PLoS ONE: MR Imaging Biomarkører til Monitor Tidlig respons på hypoxi-Aktiveret Prodrug TH-302 i kræft i bugspytkirtlen Xenografts

Abstrakt

TH-302 er en hypoxi-aktiveret prodrug kendt for at aktivere selektivt under de hypoxiske forhold, der almindeligvis findes i solide tumorer. Det undersøges i øjeblikket i kliniske forsøg, herunder to forsøg i pancreas Ductal adenokarcinomer (PDAC). Den aktuelle undersøgelse blev gennemført for at evaluere billeddiagnostiske biomarkører for forudsigelse og svar overvågning af TH-302 effekt i xenograftmodeller af PDAC. Dynamisk kontrast-forstærket (DCE) og diffusion vægtede (DW) magnetisk resonans imaging (MRI) blev anvendt til at overvåge akutte effekter på tumorvaskulatur og cellularitet hhv. Tre humane PDAC xenotransplantater med kendte differentielle reaktioner på TH-302 blev afbildet før, og ved 24 timer og 48 timer efter en enkelt dosis af TH-302 eller køretøj for at bestemme om billeddannende ændringer varslede ændringer i tumorvolumener. DW-MRI blev udført ved fem b-værdier til at generere tilsyneladende diffusionskoefficient vand (ADC) kort. For DCE-MRI, en standard klinisk tilgængelig kontrast reagens, Gd-DTPA, blev anvendt til at bestemme blodgennemstrømningen i tumoren regionen af ​​interesse. TH-302 inducerede et dramatisk fald i DCE overførselskonstant (K

trans) inden for 48 timer efter behandling i de følsomme tumorer, Hs766t og Mia PaCa-2, hvorimod TH-302 havde ingen virkning på den perfusion opførsel af resistent SU .86.86 tumorer. Tumor cellularitet, estimeret ud fra ADC, blev signifikant øget 24 og 48 timer efter behandling i Hs766t, men blev ikke observeret i Mia PaCa-2 og SU.86.86 grupper. Især blev væksthæmning af Hs766t observeret umiddelbart (dag 3) efter påbegyndelse af behandling, men blev ikke observeret i MiaPaCa-2 tumorer indtil 8 dage efter initiering af behandling. Baseret på disse prækliniske resultater, er DCE-MRI foranstaltninger af vaskulær perfusion dynamik og ADC foranstaltninger af celledensitet foreslået som potentielle TH-302 respons biomarkører i kliniske forsøg

Henvisning:. Zhang X, Wojtkowiak JW, Martinez GV, Cornnell HH, Hart CP, Baker AF, et al. (2016) MR Imaging Biomarkører til Monitor Tidlig respons på hypoxi-Aktiveret Prodrug TH-302 i kræft i bugspytkirtlen Xenografter. PLoS ONE 11 (5): e0155289. doi: 10,1371 /journal.pone.0155289

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: Juni 11, 2014, Accepteret: April 27, 2016; Udgivet: May 26, 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret, og dens støtte Information filer er tilgængelige via Figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3179140)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af: US national Institutes of Health: R01CA125627, R01CA077575 og U54CA143970; www.nih.gov; finansieringen ovenfor blev anvendt i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data; Moffitt Cancer Center Mindre Husdyrs Imaging Laboratory, en CCSG finansieret kerne facilitet, CCSG Grant nummer: P30-CA76292; www.moffitt.org; finansieringen ovenfor blev anvendt for en del af små dyr billeddannelse. Threshold Pharmaceuticals ydet støtte i form af en løn for forfatter CPH, men havde ikke nogen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser.: Charles P. Hart er ansat af og en grossist af Threshold Pharmaceuticals. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

