Abstrakt
Cancer biomarkører letter screening og tidlig påvisning, men er kendt for kun et par kræftformer. Vi demonstrerede princippet inducere tumorer til at udskille et serum biomarkør ved anvendelse af en systemisk administreret genleveringsvektor der målretter tumorer til selektiv ekspression af et konstrueret kassette. Vi udnyttede tumor-selektiv replikation af en konditionelt replikative Herpes simplex virus (HSV) kombineret med et replikations-afhængige sen viral promotor for at opnå tumor-selektive biomarkør ekspression som et eksempel genlevering vektor. Virusreplikation, cytotoksicitet og biomarkør produktion var lave i hvilende normale menneskelige forhud keratinocytter og høj i kræftceller
in vitro
. Efter intravenøs injektion af virus 90% af tumorbærende mus udviste højere niveauer af biomarkør end ikke-tumorbærende mus og ved obduktion, vi har registreret virus udelukkende i tumorer. Vores strategi om at tvinge tumorer til at udskille et serum biomarkør kan være nyttige for kræftscreening i højrisikopatienter, og muligvis til overvågning respons på behandlingen. Hertil kommer, fordi onkolytiske vektorer til tumorspecifik genafgivelse er cytotoksiske, kan de supplere vores screening-strategi som en “theragnostic” agent. Den kræftscreening tilgang præsenteres i dette arbejde introducerer et paradigmeskift i nytten af gen-levering, som vi forudser at blive forbedret med alternative vektorer rettet mod gen-levering og udtryk til tumorer. Raffinering denne tilgang vil indvarsle en ny æra for klinisk kræftscreening, der kan gennemføres i de udviklede lande og ubebyggede verden
Henvisning:. Browne AW, Leddon JL, Currier MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et al. (2011) Cancer Screening ved systemisk indgift af et genleveringsvektor Encoding tumorselektive udskillelig Biomarker Expression. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10,1371 /journal.pone.0019530
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
Modtaget: Marts 1, 2011; Accepteret: 31 marts 2011; Udgivet: Maj 11, 2011
Copyright: © 2011 Browne et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CancerFree Kids Pediatric Cancer Research Alliance (AWB) og NIH award 1R01-CA114001-01A2 (TPC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
afsløring Tidlig kræft er afgørende for at forbedre helbrede kurser, fordi kræft fase forudser prognosen. Cancerassocierede blod biomarkører er blevet identificeret i nogle cancere, såsom prostataspecifikt antigen (PSA) i prostatacancer og Alfaføtoprotein i visse lever- og kimlinie cancere. Biomarkører er ikke blevet identificeret for de fleste pædiatriske kræft og mange voksne kræftformer. Nye innovationer i systemisk genoverførsel hæve udsigten til selektivt at levere og aktivere gener, der koder let påviselige biomarkører i tumorceller, der ikke producerer kendte serum biomarkører. Vi søgte at udvikle en prototypisk cancer screening strategi, hvorved den genetiske information, der koder en universel serum biomarkør for kræft ville blive injiceret i en patient systemisk, leveret til og udtrykt i tumorceller i en tumor-selektiv måde. Tumorer vil reelt blive tvunget til at udskille et serum biomarkør, som derefter kunne måles i blodet eller urinen som screeningtest mens tumor-fri patienter ville vise ingen eller kun lave niveauer af biomarkør efter systemisk administration af genet overførselsvektor (fig. 1a)
(a) trin for kræftscreening strategi er som følger:. 1) kræft-targeting herpes simplex virus (HSV) injiceres systemisk. 2) Engineered HSV selektivt replikerer i tumorer og samtidig være ryddet fra raske ikke-kræft væv. 3) Biomarkør selektivt fremstilles i tumorer. 4) Blodprøver indsamles og analyseres for biomarkør niveauer. 5) Serumniveauer af eksogent leveret biomarkør er højere i tumor-bærende mus end raske tumor-fri mus. (B) genet kort til vildtype-HSV og hidtil ukendt rekombinant rQ-M38G.
exogent indgivet genkodede biomarkører kræver tumor-målrettet genlevering og /eller ekspression. Målretning små molekyler og partikler til tumorer kan opnås ved passiv Enhanced permeabilitet og Retention (EPR) [1], [2], [3], ligand-styrede aktiv målretning [4], [5], [6], [7 ], tumormikromiljøet-afhængig målretning [8], [9], [10], eller en kombination af hver [11]. Vira er naturligt forekommende nanopartikler optimeret til at levere genetisk information i målceller. Den største fordel ved vira end ikke-virale vektorer til DNA levering er deres iboende forkærlighed for replikation i tumorer og deraf følgende forstærkning af signalet.
