PLoS ONE: Aktivering af Akt Survival Pathway Bidrager til TRAIL Resistance in Cancer Cells

Abstrakte

Mekanismen af ​​tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) modstand i cancerceller er ikke fuldt forstået. Her viser vi, at det Akt overlevelse pathway spiller en vigtig rolle i TRAIL resistens i humane cancerceller. Konkret fandt vi, at TRAIL behandling aktiverer Akt overlevelse pathway og at inhibering af denne vej ved PI3K-inhibitoren LY294002 eller knockdown af Akt sensibiliserer resistente cancerceller for TRAIL. Da Akt negativt reguleres af tumor suppressor PTEN, undersøgte vi TRAIL følsomhed i PTEN knockdown muse prostata epitelceller og fundet, at PTEN

– /- celler er mere resistente end PTEN

+ /+ -celler, mens følsomheden af PTEN

+/- celler faldt i mellem. Endvidere viste vi at overekspression af en mutant PTEN bibringer TRAIL resistens i PTEN

+ /+ -celler, understøtter en rolle PTEN i TRAIL følsomhed. I TRAIL resistente bryst T47D-celler, overekspression af mutant PTEN yderligere øget deres modstand mod TRAIL. Tilsammen indikerer vore data, at inaktivering af funktionelle PTEN og den deraf følgende aktivering af Akt pathway forhindrer TRAIL-induceret apoptose, hvilket fører til TRAIL modstand. Derfor tyder vore resultater, at TRAIL resistens kan overvindes ved at målrette PTEN eller Akt overlevelse pathway i cancerceller

Henvisning:. Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) Aktivering af Akt Survival pathway Bidrager til TRAIL Modstand i kræftceller. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10,1371 /journal.pone.0010226

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Februar 22, 2010; Accepteret: 19 marts 2010; Udgivet: 19 April, 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH /NCI tilskud R01 CA100073 og Department of Defense Breast Cancer Program W81XWH-07-1-05-21. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

TRAIL (eller Apo2L) er et medlem af tumornekrosefaktor superfamilien der selektivt inducerer apoptose i kræft, men ikke normale celler, hvilket gør det til et attraktivt middel til kræftbehandling. TRAIL inducerer apoptose gennem aktivering af dens dødsreceptorer DR4 (TRAIL-R2) og /eller DR5 (KILLER, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Når TRAIL binder til DR4 og /eller DR5 receptorer, de dødsreceptorer bliver trimeriseret og derefter rekruttere adapteren protein FADD (Fas-associeret protein med døden domæne) og procaspase 8 eller procaspase 10 at danne DISC, hvilket fører til caspase 8 aktivering [1 ], [2]. Aktiveret caspase 8 kan direkte aktivere effektor-caspaser 3, 6 og 7 til at udløse apoptose eller indirekte inducerer apoptose gennem tBid-induceret caspase 9 medieret mitokondriel apoptose pathway [2], [4].

Selvom TRAIL er en attraktive terapeutiske middel mange cancerceller er resistente over for dette stof [2]. Mekanismerne ved TRAIL resistens er ikke fuldt forstået, men kan forekomme på flere niveauer fra dets receptorer til eksekutor caspaser på dens signalvej [2], [4]. På receptorniveau, har mutationer i DR4 og DR5 blevet fundet i nogle tumorer, herunder bryst- og lungecancere [4]. Forøget ekspression af decoy receptorer og faldt DR4 /DR5 ekspression er korreleret med TRAIL modstand, selv om andre undersøgelser, at ekspressionsniveauerne af TRAIL-receptorer ikke korrelerer med TRAIL følsomhed. Ved døden til luftindtag signalering kompleks (DISC) niveau, er c-FLIP menes at være en væsentlig hæmmer til TRAIL signalering [5], [6]. En nylig undersøgelse viste, at TRAIL følsomme ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler samle DISC i lipidklumper i plasmamembranen, der fører til caspase 8 aktivering, mens ikke-tømmerflåde DISC samlingen fører til rekruttering af c-FLIP og RIP og aktiveringen af ​​pro-overlevelse signalveje såsom NF-KB og ERK1 /2 veje [7]. Desuden er det blevet vist, at anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien, herunder Bcl-2 og Mcl-1, er også involveret i TRAIL resistens [8], [9]. Aktiveringen af ​​andre overlevelse pathways herunder Akt og NF-KB pathways fører til celle overlevelse og kemoresistens [10]. Konsekvent, er det blevet vist, at aktiveringen af ​​Akt pathway er tæt forbundet med lægemiddelresistens herunder TRAIL resistens [11], [12]. Imidlertid er den nøjagtige mekanisme, hvormed Akt pathway forårsager TRAIL modstand ikke fuldt klarlagt.