De fem-årige overlevelsesrate for pancreas adenocarcinom (PDAC) er mindre end 6%, og de fleste efterladte er patienter med en kirurgisk mulighed. [1-5] således størstedelen af ​​pancreascancer behandles systemisk med kemoterapi, generelt gemcitabine (GEM), i kombination med andre midler. Især har specifikke målrettede behandlinger og biologiske såsom cetuximab, trastuzamab eller bevacizumab vist ringe effekt mod PDAC. En regime kombinerer 5-fluorouracil, leucovorin, irinotecan og oxaliplatin (FOLFIRINOX) steg median samlet overlevelse (OS) til 11,1 måneder sammenlignet med 6,8 ​​måneder for GEM alene [6] For nylig nab-paclitaxel (ABI-007,. Nanopartikel-albumin -paclitaxel; Abraxane) har vist signifikant overlevelse fordel i kombination med GEM, og er under overvejelse til front-line status [7, 8] alligevel svar er stadig kun flygtigt og dermed er der behov for alternative behandlingsmetoder.. Et lovende avenue er at målrette kræft fænotype, såsom hypoksi, som ofte observeres i pancreascancer [9] Dette blev undersøgt i fase I /II (NCT01833546, NCT02047500). Forsøg med TH-302 i kombination med GEM, som er komplet og et fase III (NCT01746979) forsøg med TH-302 + GEM dublet er i gang. Endvidere et fase I /II dosiseskalerende prøveversion af TH-302 + GEM + Abraxane triplet kombination er for nylig blevet åbnet (NCT02047500).

Tumor hypoxi, karakteriseret ved reducerede iltkoncentrationer, er en væsentlig faktor drivende tumor fysiologi og modstand mod kræftbehandling. [10] den største forskel fra normalt væv er den uregelmæssige struktureret kar matrix fundet i solide tumorer. Mikrovaskulaturen er karakteriseret ved store åbninger i endotelet og fravær af glat muskulatur lag, hvilket fører til øget permeabilitet og Retention (EPR) af makromolekyler. Disse faktorer resulterer i en ubalanceret tilførsel af ilt og næringsstoffer. Dette forværrer spiring og ineffektiv vækst af nye kar, som fører til en reduceret tumor iltning. [11, 12] Selv om flere kræftformer vides at være hypoxisk, pancreascancer er kendt for at være dybt så [13] og intratumoral hypoxi er relateret til et dårligt resultat. [14-16] Dette kan skyldes de øgede niveauer af overlevelse faktor, HIF-1α [15-18], eller udvalg for mangler i apoptotiske maskiner. [17] Desuden effekten af ​​hypoxi kan ikke udelukkende er medieret af cancercellerne, men kan også indebære stroma. Kræft i bugspytkirtlen er karakteriseret ved overdreven desmoplastiske fibroblaster (stjerneformige celler), hvis migration, type I kollagen udtryk, og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) produktion er alle fremkaldt af hypoxi. [18] Grundlæggende hypoxi resultater fra en ubalance mellem ilttilførsel og efterspørgsel. Hypoksiske tumorceller regioner er generelt modstandsdygtig over for cytotoksisk kemoterapi. I del dette skyldes de direkte virkninger af hypoxi i opregulering celleoverlevelsesforløb men kan også skyldes regionale perfusion underskud, som resulterer i både hypoxi og sub-terapeutisk drug delivery. [14-16, 19, 20] Endvidere hypoxiske tumorceller tendens til at være hvilende, hvilket også fører til resistens over for terapier, der er målrettet til celledeling. [21] På grund af forholdet mellem hypoxi og dårlig respons, en opløsning hypoxi -relaterede cancer er ved at indføre hypoxi-aktiverede prolægemidler (Haps), som selektivt aktiveres under ekstrem hypoksi og levere højdosis kemoterapi i hypoksiske områder af tumoren med minimal skade på sundt væv.

overvægt af hypoxi i PDAC gør det til et attraktivt mål for HAPs [22], som er blevet udviklet som en familie af forbindelser i de seneste to årtier. [23] HAPs omdannes til en aktiv form i reducerede iltforhold, som de er designet til at gennemgå en -e

– eller 2-e

– bio-reduktioner, der er reversible ved tilstedeværelse af ilt. Disse kan være ikke-specifikt katalyseret af en række oxoreductases, såsom NADPH cytochrom P450-reduktase, POR, eller inducerbar nitrogenoxidsyntase, iNOS. [24] Den mest almindelige klasse af HAPs er baseret på 2-nitroimidazol, eksemplificeret ved TH- 302. TH-302 er en anden generation HAP, der i øjeblikket testes i 12 forskellige kliniske forsøg fra fase I-fase III. TH-302 udgivelser brom-isophosphoramide sennep (Br-IPM) under hypoxiske betingelser, overtalelse DNA alkylering og krydsbinding. Br-IPM kan også diffundere ind nærliggende iltede områder for at forhindre tumor progression via “tilskuer virkninger”. Både in vitro- og in vivo-forsøg har vist, at TH-302 selektivt aktiveres i tumoren hypoxiske regioner og er også til stede i det omgivende væv, men i mindre grad hos raske væv [25]. Prækliniske studier tyder på, at TH-302 har en betydelig anti-cancer effekt, når det kombineres med anti-angiogene terapier. [26]