Herpes Simplex Virus (HSV) type 1 er en model genleveringsvektor fordi det kan inficere en lang række humane celletyper, transducere både delende og hvilende celler effektivt, manipuleres til at udtrykke transgene produkter, acceptere transgener drevet af heterologe eller homologe promotorer, er epigenomic, har skalerbar produktion, og kan sikkert styres med antivirale lægemidler [ ,,,0],12]. Selektive mutationer i HSV-gener giver kræft-selektiv viral replikation. Mutation i HSV gener, der koder den ribonukleotidreduktase stor underenhed (ICP6 /U
L39) og den sene virusprotein ICP34.5 (γ
134,5) begrænser robust virusreplikation til tumorer [13], [14], [ ,,,0],15], har [16] og er blevet vist at være sikker i kliniske forsøg. Aktivering af den strenge sent viral U
L38 gen er afhængig af forudgående sekventiel aktivering af umiddelbare tidlige og tidlige virale gener og cellulære transkriptionsfaktorer [17] og U
L38 promotor (U
L38p) er blevet påvist skal aktiveres selektivt i cancerceller i forbindelse med replikationskompetent γ
134,5
– /- HSV-mutanter [18]. Afhængigheden af sen genekspression ved aktivering af tidlige gener gør U
L38p en stærk kandidat til levering af transgener til cancerceller med selektiv ekspression i sammenhæng med en dobbelt mutant HSV mangler ICP6 og γ
134,5.
Vi udviklede et HSV som en eksemplarisk genlevering vektor til at inducere biomarkør sekretion selektivt fra tumorer. Andre har indarbejdet gener, der koder sekreterbare biomarkører til onkolytiske virus som reportere for virus aktivitet [19], [20], [21], [22] og gen-kassetter til ikke-invasiv overvågning virale leveret gener [23]. Natrium-iodid symporteren gener kodet i onkolytiske virus også lette nuklearmedicin billeddannelse og behandling i inficerede tumorer [24], [25]. For nylig blev Gaussia luciferase (gluc) identificeret og udviklet som en kraftfuld ny reporter molekyle [26], som er let udskilles fra celler, hvilket gør den anvendelig til både
in vitro
og
in vivo
applikationer, hvor ekspressionssystemer kinetik er af interesse. Vi ansat gluc som en prøve biomarkør for dette bevis på princip fordi gluc er 1000 gange lysere end andre luciferaser, er mere følsom end secernerbart alkalisk fosfatase, og kan påvises i blod og urin
in vivo
[27], [ ,,,0],28]. Ved hjælp af en styret rekombination tilgang [29], vi manipuleret en HSV mutant, rQ-M38G, med gluc under kontrol af den sene viral promotor U
L38 (fig. 1b).
Vi søgte at evaluere vores manipuleret viral genleveringsvektor i dyremodeller af flere forskellige tumortyper dannet forskellige steder: intraperitoneal, subkutan, intramuskulær og ortotopisk intrarenal tumorer. Efter systemisk injektion af vores genleveringsvektor (RQ-M38G) i blodet af tumorbærende mus observerede vi rQ-M38G producerende cancercelle-afhængig cytotoksicitet og biomarkør produktion. Vi bemærkede også flere tilfælde, hvor RQ-M38G var i stand til at tvinge mikroskopiske tumor byrder til at producere påviselig blod biomarkør. Disse eksperimentelle forsøg demonstrerede princippet detektere tumorer ved at tvinge dem til at udtrykke en udskillelig biomarkør.