PI3K /Akt-signalvejen er en prototypisk overlevelse pathway, der spiller en central rolle i forskellige cellulære funktioner, herunder proliferation, vækst, overlevelse og metabolisme [13]. Ved vækstfaktorstimulering, er PI3K aktiveres til at phosphorylere phosphotidylinositol-3, 4-bisphosphat (PIP2), genererer phosphatidylinsitol-3, 4, 5-triphosphat (PIP3). PIP3 binder til Akt, derefter translokerer til plasmamembranen, hvor Akt aktiveres ved sekventiel phosphorylering på T308 og S473 rester. Phosphorylering på T308 medieres af PDK-1 (3′-phosphoinositid-afhængig kinase 1), mens phosphorylering på S473 kan medieres af flere kinaser, herunder PDK-1 og mTORC2 [13]. Når den er aktiveret, kan Akt phosphorylere mange substrater at udøve sine funktioner. Den bedst karakteriseres substrat af Akt er serin /threonin-kinase mTOR (pattedyr mål for rapamycin). Akt kan direkte phosphorylere og aktivere mTOR og indirekte aktivere mTOR ved phosphorylering og inaktivere knolde sklerose kompleks 2 (TSC2). Aktiveret mTOR danner et kompleks med Raptor at aktivere ribosomale protein S6 kinaser (S6K) og hæmmer 4E-BP, hvilket fører til øget protein oversættelse [13]. Det er kendt, at aktivering af PI3K /Akt /mTOR pathway kan øge celleoverlevelse og apoptose resistens induceret af en række agenter [12], [13]. For eksempel overekspression af Akt øger TRAIL resistens [11], [14]. På den anden side kan den tumorsuppressorgen PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) dephosphorylere PIP3 kan fungere som en negativ regulator af PI3K /Akt /mTOR signalering. PTEN inaktivering fører til aktivering af PI3K /Akt /mTOR-signalvejen. Imidlertid er den nøjagtige mekanisme, hvorved PI3K /Akt /mTOR pathway bibringer TRAIL resistens ikke fuldt klarlagt.

I denne undersøgelse har vi påvist, at forøget aktivering af Akt pathway spiller en vigtig rolle i TRAIL modstand. Konkret viste vi, at TRAIL aktiverer Akt vej, og at blokaden af ​​Akt aktivering af PI3K-inhibitor LY294002 eller knockdown af Akt udtryk ved siRNA sensibiliserer resistente celler til Trail. Vi fandt også, at genindførelse af vildtype PTEN i PTEN knockout celler sensibiliserer PTEN

– /- celler til Trail hvorimod inaktivering af PTEN i PTEN

+ /+ og PTEN

+/- celler fører til TRAIL modstand . Disse resultater antyder, at forøget aktivering af Akt pathway via inaktivering af PTEN spiller en vigtig rolle i TRAIL modstand.

Materialer og metoder

Reagenser

LY294002 blev indkøbt fra Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Rekombinant TRAIL blev købt fra PeproTech (Rocky Hill, NJ). Kanin polyklonale antistoffer mod phosphoryleret Akt (Ser473), phosphoryleret mTOR, phosphoryleret p70S6K, phosphoryleret eIF4E, PTEN, total Akt, og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-actin-antistof blev købt hos Sigma. De adenovirus, der udtrykker vildtype og dominant negativ PTEN, samt kontrol adenovirus udtrykker galactosidase (Ad-LacZ), blev venligst stillet til rådighed af Dr. Mengjer Lee (University of Louisville).