Hypoxiske regioner er ofte kendetegnet ved meget uorganiseret, udvidede og snoede kar. [27] Denne kaotisk mønster kan skyldes ubalance af angiogene mediatorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og angiopoietiner. Stærkt permeable tumorkar kan påvirke cytokiner og angiogene faktorer, der dynamisk kan ændre strukturen af ​​mikrokarrør vægge. [28] akkumulerende beviser har allerede vist, at vaskulær permeabilitet sandsynligvis forhøjet i hypoksiske områder. [27] Således som bevismateriale og empirisk konkordans mellem permeabilitet fartøj og hypoxi er etableret. DCE-MRI bruger kinetisk modellering af injicerede kontrast reagenser til at karakterisere perfusion. [29] Det kan give oplysninger om flow, volumen, og vigtigst permeabiliteten af ​​skibe. Det er således egnet til at antage, at DCE-MRI kan være et nyttigt surrogat biomarkør for hypoxi. [30]

Diffusion-vægtet MRI (DW-MRI) registrerer relativt små ændringer i vævet struktur på celleniveau baseret på anvendelsen af ​​bevægelsesfølsomme gradienter, der kan spore bevægelsen af ​​vand protoner. Mange prækliniske studier har vist, at DW-MRI har enormt potentiale for overvågning tidlige ændringer i tumor cellularitet der kan vedrøre behandling respons. [31] Kombination af DCE og DW-MR kan give mere præcise oplysninger for tidlig diagnose og påvisning af tidlig terapeutisk respons . [32] Desuden er disse to billeddannende fremgangsmåder er let indsat i daglige klinik protokoller. Som sådan er det meget sandsynligt, at resultaterne af denne undersøgelse kunne let oversættes til yderligere klinik forsøg.

Tidligere undersøgelser har demonstreret xenotransplantattumorer afledt fra SU.86.86 human pankreatisk cancercellelinie er yderst vaskulariseret og vel- perfunderet forhold til tumorer afledt af Hs766t cellelinje. [33] således hypoxiske regioner observeret i Hs766t tumorer er større end dem, der observeres i SU.86.86, mens tumorer afledt af Mia PaCa-2-cellelinje er hypoxisk til en mellemlang niveau. Som hypoxi anses for at være en begrænsende faktor for TH-302-aktivitet, er det blevet eksperimentelt påvist, at Hs766t-afledte tumorer er meget følsomme over for TH-302, og at SU.86.86-afledte tumorer er meget modstandsdygtige, med Mia PaCa-2 exhibit . mellemliggende følsomhed [34] den foreliggende undersøgelse sammenlignede effekten af ​​TH-302 i disse bugspytkirtelkræft xenograftmodeller med målinger af tumor perfusion og cellularitet ved hjælp af to billeddiagnostiske metoder:. DW-MRI og DCE-MRI

Materialer og metoder

Celledyrkning

Su.86.86, Hs766t og Mia-PaCa2 celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). Alle cellelinier blev genoplivet fra lav passage med alle eksperimenter udført med celler af passage tal mindre end 15. Su.86.86 celler blev dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies) suppleret med 10% FBS (HyClone Laboratories). Hs766t og Mia-PaCa2 cellelinier blev dyrket i DMEM /F12 (Life Technologies) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin-opløsning (Sigma, St. Louis, MO). Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2.

Xenografter

Alle procedurer var i overensstemmelse med vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr Ressourcer (1996 ), National Research Council, og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, University of South Florida under den godkendte protokol R4033. Immunkompromitterede mus blev opstaldet i en ren facilitet med særlige vilkår, der omfatter HEPA filtreret ventilerede bure, autoklaveret strøelse, autoklaveres boliger, autoklaveret vand, bestrålet mad og særlige bur skiftende procedurer. Musene blev håndteret under aseptiske betingelser, herunder at bære handsker, kittel og sko,. Mus blev aflivet ved inhalation af CO

2 fra en tryktank i en mus kammer.