Resultater
In vitro
karakterisering af mutant HSV RQ-M38G
rQ-M38G-medieret gluc transduktion, replikation og cytotoksicitet blev testet ved at inficere en række celletyper med forskellige virus-koncentrationer og vurdering gluc niveauer i dyrkningsmedier (fig. 2a, fig. S1), virusgenom kopital (fig. 2b, fig. S2) og cytotoksicitet (fig. 2c, fig. S3) på dag 2, 4 og 6 efter infektion. Cellereplikation-afhængig cytotoksicitet blev observeret i replikerende human forhud keratinocytter (HFK-R), mens cytotoksicitet var svækket eller fraværende i differentierede /hvilende menneske forhudskeratinocytter (HFK-q) (Fig. S3). Vero, en afrikansk grøn abenyre cellelinje, der er kendt for eftergivende HSV-replikation, viste høj gluc ekspression og RQ-M38G replikation efter lavdosis rQ-M38G infektion (MOI = 0,001, 1 virus pr 1000 celler).
(a) Gaussia luciferase (gluc) transgenekspression, (b) virusreplikation, og (c) cytotoksicitet efter infektion af Vero-celler og et panel af humane tumorcellelinjer med rQ-M38G (MOI = 0,001).
Vi vurderede transgenekspression, virusreplikation og cytotoksicitet efter rQ-M38G infektion af 5 humane tumorcellelinier. SK-NEP_Luc (Ewing sarkom) viste forhøjet gluc ekspression, virusreplikation og cytotoksisk modtagelighed ligner Vero-celler. Osteomet (osteosarkom), STS26T_dsRed (MPNST), og S462.TY (MPNST) hver demonstrerede lavere følsomhed i alle tre analyser. Endelig har vi vurderet cytotoksicitet i 3 veletablerede musetumormodeller afledt fra en C57 /BL6 baggrund (Fig. S3) og flere spontane murine skjoldbruskkirtlen eller småcellet tumorlinjer genereret af en aktiv bruger (data ikke vist). HGF116 (rhabdomyosarcoma) var den eneste cellelinje viser nogen målelig cytotoksicitet, men kun ved en høj virus dosis (MOI = 1, 1 infektiøs virus per celle). Disse data identificerede SK-NEP_Luc som et oplagt mål for
in vivo
screening ved hjælp af RQ-M38G mens andre menneskelige tumorcellelinier blev forudsagt til at være mindre modtagelige for screening med RQ-M38G.
Systemisk administration af rQ-M38G at identificere tumor tilstedeværelse
Vi testede egnethed rQ-M38G som genleveringsvektor at tvinge tumorspecifik sekretion af en biomarkør efter systemisk administration af rQ-M38G i mus med og uden tumorer . Elleve mus blev injiceret orthotopisk med 10
6 SK-NEP_Luc celler i deres renale subcapsule. Tumor-implanterede mus og kontrol tumor-fri mus blev efterfølgende injiceret intravenøst (i.v) med 1,2 × 10
7 pfu RQ-M38G 5 uger efter tumor implantering. På dag 1, 4 og 7 virus injektion mus blev afbildet at identificere ildflueluciferase-positive tumorer og blodprøver blev indsamlet af retro-orbital øje bløder og analyseret for serum gluc (fig. 3a) følgende.
In vivo
imaging identificeret 10 ud af 11 mus, som modtog tumorcellelinier injektioner havde dannet tumorer (fig. 3b). En mus (# 9) aldrig dannet en tumor og en mus (# 11) havde en tumor, der var næppe detekterbar. I alle mus, hvor tumorbyrde var tilsyneladende (9 ud af 11), serum gluc niveauer var 15 til 440 gange højere end tumor-fri mus, hvorimod serum gluc fra de to andre mus forblev under kontrol museserum gluc niveauer (fig. 3). Derfor rQ-M38G indgives systemisk for at inducere biomarkør produktion resulterede i en påvisning følsomhed på 90% for SK-NEP_Luc-bærende mus. Lignende resultater blev for tumorer i forskellige anatomiske steder (Fig. S4).