cellelinjer, dyrkningsbetingelser, og behandling

De humane brystcancerceller T47D-celler blev opnået fra American Type Culture Collection og opretholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS). Humane ovariecancer SKOV3-celler blev dyrket i RPMI1640 med 10% FBS, OVCA432 celler blev dyrket i MCDB105 /M199-medium med 10% FBS, som beskrevet [15]. PTEN-knockout mus prostata epitelceller (PTEN

– /- og PTEN

+/-) og normale celler (PTEN

+ /+) blev opnået fra Dr. Young Chen (Wake Forest University) og vedligeholdt i DMEM med 10% FBS, som tidligere beskrevet [16]. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære bestående af 5% CO

2 og 95% luft.

siRNA transfektion til knockdown af Akt

Signal Silence siRNA for Akt og tilsvarende kontrol siRNA blev købt fra Cell Signaling. Transfektionerne blev udført som foreslået af producenten med små modifikationer, som tidligere [17] beskrevne. Kort beskrevet blev T47D-celler udpladet ved 6 × 10

5 pr brønd i seks-brønds plader. Den næste dag blev cellerne transficeret med Akt eller uden for målgruppen kontrol siRNA’er vha Oligofectamine (Invitrogen). Efter 24 timer blev transficerede celler trypsiniseret og udpladet ved 6 × 10

5 pr brønd i seks-brønds plader. 48 timer senere blev transficerede celler efterladt ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer og derefter høstet for at vurdere ekspression af Akt og spaltes PARP ved Western blot analyse. Til bestemmelse kemosensitivitet blev celler med eller uden transfektion placeres ved 8.000 pr brønd i 96-brønds plader og derefter behandlet med TRAIL i 24 timer, og cellelevedygtigheden blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , (MTT) assays 5-diphenyltetrazolium.

MTT assays

MTT assays blev beskrevet tidligere [18].

Western blot-analyse

procedurerne til forberedelse af hel-celle proteinlysater og Western blot-analyse blev beskrevet tidligere [18].

Adenoviruse infektioner

PTEN

+ /+, PTEN

+/- og PTEN

– /- mus prostata epitelceller og humane brystcancer T47D-celler blev udsået i 60 mm skåle på 8 × 10

5, 6 × 10

5, 5 × 10

5 og 8 × 10

5 celler pr fad henholdsvis. Den næste dag blev cellerne vasket med normalt medium og inficeret med adenovirus, der udtrykker vildtype PTEN, dominant negativ PTEN, eller LacZ. Under infektion blev celler forsigtigt rystet hvert 10. minut i 1 time og derefter holdt i adenovirus indeholdende medium ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. 24 timer senere blev inficerede celler skiftet til normalt medium uden adenovira og derefter kontinuerligt dyrket i yderligere 48 timer. Ved 72 timer efter infektion blev celler trypsineret og udpladet i 60 mm skål ved 5 × 10

5-celler. Den næste dag blev cellerne efterladt ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celler blev høstet til Western blot-analyse og MTT-assayet, henholdsvis.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Students

t

test. Dataene blev præsenteret som middelværdi ± SD, og ​​

P

≤0.05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Karakterisering af TRAIL følsomhed i et panel af bryst- og ovariecancer celle linjer

for at forstå mekanismerne i TRAIL modstand, vi først undersøgt TRAIL følsomhed i 14 cancer cellelinjer, herunder 3 bryst og 11 æggestokkene kræft cellelinjer. Disse cellelinier blev behandlet med forskellige doser af TRAIL i 24 timer, og celleproliferation blev målt ved MTT-assayet. Fig. 1 viser, at disse cellelinjer udviste den differentielle TRAIL følsomhed; MDA-231, DOV13, OV433 og OVCA420 celler var følsomme over for TRAIL mens resten af ​​linjer var resistente over for TRAIL undtagen MCF-7 celler, som viste beskedne modstand. Disse data viser, at mange æggestokkene og brystkræft cellelinier er resistente over for TRAIL.