Kvinde SCID-mus i alderen 5-6 uger blev podet med SU.86.86, Hs766t eller Mia-PaCa2 celler (5×10

6) subkutant på venstre bagben. Tumorer fik lov til at vokse i et gennemsnit på tre uger til en gennemsnitlig størrelse på ~ 150 mm

3, som anslået ved hjælp af elektroniske skydelærer og tumorvolumener beregnet som π /6 [(korte akse i mm)

2 x ( lange akse i mm)]. Mus blev derefter randomiseret og anbragt i kohorter og behandlet med saltopløsning (kontrol) eller TH-302 (50 mg /kg) injiceret intraperitonealt. Mus blev afbildet som beskrevet i billeddannende metoder afsnittet magnetisk resonans. I alt 34 mus undergik MR billeddiagnostiske undersøgelser. Den SU.86.86 gruppe bestod af 5 TH-302 behandlede og 5 kontroldyr; Mia-PaCa2 bestod af 6 TH-302 behandlede og 5 kontroldyr; Hs766t bestod af 7 TH-302 behandlede og 6 kontroldyr. Ingen signifikant dyr vægttab blev observeret i dette studie. Dyr blev aflivet, når tumorerne nåede 2000 mm

3.

Imaging

Både DCE-MRI og DW-MRI blev udført 24 timer inden behandlingen (TH-302 eller vehikel), DW-MRI blev planlagt 24 timer og 48 timer efter behandling. For at sikre tilstrækkelig tid til kontrastmiddel udvaskning og fysiologisk opsving blev DCE-MR kun udføres 48 timer efter behandlingen. Alle MRI eksperimenter blev udført med en Varian 7 T MR-scanner udstyret med en maksimal gradient amplitude på 400 mT /m. Alle dyr blev bedøvet med inhaleret isofluran (1,5% i O2) ved 2,0 LPM og kanyle ved halevenen. En tryk-transducer ballon tapede til dyrets brystkasse blev brugt til løbende at overvåge dens respiration sats. De kropstemperatur blev konstant overvåget ved hjælp af en rektal fluoroptic termometer (Sall

®, SA Instruments, Stony Brook, NY). En ekstern varmelegeme blev anvendt til at opretholde kroppens temperatur på 37,0 ± 0,2 ° C og respirationsfrekvens blev overvåget på en afstand af 60-90 vejrtrækninger pre minut i løbet af de billeddannende eksperimenter. Dyret blev forsigtigt fastgjort i en plastholder og fyldt i en 35-mm-ID små dyr imaging Litz spole (Doty Scientific, Columbia, SC, USA). MR session for både DCE- og DW-MR-scanning var omtrentlige 1,5 timer; 0,5 timer for DW-MR kun punkt.

DCE-MRI protokol omfatter T

2-vægtede billeder for anatomiske visning af tumor, parametriske kort over endogent T

1 relaksationstid og en række T

1-vægtede billeder, som spor den dynamiske ændring af kontrastmiddel, herunder AIF og vask-in og -out inden tumor site. T

2-vægtede billeder blev erhvervet ved hjælp af en hurtig spin-ekko (FSE) puls sekvens med et ekko faktor 4, hvilket giver en effektiv TE 72 ms. Mætning recovery fremgangsmåde til T

1 kortlægning med fem forskellige restitutionstid (TR) -værdier blev erhvervet før injektion af kontrastmidlet (TR = 5000, 2000, 800, 300, 150 ms, TE = 7,2 ms, FOV = 35 x 70 mm, matrix = 128 x 256, rumlig opløsning = 273 x 273 um). Ni 1-mm-tykke koronale skiver blev orienteret over tumoren og arterie for at sikre en gyldig arteriel input funktion (AIF). Dyret blev stramt sikret med tape for at undgå bevægelsesartefakter. Før, under og efter bolus administration af en enkelt dosis af CA (0,15 mmol /kg Gd-DTPA), en dynamisk serie af spin-ekko T

