt vi, at de shRNA-CLPTM1L-transficerede 95-D-celler havde en vækstrate svarende til den i kontrolceller over en 72 timers periode (fig. 4C). CLPTM1L knockdown påvirkede ikke celleproliferation.

6. RNAi-medieret Knockdown af CLPTM1L Øget kemosensitivitet til cisplatin i Human Lung Cancer 95-D-celler og Cisplatin-induceret aktivering af caspase-9 og caspase-3/7

CLPTM1L blev først opdaget i et cisplatin-resistente ovarietumor cellelinie. Her konstaterede vi, om nedsat CLPTM1L udtryk kunne øge kemosensitivitet til cisplatin i lungekræft celler. Forskellige koncentrationer af cisplatin blev anvendt til at behandle shRNA-CLPTM1L-transficerede 95-D-celler i 24 timer. Vi fandt cellevækst skal inhiberes betydeligt i de knockdown celler efter cisplatin-behandling (fig. 4D). Dette indikerede, at CLPTM1L knockdown kunne øge kemosensitivitet til cisplatin i humane lungecancer 95-D-celler.

Mitokondrier er nøglen til regulering af apoptose [21], og de spiller en vigtig rolle i cisplatin-induceret apoptose. Efter behandling med cisplatin, caspase-9 og caspase-3/7 mitokondrier blev aktiveret. Da CLPTM1L protein blev fundet at være eksporteret til mitokondrierne, vi spekulerede på, om CLPTM1L var forbundet med apoptostic protein. Vi derefter undersøgt aktiveringen af ​​caspase-9 og caspase-3/7 i shRNA-CLPTM1L-transficeret 95-D-celler og styre 95-D-celler til at afgøre, om CLPTM1L var involveret i mitokondrie apoptose pathway. Vores resultater viste, at cisplatin-induceret apoptose til at begynde med aktiveringen af ​​caspase-9, efterfulgt af aktivering af caspase-3/7 begge celletyper. Endvidere knockdown af CLPTM1L forårsagede forøget aktivering af caspase-9 og caspase-3/7 (fig. 5). Det betyder, at CLPTM1L knockdown celler er mere følsomme over for cisplatin.

shRNA-CLPTM1L transficerede 95-D-celler og kontrolceller blev behandlet med 50 uM cisplatin i 24 timer. Caspase-3/7 og caspase-9-aktivitet blev målt, og resultaterne var repræsenteret gange forøgelse af aktiviteten af ​​cellerne uden cisplatin behandling. *: P = 0,004 vs NC kontrolgruppe (caspase-3/7) og #:. P = 0,000 vs NC kontrolgruppe (caspase-9)

Diskussion

I håb om at definere patogenesen af ​​CLPTM1L i lungekræft, vi fokuseret på CLPTM1L udtryk, cellulære lokalisering og funktionel sammenhæng med lungekræft. Vi fandt, at CLPTM1L blev udtrykt i kræft lungevæv, mest intenst i adenocarcinom væv. Western-blot-analyse og CLPTM1L-EGFP transfektion både indikerede, at molekylet kan være placeret i mitokondrierne. Den nøjagtige funktion af molekylet er stadig uklar. Vi konstaterede dets associering med kemosensitivitet til cisplatin og aktivering af den mitokondriske apoptotiske vej afhængigt af RNAi knock-down teknik. Så vidt vi ved, er dette den første dokumentation for placering af molekylet.