(a) Tidsforløb for gluc udtryk i renal subcapsule (RSC) SK-NEP_Luc-bærende og tumor-fri mus injiceret systemisk med 1,2 × 10
7 pfu eller rQ-M38G. Tal i legenden repræsenterer individuelle mus. (B) gluc udtryk og
in vivo
billeddannelse af SK-NEP_Luc-bærende mus fire dage efter systemisk injektion af 1,2 × 10
7 pfu RQ-M38G. Serum gluc niveauer for mus injiceret med tumor og kontrol, der ikke modtog tumor injektioner (søjlediagram), og
in vivo
luciferase billeddannelse af mus, som modtog tumor celle injektioner.
Til bestemme placeringen af rQ-M38G i væv efter IV injektion og bekræfter, at serum gluc signal blev udtrykt fra tumorer og ikke normale organer blev organer høstet fra mus 7 dage efter virusinfektion og underkastes immunofluorescens for GFP-ekspression og kvantitativ PCR for virus genomer. Kun tumorer demonstrerede GFP-ekspression i både kontrol- (data ikke vist) og eksperimentel mus (fig. 4a) injiceret systemisk med rQ-M38G. Kvantitativ PCR for virusgenom kopier afspejlede den samme fordeling af virus i tumorbærende mus som blev set med GFP-ekspression hvor viruskopier var mindst 2100 gange højere i tumorerne end raske væv (fig. 4b). Immunofluorescens og qPCR indikerer, at virus infektion dominerede i tumoren og samtidig være minimal i sundt væv. Derfor systemisk indgivet rQ-M38G held identificerede tilstedeværelsen af SK-NEP_Luc tumorer ved at tvinge tumorer til frembringelse af et udskilleligt biomarkør. Vi viste lignende resultater i tumor modeller, der er mindre modtagelige for virus infektion, herunder modeller af maligne perifere nerve kappe tumorer (både subkutane og intraperitoneale steder) og osteosarkom (Tal S5, S6, S7).
(a) GFP immunofluorescens i SK-NEP_Luc-bærende mus med og uden systemisk virus administration. Mus, der modtog virus (# 1 og # 2) viste selektiv GFP-ekspression i tumor, mens mus, der fik ingen virus (nr Virus Control) viste global GFP-negativitet. Scale bar = 15 mikron. (B) Biofordeling af virus i mus med SK-NEP_Luc tumorer efter systemisk administration som bestemt af qPCR for virale genomer.
Induktion af gluc udtryk i tumorer ved intratumoral virus injektion
A blev observeret klar forskel mellem SK-NEP_Luc og de tre andre tumor testede modeller, som hver viste lavere
in vitro
cytotoksicitet og gluc udtryk kombineret med lavere biomarkør udtryk
in vivo
. At identificere, om at levere større doser af virus til tumorer kan øge
in vivo
biomarkører udtryk vi administreret RQ-M38G direkte ind i tumorer ved intratumoral injektion i modeller for S462.TY og Osteomet.
Mus bærende subkutan flanke Osteomet tumorer større end 200 mm
3 blev injiceret med 1,9 × 10
5 pfu virus. Blodprøver blev opsamlet og analyseret for gluc ved hvert tidspunkt (fig. S7a), mens to mus blev aflivet på hvert tidspunkt og analyseres for virale genomiske kopier ved qPCR (fig. S7b). Serum gluc i blod fra mus, der bærer tumorer injiceret med rQ-M38G var højere end gluc niveauer i kontrol uinficerede mus, og stigende gluc over tid spores en profil svarende til viral kopital i tumorer. På trods af en 4000-fold genomisk forstærkning i tumorer, steg serum gluc niveauer kun 10 gange over inficerede kontroller. Intratumoral injektion med 8 × 10
3 pfu eller 8 × 10
7 pfu virus blev gentaget i S462.TY tumorer når tumorerne var større end 500 mm
3. Fire dage efter i.t. injektion serum gluc-niveauer blev analyseret som afbildet i fig. S8. Alle mus, der modtager intratumoral injektion af virus påvist højere gluc niveauer end tumor-fri kontroller uden en væsentlig forskel i gluc koncentration mellem lav dosis og 10.000-fold høj virus dosis, hvilket tyder på mætning ved den lave dosis (mindst via intratumoral rute).