1-vægtede billeder (TR = 150 ms, TE = 7,2 ms) blev erhvervet for 35 minutter. DCE-MRI-data blev bearbejdet ved anvendelse af en generel kinetisk model som beskrevet af Tofts et al. En fuldstændig beskrivelse af disse metoder er tidligere blevet beskrevet. [29, 35]

DW-MRI blev udført for at måle de kvantitative ADC værdier med samme geometri som DCE-MRI. Sekvensdata parametre omfatter fem b-værdier: 12, 50, 500, 800, 1500 s /mm

2 med TR = 1500 ms og TE = 35; Seks gennemsnit blev brugt til at reducere bevægelsesartefakter. ADC kort blev genereret af en hjemmelavet Matlab program, der passer b-værdier til Stejskal-Tanner ligningen, S = S

0 * EXP (-b * ADC), hvor S

0 er signalamplituden uden diffusion vægtning og S er det signal amplitude med diffusion vægtning.

Regioner af interesse (ROIs) blev bestemt ved T

2w billeder med nøjagtig samme geometri DCE- og DW-MRI erhvervelse. Disse ROI’er blev overlejret på DCE- og DW-MRI-data for at minimere variationen af ​​antropisk faktor. Distribution histogrammer blev opnået for hver tumor ROI’er af DCE- eller DW-MRI. Data er præsenteret som gennemsnit og standardfejlen. Students t test, blev ANOVA anvendes hvor passende. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Immunhistokemi

Efter gennemførelsen af ​​terapeutiske og MRI imaging protokoller, pimonidazole hydrochlorid. (60 mg /kg, Hypoxyprobe Inc.) blev injiceret I.P. en time før tumorfjernelse, efterfølgende fikseret i 10% formalin, indlejret i paraffin, og yderligere forarbejdet til immunohistokemi. Tumor tværsnit blev farvet med et kanin primært antistof mod gamma-H2AX (Novus Biologicals, Littleton, CO) og Ventana OmniMap anti-kanin sekundært antistof (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Pimonidazole positive væv blev påvist under anvendelse af kanin antisera mod pimonidazole hydrochlorid (2627; Hypoxyprobe Inc.). Den anvendte detektionssystem var Ventana ChromoMap Kit. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin eosin og scannes ved hjælp af Aperio ScanScope XT.

Resultater

De kinetiske parametre for DCE-MRI at kvantificere tumor perfusion blev estimeret på en pixel-wise grundlag ved at anvende Tofts modellen som beskrevet i [ ,,,0],35]. Repræsentative K

trans kort for hver tumortype er vist i fig 1. Tumor ROIs (regioner af interesse) blev identificeret med T

2-vægtede billeder på alle skiver og anvendt til at afgrænse pixels for histogram-analyser. Som det fremgår af de histogrammer, K

trans genereret fra repræsentative Hs766t og Mia-PaCa-2 tumorer var faldet drastisk 48 timer efter TH-302 behandling, i forhold til før behandlingen værdier. Der var ingen væsentlige ændringer observeret for et SU.86.86 tumorer på samme tidspunkt (Fig 1). Selvom en person i SU.86.86 gruppe havde et signifikant fald efter TH-302 behandling (48 h), de gennemsnitlige ændringer mellem sammenligningsgrupper var ikke statistisk signifikante. Time-kurser af normaliserede gennemsnitlige K

trans værdier er vist i figur 2 (a). Middelværdierne for normaliseret K

trans faldt 69,2% for TH-302-behandlede mus i Hs766t tumorer, faldt 46,1% for Mia PaCa-2 tumorer og steg 4,9% i SU.86.86 tumorer. Begge ændringer for Hs766t og Mia PaCa-2 behandlingsgrupper var statistisk signifikant (

P

0,01) sammenlignet med deres egen kontrolgruppe. I modsætning hertil middelværdien stigning for SU.86.86 gruppe var ikke statistisk signifikant (

P

= 0,15). Disse ændringer i vaskulær perfusion korreleret med hver cellelinjer terapeutisk respons på TH-302 [36].

Som vist i histogrammet, K

trans genereret fra HS766t og Mia-PaCa-2 tumorer blev dramatisk reduceret 48 timer efter TH-302 behandling sammenlignet med før behandling værdier. Der var ingen væsentlige ændringer observeret for en SU.86.86 musen på samme tidspunkt.