Menneskelig brystcancercellelinier T47D, MDA231, og MCF7 og æggestokkene kræft cellelinjer DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112D, CaOV3, OVCA420, og SKOV3 blev behandlet med forskellige doser af TRAIL for 24 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assays. Celleproliferation data er udtrykt som procent af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg.

The Akt /mTOR pathway aktiveres i TRAIL resistente cellelinier

Eftersom mange bryst- og æggestokkræft cellelinier er resistente over for TRAIL, er det vigtigt at forstå den underliggende mekanisme for TRAIL modstand. Det er blevet rapporteret, at TRAIL kan aktivere flere pro-overlevelse veje, herunder Akt, NF-KB og ERK pathways [19], [20], [21], [22]. Fordi aktivering af disse veje modulerer celle overlevelse og kemoresistens, er det tænkeligt, at aktivering af disse veje bidrager til TRAIL modstand. For at teste denne mulighed, vi behandlede fire resistente linjer T47D, SKOV3, OVCA432 og OV90 med 100 ng /ml TRAIL for forskellige perioder og undersøgt aktiveringen af ​​Akt, NF-KB og ERK veje, samt udtryk for Bcl -2 familie proteiner. Som vist i fig. 2A-D, niveauerne af både phosphoryleret Akt og mTOR-protein blev forøget så tidligt som 2 timer og varede op til 6 timer efter TRAIL behandling, Vi viste også, at sådan aktivering ikke skyldtes en stigning i de samlede Akt og mTOR proteiner, som forblev konstant (fig. 2A-D). Desuden viste vi, at p70S6K og elF4E, begge er efterfølgende mål for mTOR, aktiveres (Fig. 2A og D). Disse data indikerer, at TRAIL kan aktivere Akt /mTOR pathway i TRAIL resistente cellelinier. Vigtigere, viste vi, at Akt og mTOR ikke aktiveres i TRAIL følsomme MCF-7 og OVCA420 celler (Fig. 2E og F). Således er vores resultater antyder, at aktivering af Akt /mTOR pathway er en almindelig begivenhed i TRAIL resistente kræftceller og at denne vej kan være vigtigt i TRAIL modstand. Desuden fandt vi, at TRAIL kunne aktivere MEK /ERK og NF-KB pathways i OV90 celler, men ikke i andre tre cellelinier (data ikke vist). Desuden har inhibering af ERK og NF-KB pathways ved deres tilsvarende farmakologiske inhibitorer ikke påvirke TRAIL følsomhed i OV90 celler (data ikke vist), hvilket indikerer, at aktivering af disse to veje ikke kan være vigtig i TRAIL resistens i denne cellelinie.

T47D (A), SKOV3 (B), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (E) og OVCA420 (F) celler blev behandlet med 100 ng /ml TRAIL i 0, 2, 4 og 8 h (i T47D-celler, blev 6 timer behandling inkluderet), og totalt protein blev ekstraheret. Niveauerne af total og phosphoryleret Akt (

s-AKT

), og phosphoryleret mTOR (

s-mTOR

) blev bestemt ved Western blot analyse. I T47D (A) og OV90 (D) celler, blev niveauerne af phosphoryleret p-p70S6K og phosphoryleret elF4E (p-elF4E) også undersøgt. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Notatet var der to bands for Akt (Akt1 og Akt2) i både OVCA432 og OV90 celler, mens kun et bånd for Akt blev påvist i T47D og SKOV3 celler.

Hæmning af Akt aktivering sensibiliserer resistente celler til spor

Siden Akt pathway blev aktiveret i alle resistente testede cellelinjer, vi spurgte, om hæmning af Akt aktivitet kunne øge deres TRAIL følsomhed i resistente celler. Til dette formål har vi behandlet T47D-celler med PI3K-inhibitoren LY294002 og undersøgte effekten af ​​Akt-inhibering på TRAIL-induceret apoptose. Som vist i fig. 3, TRAIL behandling øget Akt fosforylering i T47D-celler, som blev afskaffet ved LY294002, der viser, at Akt aktivering er PI3K afhængig. Ligeledes viste vi også, at aktivering af Akt bliver blokeret af LY294002 i OVCA432 celler (fig. 3C). Vigtigere, hæmning af Akt phosphorylering med LY294002 signifikant forøget TRAIL-induceret PARP-spaltning i sammenligning med celler behandlet med TRAIL eller LY294002 alene (fig. 3A og C). Desuden viste vi, at kombineret behandling af TRAIL og LY294002 signifikant hæmmer celledeling i forhold til enten agent alene (fig. 3B og D). Disse resultater antyder kraftigt, at aktiveringen af ​​Akt spiller en vigtig rolle i TRAIL resistens i cancerceller.