Denne undersøgelse gav flere beviser, at CLPTM1L var forbundet med lungecancer [22], som var i overensstemmelse med den offentliggjorte undersøgelse fra James et al og det humane protein Atlas-projektet [23]. James et al undersøgte ekspressionen af ​​CLPTM1L i mRNA-niveau og fundet CLPTM1L mRNA-ekspression var i gennemsnit 2,24 gange højere hos tumorvæv sammenlignet med tumor-tilstødende væv [23]. Når det kombineres med James ‘arbejde, vores observation syntes at angive, at de forhøjede CLPTM1L protein niveauer kan skyldes stigningen i CLPTM1L mRNA-niveauer. Desuden har vi sammenlignet forholdet mellem CLPTM1L udtryk hos patienter lungekræft med patienternes clinicopathologic karakteristika. Vi fandt CLPTM1L udtryk blev stærkt forbundet med de kvaliteter af differentiering (p = 0,046, tabel 2), blev dog ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem CLPTM1L ekspressionsniveauerne og patientens alder, køn, rygning status eller TMN etape i 151 lunge prøver. Endvidere er andelen af ​​stærk farvning af CLPTM1L ekspression i adenocarcinom var højere end i pladecellekræft, selvom James et al ikke fandt en forskel i CLPTM1L ekspression mellem NSCLC undertyper. Forskellen mellem vores resultater og James ‘resultater kan skyldes antallet af patienter. James analyseret 22 adenocarcinom og 8 pladecellekræft patienter, mens vi analyseret 55 adenocarcinom og 63 pladecellekræft patienter.

Her er vi bekræftet, at CLPTM1L protein blev mere stærkt udtrykt i lungekræft, især i adenocarcinom, end ved normal væv, Dette indikerede, at den praktiske anvendelse af de genetiske variationer af genet ikke var begrænset til at bruge som genetiske markører. Forekomsten af ​​lunge adenocarcinom har været stærkt stigende. Ætiologien er almindeligt antaget at involvere luftforurening og passiv rygning. Men carcinogenese [19], [24] er, kompliceret, og CLPTM1L gen kan også spille en vigtig rolle. Genetisk analyse har afsløret, at CLPTM1L er tæt forbundet med lungeadenocarcinom og den genetiske varians kan forårsage abnorm genekspression, som spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​lungekræft.

Proteinet synes at være lokaliseret i mitokondrier, som angivet ved Western-blot og CLPTM1L-EGFP transfektion. Denne konklusion støttes af protein forudsigelse. Beregningen af ​​hydrofilicitet indikerer, at CLPTM1L protein kan være et transmembrant protein. Ifølge disse data, vi hævdede, at dette protein var en transmembrane protein placeret på mitokondrier membran.

Den nøjagtige funktion af CLPTM1L er stadig ukendt. James et al viste, at CLPTM1L havde en apoptotisk rolle nedstrøms for DNA-skader og gennem regulering af Bd-XL-ekspression [23]. I denne undersøgelse, kunne vi ikke bestemme de nøjagtige biologiske ændringer i forbindelse med CLPTM1L overekspression og knock-down i lungekræft-cellelinjer. I modsætning til resultatet af tidligere rapport [1], har overekspression af CLPTM1L i 95-D lungecellelinjen ikke inducere apoptose, og cellerne har tendens til at være mindre chemosensitive for cisplatin [1]. Forskellen kan være forårsaget af ekspressionsvektorer, som har måske fremkaldt forskellige produkter: CLPTM1L-His for denne undersøgelse og CLPTM1L-GFP for tidligere undersøgelse. RNAi-medieret knockdown af CLPTM1L øget kemosensitivitet til cisplatin i humane lungecancer 95-D-celler og cisplatin-induceret aktivering af caspase-9 og caspase-3/7. Øget aktivering af caspase-9 og caspase-3/7, muligvis forbundet med øget aktivering af det mitokondrielle apoptose pathway. Vi fandt stadig at mastcellerne højt udtrykt proteinet. Det er almindeligt accepteret, at mastceller er forbundet med kræft, de forbedrer tumor angiogenese og gøre fremskridt mindre gunstig [25]. Ifølge disse data, vi forudsagde, at proteinet kan være forbundet med anti-apoptotisk mekanisme, som påvirkede drug-resistens. Yderligere analyse er nødvendig for at bekræfte denne forudsigelse.

De specifikke roller CLPTM1L i lunge kræftceller fortjener yderligere undersøgelser. Det er muligt, at CLPTM1L kan være vigtig for opretholdelse af cellulær stabilitet, og at et tab af funktion kan medføre øget kemosensitivitet til cisplatin.