A) Tid-kurser af normaliserede gennemsnitlige K

trans værdier. Middelværdierne for normaliseret K

trans faldt 69% for TH-302 behandlede mus i Hs766t tumorer, faldt 46% for Mia PaCa-2 tumorer og steg 5% i SU.86.86 tumorer. B) ændringer i normaliserede middelværdier tumor ADC-værdier over tid. En væsentlig forøgelse i de relative gennemsnitlige ADCs blev observeret for TH-302 behandlede gruppe ved post 24 og 48 timer (29% stigende til 24 timer, p 0,01; 17% forøgelse i 48 timer, p 0,01). MIA PaCa-2 er ikke statistisk signifikant forskellige mellem foretaget grupper (8% forøgelse i 24 timer,

P

0,05; 4% forøgelse i 48 timer, p 0,05). For SU.86.86 blev ingen signifikant ændring opdaget af DW-MRI for både TH-302 og kontrolgruppen (3% faldende til 24 timer, p 0,05; 0,5% stigende for 48 timer, p 0,05). Normaliseringen blev beregnet ved gennemsnittet af forskellen mellem før og efter behandling i Th302 gruppen i forhold til gennemsnittet af forskellen mellem før og efter behandling i kontrolgruppen. Fejlsøjler står for standardafvigelse.

DW-MRI blev anvendt til at kvantificere cellularitet, og blev også anvendt til at detektere reaktionen af ​​alle tre tumorxenografter til TH-302. Seks gennemsnit af DW-opkøb blev anvendt i denne undersøgelse for at reducere risikoen for bevægelse artefakt. ADC kort fra repræsentative dyr på forskellige tidspunkter af præ- og post-behandling er vist i figur 3. Som med DCE-data blev T2 billeder anvendes til at afgrænse tumor ROI, og afgrænset pixels derefter bruges til at generere histogrammer. Ændringer i normaliserede middelværdier tumor ADC-værdier over tid er vist i figur 2 (b). En betydelig stigning i de relative gennemsnitlige ADCs blev observeret for de TH-302 behandlede Hs766t tumorer på 24 timer og 48 timer efter behandling (29% stigning for 24 timer, p 0,01; 17% stigning i 48 timer, p 0,01). For SU.86.86 blev ingen signifikante ændringer opdaget af DW-MRI for både TH-302 og kontrolgrupper (3% fald i 24 timer, p 0,05; 0,5% stigning i 48 timer, p 0,05). Selv om det viste sig, at der var en stigning i ADC af MiaPaCa-2 ved 24 timer i forhold til køretøjets undergruppe (8%, P 0,05), disse ændringer var ikke statistisk signifikant forskellig fra vehikelkontroller

A dramatisk. øget ADC’er observeret i HS766T, men ikke i de andre to tumortyper.

statistisk signifikante ændringer i K

trans blev observeret i Hs766t og Mia Paca-22 tumorer behandlet med TH-302 for 48 timer efter behandling, bestemt ved DCE-MRI. K

trans forblev uændret i SU.86.86 tumorer (Fig 1). Det aktive effektor af TH-302 er en DNA tværbindingsmiddel tidligere vist at øge den nukleare γ-H2AX, en nøgle biomarkør for DNA skade responset pathways, in vivo efter så lidt som 6 timer efter TH-302 terapi i pancreas tumormodeller [ ,,,0],37], der indebærer tidlige ændringer i vaskulær permeabilitet observeret i denne undersøgelse, kan være en konsekvens af TH-302 cytotoksicitet. For at tegne en sammenhæng mellem permeabilitet ændringer og TH-302-aktivitet, tumor tværsnit fra alle tre tumor grupper blev immunhistokemisk evalueret for γ H2AX udtryk (figur 4A). Nuklear γ -H2AX blev forøget i TH-302 behandlede Hs766t og Mia PaCa-2-tumorer i sammenligning med saltopløsning kontrol. blev ikke observeret nogen påviselig ændring i γ-H2AX farvning mellem Su.86.86-behandlede og saltvandsbehandlede tumorer. Den vigtigste faktor for TH-302 aktivering og effektivitet er tumor hypoxi. Immunhistokemisk påvisning af Pimonidazole, en markør for fysisk hypoxi, viste større farvning i TH-302 følsom Hs776t og Mia PaCa-2 tumorer sammenlignet med TH-302 resistente SU.86.86 tumorer (Fig 4B) støtte γ-H2AX ekspressionsmønstre efter TH-302 behandling. Disse data understøtter tidlige ændringer i Hs766t og Mia PaCa-2 tumor perfusion på 48 timer kunne muligvis skyldes de cytotoksiske virkninger af TH-302.