Biomarker følsomhed
Små dyremodeller anvendes til at påvise minimale tumor byrder nuværende teoretiske skalerbarhed udfordringer, når oversætte resultater til menneske-skala praktiske. For at imødegå disse udfordringer, vi søgte at vurdere teoretiske detektionsgrænser for vores biomarkør baseret på en
in vitro
assay og detektere små tumor byrder
in vivo
ved 3 metoder: IVIS luminescens billedbehandling, virus-medieret gluc udtryk i serum og post-mortem histologisk analyse. Blodvolumen i en mus er ca. 2 ml (8% af de 25 g total legemsvægt [30]). Sfærisk SKNEP-Luc tumor bestående af 10
6 celler blev bestemt til at være 1,83 mm i diameter ved at måle volumen, der optages i en centrifugeret prøve af et lige antal celler, idet det antages små tumorer består overvejende af tumorceller. Ti til 1 million celler blev udpladet i 2 ml celledyrkningsmedier og co-inficeret med rQ-M38G ved en MOI på 3 for at sikre hver celle ville blive inficeret. To dage efter infektion celledyrkningsmedier blev opsamlet og analyseret for gluc koncentration. Virus-medieret gluc udtryk kunne pålideligt løses ved samtidig transduktion 1000 celler, som omtrentlige en sfærisk tumor med en diameter på 183 mikrometer (fig. S9).
Ewings sarkom tumorer (SKNEP-Luc) af forskellige størrelser blev etableret i 11 mus ved injektion af 10
6 celler ind i venstre nyre subcapsularly i 3 grupper af mus på 3 på hinanden følgende uger. Mus med tumorer, der var udviklet over 2, 3 og 4 uger og 4 tumor-fri kontrolmus blev inficeret systemisk med 1 × 10
7 pfu rQ-M38G. Fire dage efter infektion mus blev afbildet via IVIS blev blodprøver indsamlet til gluc kvantificering og mus aflivet til histologisk tumor dimensionering.
In vivo
billeddannelse til luciferaseekspression afslørede mus blottelse tumorer drastisk forskellige i størrelse på tidspunktet for infektion og offer (ekstreme eksempler er vist i fig. 5a). Serum gluc koncentration i tumor-bærende mus 4 dage efter infektion viste gluc mængder større end tilsvarende inficerede tumor-fri kontrolmus (fig. 5b). Histologisk evaluering af tumorer i hver mus afslørede en makroskopisk tumor og mikroskopisk tumor foci i mus
jeg
og
ii
(fig. 5c).
a)
in vivo
billeddannelse af to mus (
jeg
og
ii
) med vidt forskellige SKNEP-Luc tumor byrder. b) koncentrationen Serum gluc i mus I, II og fire tumor-fri kontrolmus 4 dage efter systemisk infektion med 1 x 10
7 pfu rQ-M38G. c) Hematoxylin og eosin makroskopiske billeder af tumor bærende nyrer (T = tumor, skala barer = 1 mm) og mellemværker af mikroskopiske tumor foci i den renale parenkym af mus
ii
(skala bar = 200 um).
diskussion
Vi udviklede en ny kræftscreening strategi, hvor tumorer er tvunget til at udskille en biomarkør. Vi udviklede en betinget replikativ HSV, RQ-M38G, til selektivt tvinge tumorceller til at udskille Gaussia luciferase som en demonstration af denne screening strategi. Tumor-bærende dyr givet intravenøst RQ-M38G udtrykte højere niveauer af biomarkør sammenlignet med tumor-fri dyr, som viste kun lav, baggrund udtryk. Anvendeligheden af rQM-38G til screening syntes at være en funktion af, om en given tumor at støtte HSV-replikation. Uanset tumortype eller placering, tumor screening ved RQ-M38G var meget følsomme over for tilstedeværelse af tumor.