A og C, virkning af PI3K-inhibitoren LY294002 på TRAIL-induceret apoptose. Brystkræft celle T47D (

A

) og kræft i æggestokkene celle OVCA432 (

C

) blev efterladt ubehandlet eller forbehandlet med 10 pM LY294002 (

LY)

i 30 min, og derefter behandlet med eller uden 100 ng /ml TRAIL i 6 timer. Totalt protein blev ekstraheret, og spaltes PARP og total og phosphoryleret Akt blev bestemt ved Western blotting.

B og D

, effekt af LY294002 på TRAIL-induceret væksthæmning. T47D (

B

) og OVCA432 celler (

D

) blev efterladt ubehandlet eller forbehandlet med 10 pM LY294002 i 30 minutter, og derefter behandlet med eller uden 100 ng /ml TRAIL i 24 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assays og udtrykt som procentdel af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. **,

P

0,001, statistisk signifikans; *,

P

. 0,01, statistisk signifikans

Knockdown af Akt sensibiliserer brystkræft T47D-celler til spor

Selvom behandling med PI3K-inhibitoren LY294002 øget TRAIL -induceret apoptose, kan resultaterne ikke fuldstændigt afspejle den eksklusive rolle Akt i TRAIL resistens fordi LY294002 kan hæmme andre kinaser. For at undersøge den direkte rolle af Akt aktivering i TRAIL modstand anvendte vi siRNA til Knockdown Akt ekspression og derefter bestemme virkningen af ​​Akt knockdown på TRAIL følsomhed. Vi transficerede T47D-celler med siRNA mod Akt (Akt 1, 2 og 3) eller kontrol siRNA og viste, at Akt blev effektivt banke skudt ned af Akt siRNA i celler med eller uden TRAIL behandling, sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (Fig. 4B ). Vigtigere, viste vi, at knockdown af Akt sensibiliseret TRAIL induceret PARP-spaltning i sammenligning med de samme celler transficeret med kontrol siRNA (fig. 4B). Endvidere knockdown af Akt øget TRAIL-induceret vækstinhibering mens sådanne forandringer minimale i celler transficeret med kontrol siRNA (fig. 4A). Således er vores resultater viser, at mens TRAIL kan forårsage apoptose, også aktiverer Akt overlevelse pathway at modvirke TRAIL-induceret apoptose.

A

, virkning af Akt knockdown på celleproliferation. T47D-celler blev udpladet ved 6 × 10

5 pr brønd i seks-brønds plader. Den næste dag blev cellerne transficeret med Akt eller kontrol siRNA’er vha Oligofectamine. Efter 2 d blev celler efterladt ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer, og celleproliferation blev bestemt ved MTT-assays. Celleproliferation data er udtrykt som procent af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. *,

P

0,01, statistisk signifikans.

B

, effekt af Akt knockdown på TRAIL-induceret apoptose. T47D-celler blev transficeret med Akt eller bekæmpelse siRNA’er og derefter behandlet med eller uden TRAIL (100 ng /ml) i 24 timer som beskrevet i (

A

). Totalt protein blev ekstraheret til analyse af total og phosphoryleret Akt (

s-AKT

) og PARP ved Western blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Tab af PTEN bibringer TRAIL resistens

Det er kendt, at PTEN er en negativ regulator af Akt og at øget Akt aktivitet har været forbundet med inaktivering af PTEN i flere kræftformer. At forstå mekanismen af ​​Akt aktivering-medieret TRAIL resistens behandlede vi PTEN