(A) Histologisk farvning af γ-H2AX, en markør for DNA skader reaktionsmekanismer, i PDAC tumorer præ- og 48hr post-TH-302 behandling (50 mg /kg). Angivelse af γ -H2AX blev øget i TH-302 behandlede Hs766t og Mia PaCa-2 tumorer i forhold til saltvand kontrol. blev ikke observeret nogen påviselig ændring i γ-H2AX farvning mellem Su.86.86 behandlet og saltholdige tumorer. (B) Pimonidazole farvning som biomarkør for fysisk tumor hypoxi. Pimonidazole hydrochlorid blev injiceret 2hr før tumorfjernelse. Omfanget af hypoxi var størst i Hs766t tumorer og mindst i SU.86.86 med Mia PaCa-2 tumorer moderat hypoksisk. Disse billeder er repræsentative billeder af hver tumortype. Scale barer = 200 uM.

Diskussion

Effekten af ​​TH-302 er påvirket af flere faktorer, såsom karåbenhed og graden af ​​iltsvind i en given region. [38] Have evnen til at måle ændringer i disse parametre over tid som respons på aktiverede TH-302, er kritisk. Sådanne ændringer kan anvendes til at evaluere terapeutisk respons. Nuværende ikke-billeddannelse eller invasive metoder er begrænset til in vitro brug, mens imaging biomarkører kan give kvantitative målinger af tumor progression eller regression, uden væsentlig ændring af det mikromiljø. De to MR modaliteter anvendt i denne undersøgelse, kan DCE-MRI og DW-MRI, både separat opfylde disse krav baseret på observerbare parametriske kort, der giver oplysninger om vaskulatur og cellularitet hhv. Endvidere er de fleste tumorer kendt for at være heterogent, og især så i bugspytkirtelkræft. Det er derfor af stor interesse, at geografisk information kan kvantitativt vurderes pixel-for-pixel basis. [39] Tumor hypoxi er den stærkeste indikator for tumor respons på HAPs og kan måles i patienter ved hjælp af PET billeddannelse af 18F-mærket 2 -nitroimidazole sporstoffer (F-miso, FAZA, HX4). Men PET hypoxi billeddannelse er stadig på forsøgsstadiet. I modsætning hertil kan MR foranstaltninger af perfusion-diffusion misforhold kvantitativt relateret til hypoxi. [24]

Denne undersøgelse blev fokuseret på at identificere og sammenligne MR imaging biomarkører til detektering tidlig reaktion på TH-302 terapi følsomme og resistente PDAC tumormodeller. Forud arbejde fra vores gruppe havde vist, at MiaPaCa-2 tumorer reagerede på TH-302 med en svag, men signifikant, fald i K

trans, uden effekt på ADC [30]. Disse resultater blev bekræftet her. Resultater fra DCE-MRI viste et klart fald i K

trans i både Hs766t og Mia PaCa-2 modeller, som er betydeligt mere hypoxisk, i forhold til SU.86.86 tumorer, som ikke responderede på TH-302 med en ændring i volumen eller en ændring i K

trans. I overensstemmelse med tidligere arbejde, blev Hs766t bekræftet af pimonidazole immunhistokemi (Fig 4) at have den største hypoxisk fraktionen blandt disse tre modeller; Mia PaCa-2 var intermediært hypoxisk og SU.86.86 har minimal hypoxi forhold til de to andre. [40] Så reduktion af permeabilitet kan være en følge af TH-302-aktivering under de lavt iltindhold resulterer i hæmning af VEGF-signalering. Dette er det modsatte som set i ikke-hypoksiske tumorvæv. Graden af ​​permeabilitet ændringer kan direkte relateres til graden af ​​hypoxisk region. Dette resultat bekræfter tidligere resultater indikerer, at TH-302 er mest effektiv i hypoxiske tumorer [36]