Et kritisk træk for kræftscreening er evnen til at detektere små tumorer, i sidste ende i mennesker. En
a priori
bekymring var, at små tumorer kan være forbundet med mindre vaskulære areal til rådighed for HSV post. Dette problem synes ikke at være en begrænsning i mus, fordi der i nogle af de modeller var vi i stand til at detektere tumorer så små som 4-5 mm i diameter (50 mm
3) og i en anden model, vi har registreret mikroskopisk tumorbyrde . Skalerbarhed for mennesker (med større blod volumen) er vanskeligt at forudsige, men nogle skøn er mulige.
In vitro
evaluering af et stigende antal SKNEP-Luc tumorceller indikerer, at infektion af så få som 1.000 celler i et volumen på celledyrkningsmedier lig med en mus blodvolumen udbytter detekterbar gluc sekretion. Derfor samtidig ekspression af gluc fra 1000 celler til enhver tid i en mus er teoretisk detekterbar. Under disse betingelser inficerer 10% af cellerne i en tumor med diameter 400 um (10
4 celler) ville kunne påvises i en mus. Når skaleres fra en mus til et menneske den teoretiske grænse for detektion forøges ved et forhold på 1:2600 (25 mg mouse:65 kg menneske) og fortynding af biomarkør i en større gennemsnitlig blodvolumen på 4,7 L. human af disse tal, den teoretiske grænse for detektion ved inficerer 10% af cellerne i en tumor er ændret fra et masse 394 um diameter i en mus til en 1-4 mm tumor diameter i et menneske. Hvis kun 1% af tumorcellerne transduceres af virus, kan tumorer så små som 8,5 mm i diameter stadig kunne påvises ved hjælp af disse beregninger. Denne følsomhed tyder stærkt potentiale til identifikation minimal tumorbyrder selv når skaleres til humane proportioner.
Evnen af denne screening-strategi til at afsløre tumorer er afhængig af virale faktorer, tumormikromiljøet og biomarkør afsløring begrænsninger hver især kan forbedret til virkelige verden funktionalitet. Her anvendes vi en dobbelt svækket HSV at bevirke en tumor specifik transduktion og genekspression. Sådanne vektorer er allerede blevet dokumenteret at være sikker til human brug [31]. Alternative virus med enkelt eller mindre svækkende mutationer demonstrerer større onkolytiske kapacitet er også allerede i kliniske forsøg (fx HSV1716, se www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). Kobling denne screening strategi til mindre svækkede vira vil sandsynligvis sprede dens anvendelighed blandt de forskellige faste maligniteter samt styrke den terapeutiske komponent. Midler, som samtidig er både diagnostisk og terapeutisk er blevet døbt “theragnostic.” Det er muligt vores strategi kunne yderligere raffineres ved brug af en mere robust kræft-afhængig promotor til at drive biomarkør udtryk. Forbedret vektor levering til tumoren kan også opnås ved anvendelse tumortargeting små molekyler og nanopartikler optagelse-enhancement strategier som for nylig beskrevet ved brug af internalisering RGD-peptider [8]. Eventuel kommercialisering af vores foreslåede screening strategi vil have gavn af at bruge biomarkører, der allerede er i udbredt brug som βHCG (graviditetstest), PSA (prostata-kræft) og αFP (lever- og kim celle maligniteter). Biomarkør assay følsomhed i forbindelse med denne screening strategi kan stadig forbedre eksponentielt som bliver realiseret med mikrofluide teknologier [32], [33], [34], [35].
En væsentlig bekymring for prototypiske kræft screeningsmetode udviklet i dette arbejde er udviklingen af et immunrespons på genafgivelse middel eller den transducerede biomarkør, som skal udelukke gentagen brug af screeningen værktøjet. Tidligere arbejde i marken har vist, at præ-immuniserede dyr stadig opleve terapeutisk fordel fra HSV med vedvarende effekt [36]. Fordi 80% af den almindelige befolkning har været udsat for HSV, vil gennemføre denne detektionsstrategi med HSV afhænge af effektiviteten af industrielt HSVs administreres til immunkompetente individer, som tidligere har været udsat for vildtype-HSV-stammer.