+ /+, PTEN

+/- og PTEN

– /- mus prostata epitelceller med TRAIL i 48 timer og målt celleproliferation ved MTT-assays. Fig. 5A viser, at TRAIL-induceret ca. 32% vækstinhibering i PTEN

+ /+ -celler hvorimod TRAIL påvirkede ikke celleproliferation i PTEN

– /- celler, mens PTEN

+/- celler viste omkring 13% vækstinhibering efter TRAIL behandling. Desuden viste vi, at Akt aktiveres i PTEN

– /- celler, men ikke i PTEN

+ /+, mens minimal aktivering i PTEN

+/- celler. Vigtigere er det, TRAIL behandling forårsagede betydelig PARP spaltning i PTEN

+ /+ celler, moderat spaltning i PTEN

+/- celler og fuldstændigt fravær af spaltning i PTEN

– /- celler (. Figur 5B). Disse resultater antyder, PTEN er påkrævet for TRAIL-induceret apoptose i muse prostata epitelceller.

Mus prostata epitelceller med vildtype PTEN (PTEN

+ /+), PTEN knockout (PTEN

+/-

) og heterozygot (PTEN

– /-

) blev udpladet i plader med 96 brønde, og derefter behandlet med 100 ng /ml TRAIL i 48 timer. Celler proliferation blev bestemt ved MTT-assays og udtrykt som procentdel af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. *,

P

0,01, statistisk signifikans.

B

, effekt af PTEN tab på TRAIL-induceret apoptose. PTEN

+ /+, PTEN

+/-, og PTEN

– /- celler blev behandlet med 100 ng /ml TRAIL i 48 timer som beskrevet i (

A

). Totalt protein blev ekstraheret til analyse af total og phosphoryleret Akt (

s-AKT

), PTEN og PARP ved Western blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

C

, restaureret PTEN udtryk sensibiliserer PTEN

– /- celler til TRAIL. PTEN

– /- celler (5 x 10

5) smittet med adenovirus, der udtrykker vildtype PTEN (

Ad-PTEN vægt

) eller udtrykker LacZ (

Ad-lacZ

). Ved 72 timer efter infektion blev celler trypsineret og udpladet i 60 mm skål ved 5 × 10

5-celler. Den næste dag blev cellerne efterladt ubehandlet eller behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celler blev høstet for MTT-assays (

Overpanel

) og Western blot analyse blev anvendt til påvisning af niveauerne af PARP og PTEN proteiner (

nederste panel

), hhv. Celleproliferation data blev udtrykt som procent af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. **,

P

0,001, statistisk signifikans.

D,

hæmning af PTEN funktion ved en dominerende negativ form for PTEN giver TRAIL modstand. PTEN

+ /+ og PTEN

+/- celler blev inficeret med adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN i 72 timer og derefter behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celler blev enten anvendt til vækstinhibering ved MTT-assays (

øvre panel

) eller udtages til detektering af niveauerne af PARP, PTEN, og total og phosphoryleret Akt ved Western blot-analyse (nederste panel). Celleproliferation data blev udtrykt som procent af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. *,

P

0,01, statistisk signifikans. **,

P

0,001, statistisk signifikans

Siden PTEN

– /- celler er resistente over for TRAIL, vi spurgte, om restaurering af PTEN udtryk påvirker TRAIL følsomhed. i PTEN

– /- celler. PTEN

– /- celler blev inficeret med adenovirus, der udtrykker vildtype PTEN eller LacZ. Som vist i fig. 5C, PTEN ekspression blev gendannet i celler inficeret med adenovirus, der udtrykker PTEN men ikke i celler inficeret med adenovirus, der udtrykker LacZ. Vigtigt er det, vi var i stand til at vise, at genoprettelsen af ​​PTEN udtryk gør PTEN

– /- (. Figur 5C) celler er følsomme over for TRAIL-induceret apoptose og væksthæmning sådanne effekter ikke blev observeret i celler inficeret med kontrol virus. Da PTEN

+ /+ celler er følsomme over for TRAIL, vi spurgte, om hæmning af PTEN funktion påvirker TRAIL-induceret apoptose i PTEN