De to MR imaging metoder anvendt i denne undersøgelse er grundlæggende forskellige:. Kinetiske parametre evalueret fra DCE-MRI evaluere vaskulatur ændringer, mens ADC-værdier monteret af DW-MRI afspejler ændringer celle tæthed. Den DCE-MRI afspejler permeabilitet (eller flow) ændringer, som kan skyldes cytotoksiske virkninger på hypoxiske tumorceller og reduceret VEGF produktion ved aktivering af TH-302, mens DW-MRI er en indirekte måling af de cellulære konsekvenser, der formentlig opstå efter vaskulaturen ændring. [30] Interessant observerede vi, at ADC ændring var kun signifikant i de mest følsomme Hs766t tumorer, men ikke i de to andre modeller. Den manglende ændring i ADC i SU.86.86 er konsistent med den manglende effekt af TH-302 på tumorvækst, og den relative mangel på hypoksi i denne model. Interessant Mia PaCa-2 også viste ikke en diffusion respons på TH-302, til trods for at tumorvækst blev inhiberet. Dette var i overensstemmelse med tidligere observationer ved hjælp af denne tumor linje. [30] Især effekten af ​​TH-302 terapi på MiaPaCa-2 tumorvækst var ikke synlige indtil dag 8 i behandling, mens effekten på Hs766t var øjeblikkelig. Derfor kan ændringen i ADC kunne varsle tumor volumen forandringer, der sker en dag eller to senere, men ikke ændrer 6 dage senere.

Udvælgelsen af ​​en arteriel input funktion (AIF) direkte påvirker de kinetiske parametre genereres af Tofts model. Faktorer for AIF estimering kan fremkalde fejl, herunder partielle volumen effekter, lav tidsmæssig og rumlig opløsning, lav kontrast til støjforhold (CNR) og i mange DCE-MRI tilfælde, et dårligt valg af større arterier inden for visning og bevægelsesartefakter. I denne undersøgelse direkte måling af arterielt blod var en udfordring, da den respiratoriske bevægelse under erhvervelse MR. Selvom motion artefakter og lav SNR kan reduceres ved at anvende en tidsmæssig spline-fit funktion og en rumlig Gaussisk kerne at udjævne data om pixel-wise analyser, udvælgelse af AIF ROI spiller en stor rolle for de endelige resultater, som omtalt i [ ,,,0],35]. Dette har været den mest almindelige problem, der påvirker reproducerbarheden af ​​DCE-MRI, således stort fejllinje observeret i DCE-MRI resultater. På trods af disse begrænsninger, DCE-MRI var i stand til at skelne forskelle i TH-302 svar, blandt de tre tumortyper, på en måde, der var i overensstemmelse med histologiske fund.

tumorvaskulatur er stadigt skiftende dels som reaktion på høj tumor VEGF koncentrationer forårsager aberrerende neo-vaskularisering [41] og fastfase stress resulterer i kompression af skrøbelige vaskulatur [42], som begge bidrager til nedsat blodgennemstrømning. I denne undersøgelse målte vi tidlige ændringer i tumor perfusion efter TH-302 behandling. For at eliminere den mulighed, at ændringer i tumor perfusion efter TH-302 er et resultat af den normale dynamiske natur tumorvaskulatur, blev tumor tværsnit histologisk farvet for nuklear γ -H2AX, et protein involveret i DNA skade responset pathways [43], en måling af TH-302 cytotoksicitet. Som forventet, TH-302 følsomme tumorer, Hs766t og Mia PaCa-2, præsenteret med øget nuklear γ -H2AX forhold til at kontrollere tumorer. Ingen signifikant ændring i tumor perfusion eller nuklear γ -H2AX blev observeret i SU.86.86 tumorer, TH-302 resistent. Disse data støtter en omlægning af tumor perfusion målt ved DCE-MRI kan anvendes som en tidlig-respons biomarkør for TH-302 behandling.

Som konklusion vores studier tyder på, at ændringer i tumor perfusion målt ved DCE-MRI kan have potentiale som en tidlig biomarkør for TH-302 farmakodynamik og at DW MRI er en potentiel biomarkør for eventuel tumor volumen respons.