In vitro
screening for mus tumorcellelinier viste, at alle mus linjer vi testede udstillet forholdsvis lav modtagelighed for infektion med vores svækket mutant virus, på lige fod med normale hvilende humane celler. In vivo modeller af HGF116 viste ingen virus følsomhed efter i.t. eller i.v. indsprøjtning. Således kan vi ikke vurdere vores kræftscreening strategi i en immunkompetente model indtil identifikation af musemodeller, der er mere modtagelige for menneskelige HSV. Gennemførelsen af denne strategi kan udvikle sig med ikke-virale vektorer [37] eller virale vektorer maskeret i liposomer [38].
Udfordringen i befolkningen i hele kræftscreening er udviklingen af kliniske analyser, der er skattemæssigt praktisk, universal over et spektrum af cancertyper, og let at implementere. Fysisk undersøgelse, mens overkommelige, ofte undlader at identificere maligniteter, der er dyb eller asymptomatisk. Imaging fordele fra høj følsomhed, men kan ikke altid skelne uspecifikke eller godartede masser af malign sygdom (fx kan lunge knuder være granuloma eller kræft), er økonomisk udfordrende og vanskelige at bredt gennemføre. Med identifikationen af egnede biomarkører, kunne kræftscreening potentielt være økonomisk rentabelt med automatiseret point of care testing (POCT) teknologier (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).
Dette arbejde viser princippet inducere ekspression af et udskillelig transgen i cancer ved anvendelse af en systemisk administreret genlevering middel som en biomarkør til at screene for tilstedeværelse af tumor. Romanen princip screening foreslået og demonstreret i dette arbejde kunne holde umiddelbare konsekvenser for patienter med kendte kræftrisiko såsom genetiske dispositioner (BRCA-1, NF1 mutationer) eller patienter med en historie af kræft, der er i høj risiko for tilbagefald. I sidste ende kan eksogene administration af en kræft målrettet genlevering agent (smitsom eller ikke) tvinge nogen malignitet til at udskille en biomarkør og kunne bruges som en universel første skridt til befolkningen i hele kræftscreening. Virkningen af denne fremgangsmåde vil revolutionere teknologien til kræft påvisning i industrialiserede lande og udviklingslandene, hvor billedbehandling og biopsi-baserede diagnostik kan ikke være så let tilgængelige.
Materialer og metoder
Celler og vira
humane tumorcellelinjer er blevet beskrevet tidligere [40], [41] eller blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), bortset SK-NEP_Luc, som var en venlig gave fra Jason Frischer (CCHMC, Cincinnati, OH). Celler blev dyrket i DMEM eller McCoys 5A-medium (ATCC, SK-OV-3, SK-NEP_Luc) med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT) og penicillin /streptomycin (Life Technologies, Carlsbad, CA). Mus C57 /BL6 cellelinjer LLC
GFP [42] (Lewis lungecancer) og B16-BL6 (melanom) var venlige gaver fra Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, OH) og HGF116 (rhabdomyosarkom) blev afledt af en genetisk manipuleret mus. Primære humane forhud keratinocytter (HFK) var en venlig gave fra Susa Wells (CCHMC, Cincinnati, OH), dyrket i EpiLife Media (Cascade Biologics, Portland, OR) og differentieret til hvilende keratinocytter med 10% FBS og 1 mmol /l CaCI
2 [43]
rQ-M38G blev konstrueret som følger:. U
L38 promotor blev isoleret fra HSV rRp450 ved PCR ved hjælp af primere designet tidligere [18], der blev ændret til at omfatte en 5 ‘ BglII- og 3 ‘HindIII-steder (F1, R1 i tabel S1) og klonet ind i BglII og HindIII-stederne i pCMV-gluc (Invitrogen), der erstatter CMV-promotoren. U
L38p-gluc kassetten blev amplificeret ved PCR af PU
L38p-gluc med optagelse af en 5’SpeI og 3’EcoRI og klonet ind i SpeI-EcoRI-stederne i den “HSV-Quick” shuttle-plasmid, pT-OriSIE4 /5 [29] (en venlig gave fra Yoshinaga Saeki, The Ohio State University, Columbus, Ohio), hvori oriS (E4 /5 Kpnl fragment var blevet fjernet. det resulterende plasmid, pT-U
L38p-gluc, blev anvendt i HSVQuick BAC system til at generere rQ-M38G [29]. Primere til PCR-analyse og sekventering er vist i tabel S2. vira blev opformeret og titreret [44] ved plaque-assay på Vero-celler. cellecytotoksicitet blev bestemt i 96-brønds vævskulturplader anvendelse af en modificeret MTS /PMS assay (Promega, Madison, WI).