+ /+ celler. Til dette formål har vi inficerede PTEN

+ /+ og PTEN

+/- celler med adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN eller LacZ, og behandlede inficerede celler med TRAIL i 48 timer. Fig. 5D viser, at indførelsen af ​​dominant negativ form af PTEN øgede p-Akt niveau i PTEN

+ /+ celler. Vigtigere er det, indførelse af en dominative negativ form for PTEN gør PTEN

+ /+ og PTEN

+/- celler mere resistente over for TRAIL (fig. 5D). Overensstemmelse med den rolle af Akt inhibering apoptose, blev TRAIL inducerede PARP-spaltning faldet drastisk i PTEN

+ /+ og PTEN

+/- celler efter at de var inficeret med virus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN. Endvidere viste vi, at TRAIL-induceret vækstinhibering i PTEN

+ /+ celler inficeret med et adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN blev ca. 5%, men omkring 27% i de samme celler inficeret med kontrol adenovirus (Fig. 5D ). Vi viste også, at i PTEN

+/- celler inficeret med dominant negativ form af PTEN, celleproliferation var omkring 102% sammenlignet med de samme celler inficeret med kontrol vira i hvilke celleproliferation var ca. 81% ved TRAIL behandling (Fig . 5D, øverste panel).

rolle PTEN i TRAIL følsomhed i brystkræft T47D-celler

Da brystkræft T47D-celler med en vildtype PTEN var resistente over for TRAIL (fig. 1 ), spurgte vi, om modulation af PTEN funktion ville påvirke TRAIL følsomhed i T47D-celler. Til dette formål har vi inficerede T47D-celler med adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN eller bekæmpelse vira og derefter behandlet inficerede celler med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer, og virkningen af ​​denne behandling på TRAIL følsomhed blev bestemt. Fig. 6 viser, at celler inficeret med adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN udtrykke et højere niveau af p-Akt mens en sådan forhøjelse ikke blev observeret i celler inficeret med adenovirus, der udtrykker LacZ, hvilket antyder, at PTEN funktion blev inhiberet af en dominant negativ form af PTEN (fig. 6B). Overensstemmelse med den rolle af Akt inhibering apoptose, blev spaltet PARP signifikant reduceret i celler, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN sammenlignet med celler, der udtrykker kontrol vira (fig. 6B). Endvidere overekspression af en dominant negativ form af PTEN gør T47D-celler mere resistente over for TRAIL sammenlignet med de samme celler inficeret med vira, der udtrykker LacZ (fig. 6). Derfor er disse data antyder, at øget Akt aktivering på grund af inaktivering af PTEN kunne give TRAIL modstand i kræftceller.

En

, effekt af hæmning af PTEN funktionen på celleproliferation. T47D-celler (8 x 10

5) blev inficeret med adenovirus, der udtrykker en dominant negativ form af PTEN eller adenovira, der udtrykker LacZ i 72 timer og derefter behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assays. Celleproliferation data er udtrykt som procent af ubehandlede celler. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. *,

P

0,01, statistisk signifikans.

B

, effekt af hæmning af PTEN funktionen på apoptose. T47D-celler inficeret med adenovirus som beskrevet i A blev behandlet med TRAIL (100 ng /ml) i 48 timer og derefter høstet til analyse af niveauerne af PARP, PTEN, totalt og phosphorylerede Akt proteiner ved Western blot-analyse (

nedre panel

). β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Discussion

I denne undersøgelse viser vi, at TRAIL aktiverer Akt overlevelse vej hos TRAIL-resistente cancercellelinjer. Vi viser også, at den underliggende mekanisme kan skyldes tab af funktionel PTEN fordi PTEN knockout mus prostata epitelceller er resistente over for TRAIL mens celler med intakt PTEN er følsomme over for TRAIL. Gendannelse PTEN udtryk afsmeltet PTEN

– /- celler er følsomme over for TRAIL. Endvidere inaktivering af PTEN øger niveauet af TRAIL resistens i T47D-celler. Disse resultater antyder, at aktivering af Akt overlevelse pathway spiller en kritisk rolle i TRAIL modstand, og at Akt pathway er et potentielt terapeutisk mål at forbedre TRAIL-baseret terapi.

Aktiveringen af ​​Akt pathway har været impliceret i beskyttelse af celler af mange dødsfald stimuli, og dermed gav celleoverlevelse [10], [13]. Tidligere undersøgelser antydet, at overekspression af Akt og dens opstrøms regulator PI3K øget TRAIL modstand i bryst- og ovariecancer celler [23], [24]. Imidlertid er mekanismen bag dens modstand ikke fuldt klarlagt. I denne undersøgelse viste vi, at mens TRAIL inducerer apoptose i cancerceller, men også aktiverer flere overlevelse veje, som kan modvirke TRAIL-induceret apoptose, hvilket fører til resistens. I mange TRAIL resistent bryst- og æggestokkræft cellelinier, men ikke følsomme cellelinjer blev Akt pathway aktiveret (fig. 2), hvilket antyder, at aktiveringen af ​​Akt pathway kan være en fælles begivenhed i TRAIL resistente celler. I overensstemmelse med dette begreb, fandt vi, at hæmning af Akt aktivering med sin farmakologiske inhibitor LY294002 eller knockdown af dens udtryk af siRNA sensibiliserer TRAIL-resistente celler til TRAIL. Kollektivt disse data tyder på, at aktiveringen af ​​Akt overlevelse pathway spiller en kritisk rolle i TRAIL resistens i æggestokkene og brystcancerceller og antyde, at inhibering af dette overlevelse pathway kan overvinde TRAIL modstand.

Vi viste også, at inhibering af PI3K-aktivitet blokeret Akt aktivering i TRAIL resistente cellelinier. Da PI3K kan tjene som en opstrøms positiv regulator af Akt disse resultater tyder på, at øget Akt aktivering er i det mindste delvist gennem den forøgede aktivering af PI3K-aktivitet. På den nedstrøms niveau, er det velkendt, at Akt udøver sine biologiske funktioner ved phosphorylering dens downstream substrater herunder mTOR. Aktivering af mTOR kan øge proteintranslation, hvilket resulterer i celleoverlevelse [13]. I overensstemmelse med dette, fandt vi, at TRAIL behandling kan forårsage mTOR phosphorylering og efterfølgende aktivering. Vores data tyder på, at TRAIL kan aktivere PI3K /Akt /mTOR pathway at modvirke TRAIL-induceret apoptose, hvilket fører til TRAIL modstand.

I kræftceller, kan den Akt overlevelse pathway aktiveres af de flere mekanismer, herunder inaktivering af sin opstrøms negativ regulator PTEN. Ved at dephosphorylere og samtale PIP3 til PIP2, PTEN hæmmer Akt aktivering og efterfølgende sensibiliserer celler ihjel [10], [13]. I overensstemmelse med den rolle, PI3K /Akt pathway i TRAIL modstand, fandt vi, at tabet af PTEN i mus prostata epitelceller giver TRAIL modstand mens de samme celler med intakt PTEN er følsomme over for TRAIL mens PTEN

+/- celler viser mellemliggende modstand. Disse data antyder, at PTEN faktisk spiller en vigtig rolle i TRAIL følsomhed. Desuden viste vi, at genindførelse af en mutant form af PTEN i TRAIL resistente T47D-celler øger yderligere TRAIL modstand. Tilsammen indikerer disse data, at i TRAIL resistente celler, tab af PTEN bidrager til Trail modstand. Det er kendt, at nedsat eller tab af PTEN ekspression forekommer i mindst 50% af bryst- og ovariecancer [25]. Det er muligt, at TRAIL resistente bryst- og ovariecancer celler har nedsat niveau af PTEN, der har behov for yderligere undersøgelser. Endvidere en nylig undersøgelse viste, at overekspression af miR-221 222 nedregulerer PTEN, hvilket fører til øget aktivering af Akt og efterfølgende TRAIL modstand [26]. Derudover TRAIL resistent leukæmi celler udtrykte et højere niveau af phosphoryleret inaktiv form af PTEN, hvilket resulterede i en stigning i Akt aktivering og TRAIL resistens [27].