Gaussia luciferase assay
gluc-aktivitet blev vurderet på 10 pi prøver af vævskultur medier eller serum ved kemiluminescensassay [45] på en autoinjecting luminometer ved at injicere 50 pi 50 pM coelenterazin (Prolume, Pinetop, AZ) til hver prøve i tre eksemplarer og integrere signalet for 2,5 sekunder [26].
Virus biofordeling
Dyreforsøg blev godkendt af Cincinnati Børnehospital Institutional Animal Care og brug Udvalg (Animal protokol # 9D12095). 5-6 uger gamle Balb /c athymiske nøgne mus (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) blev injiceret med 1-5 millioner celler. Celler blev fremstillet i 33% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) og 66% phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) til subkutan (s.q.) injektion og PBS kun for renal subcapsule (r.s.c) eller intraperitoneal (i.p.) injektion. Virus doser er beskrevet i teksten. Virus blev suspenderet i 100-150 pi PBS til hale vene injektioner og 50-100 pi PBS for intratumorale injektioner, som blev fordelt i 5 fraktioner i hele tumoren.
Tissue forberedelse og immunofluorescens
Væv blev fikseret, indlejret, og skåret i 12 um snit under anvendelse af standardprocedurer. Snit blev permeablized med 0,2% Triton-X i PBS i 10 minutter, blokeret i 10% normalt gedeserum i 60-90 minutter, og inkuberet med kylling anti-GFP (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, MA) i 60 minutter , skyllet tre gange med PBS og inkuberet med sekundært antistof (gede-anti-kylling FITC, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), skyllet med PBS, og monteret med Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Alle objektglas blev derefter afbildet med OpenLab Imaging Software (Improvision, Waltham, MA) på en omvendt fluorescerende Zeiss mikroskop.
HSV-genomet kvantificering
DNA blev isoleret fra musevæv vha Gentra Puregene DNA-isolering (Qiagen, Valencia, CA) og kvantificeret under anvendelse af NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, dE). Real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI 7500-systemet (Applied Biosystem, Foster City, CA) [46]. Standarder blev fremstillet ud fra oprenset HSV1716 viralt DNA.
rQ-M38G genekspression og replikering studier i cellelinier
Celler blev inficeret i 12-brønds skåle i 1 time og høstet på tidspunkter angivet. 100 pi af cellesuspensionen blev anvendt til måling Gaussia luciferase, mens den resterende cellesuspension blev underkastet tre cykler af frysning-optøning og centrifugeret ved 20.000 x g. Pellets blev resuspenderet i 200 pi PBS. DNA blev isoleret under anvendelse af DNeasy blod og væv (Qiagen, Valencia, CA). Hurtig realtids-PCR blev udført under anvendelse af 7900HT Hurtig Real Time PCR System (Applied Biosystem, Foster City, CA). Standard DNA- eller DNA ekstraheret fra inficerede celler (40 ng) blev tilsat til 10 pi SYBR Premix Ex Taq II Kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan), 1,6 pi af en thymidinkinase primerblanding (TK 290-F: 5 ‘ TCG CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC; TK 400-R: 5 ‘CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA, hver ved 400 nm), 0,4 pi Rox (Takara) og PCR-grade vand til et endeligt volumen på 20 pi pr reaktion. PCR var 1 cyklus ved 95 ° C i 30 sekunder, 40 cykler ved 95 ° C i 3 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 25 sekunder.
In vivo
imaging
Mus blev injiceret ip med 150 mg /kg D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) og afbildes af IVIS200 (Calipur Lifesciences).
Støtte oplysninger
figur S1.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.