PLoS ONE: Mutationer af C-reaktivt protein (CRP) -286 SNP, APC og p53 i kolorektal cancer: konsekvenser for en CRP-Wnt krydstale

Abstrakt

C-reaktivt protein (CRP) er en etableret markør for inflammation med mønster-genkendelse receptor-lignende aktiviteter. På trods af den tætte associering serum niveau af CRP med risiko og prognose for flere former for kræft, er det stadig undvigende, om CRP bidrager direkte til tumorigenese eller blot repræsenterer en tilskuer markør. Vi har for nylig identificeret tilbagevendende mutationer på SNP position -286 (rs3091244) i promotoren for

CRP

gen i flere tumortyper, i stedet tyder på, at lokalt produceret CRP er en potentiel drivkraft for tumorigenese. Men det er uvist, om det -286 site er den eneste SNP stilling

CRP

gen målrettet til mutation og om der er nogen sammenhæng mellem

CRP

SNP mutationer og andre hyppigt muterede gener i tumorer . Heri har vi gennemgået de genotyper af tre fælles

CRP

ikke-kodning SNP’er (rs7553007, rs1205, rs3093077) i tumor /normal prøve par 5 cancertyper (n = 141). Ingen tilbagevendende somatiske mutationer findes på disse SNP positioner, hvilket indikerer, at de -286 SNP mutationer fortrinsvis vælges under udviklingen af ​​kræft. Yderligere analyser viser, at de -286 SNP mutationer af

CRP

tendens til at co-forekomme med muteret

APC

især i endetarmskræft (

s

= 0,04, n = 67) . Derimod mutationer af

CRP

p53

eller

K-ras

synes at være uafhængige. Der resultater således understrege funktionelle betydning af -286 mutation af

CRP

i tumorigenese og indebærer et samspil mellem CRP og Wnt signalvejen

Henvisning:. Su HX, Zhou HH, Wang MY, Cheng, J., Zhang SC, Hui F, et al. (2014) Mutationer af

C-reaktivt protein

(

CRP

) -286 SNP,

APC

og

p53

i kolorektal cancer: Betydning for en CRP-Wnt Crosstalk. PLoS ONE 9 (7): e102418. doi: 10,1371 /journal.pone.0102418

Redaktør: Qing Song, Morehouse School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 5, 2014 Accepteret: 18 juni 2014 Udgivet: 15 jul 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina [tilskud nummer 2011CB910500]; National Natural Science Foundation of China [tilskud numrene 30930024, 31222015, 31270813, 31170696] Undervisningsministeriet Kina [tilskud numre PCSIRT: IRT1137, 121.108]; Gansu-provinsen [tilskud nummer: 1011FKCA089]; og Lanzhou University [tilskud numre: lzujbky-2013-bt05, lzujbky-2014-86]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inflammation er afgørende for udviklingen af ​​cancer [1], [2]. Som en stor menneskelig akutte fase reaktant, er C-reaktivt protein (CRP) i vid udstrækning anvendes som en ikke-specifik markør for inflammation [3], [4]. Men akkumulere beviser har afsløret en tæt forbindelse mellem serum niveau af CRP og risikoen og prognose af kræft [5]. I betragtning af de formodede funktioner CRP i vært forsvar og medfødte immunitet [6], [7], er det sandsynligt, at CRP kan spille en direkte rolle i tumorigenese. Faktisk CRP er blevet rapporteret at forhindre apoptose af myelomceller [8] og lette invasivitet af brystcancerceller [9]. Desuden kan CRP bidrage til etablering af et gunstigt tumor mikromiljø ved at fremme angiogenese [10], ved at hæmme den destruktive aktivering af komplement [11], [12], og ved at inducere proinflammatoriske cytokiner fra immune og endotelceller [3], [ ,,,0],13], [14].

på den anden side har single nucleotide (SNP’er), som forbinder med genetisk forhøjede koncentrationer af CRP ikke give en forøget kræftrisiko til den almindelige befolkning [15]. Dette antyder, at cirkulerende CRP ikke er kausalt involveret i tumorigenese. Interessant nok i modsætning til de førnævnte pro-cancer aktiviteter, tidlige undersøgelser har også dokumenteret anti-cancer handlinger CRP ved aktivering af makrofag /monocyt [16] – [18]. Derfor har det været vanskeligt at definere, om CRP er udelukkende en passiv markør eller en aktiv spiller i kræft, eller at dissekere den præcise bidrag CRP i tumorigenese

Serum CRP er produceret af hepatocytter i leveren.; imidlertid, akkumulering beviser viser også en lokal produktion af CRP af ekstra-hepatiske celler [3], [19]. Interessant nok har vi for nylig fundet, at promotoren for

CRP

er specifikt muteret ved SNP position (rs3091244) 286 bp opstrøms transkriptionsstartsitet i 109 ud af 453 tumorprøver, men ikke i de matchede normale kontroller [19 ]. Disse mutationer er forbundet med øget lokal

CRP

induktion i tumorer sandsynligvis via afbrydelse af det konserverede CpG methylering motiv. Desuden er de fleste af de typer kræft undersøgte havnen i -286 mutation og den del af den muterede allel er høj (0,487, 95% CI: 0,477-0,517). Disse fund støtter således den rolle CRP produceret

in situ

som en potentiel kræft driver, der sandsynligvis er involveret i generelle mekanismer begunstige tumorigenese [19].

Udover -286 SNP, er der flere yderligere fælles ikke-kodning SNPs, der væsentligt påvirker baseline niveauer af serum CRP. Repræsentanterne inkluderer rs7553007, rs1205 og rs3093077 [15], [20], [21]. Det er derfor af interesse, om disse SNP sites også er målrettet til mutation i tumorer. Vi viser her ved genotypning af 141 tumor /normal prøvepar at ingen tilbagevendende mutationer opstår på 3

CRP

SNP sites, hvilket understreger, at de -286 mutationer er meget specifikke for tumorigenese. Vi også undersøgt, om der er nogen sammenhæng mellem de -286 mutationer af

CRP

andre hyppigt muterede gener i tumorer. Den identificerede forbindelse mellem -286 og

APC

mutationer indebærer en vekselvirkning af CRP med Wnt signalering.

Materialer og metoder

Frosne tumor /normal vævsprøve par blev opnået fra vævet bred af Gansu Provincial Tumor Hospital. Genomisk DNA blev isoleret fra væv eller blodprøver ved hjælp DNAiso Reagent eller Blood Genome DNA Extraction Kit (Takara) ifølge producentens instruktioner. Til identifikation af genmutationer, blev genomisk DNA forstærket med specifikke primere (menneske

CRP

: fremad: 5′-AGGGGGGAGGGATAGCATTAGAA-3 ‘; omvendt: 5′-CGTCCTGCTGCCAGTGATACAAG-3’; menneske

p53

: fremad: 5′-CTGTCCCTTCCCAGAAAACCT-3 ‘; omvendt: 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTC-3’; menneske

APC

: fremad: 5′-TAATACCCTGCAAATAGCAGAAATA-3 ‘; omvendt: 5’-GTGGCAAAATGTAATAAAGTATCAG-3 «menneskelige

K-ras

: fremad: 5′-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA-3 ‘; omvendt: 5′-CAACACCCTGTCTTGTCTT-3’), efterfulgt af sekventering. Genotypebestemmelse af 24 SNP’er (rs7553007, rs1205, rs3093077, rs4073, rs1143627, rs720816, rs723504, rs1876054, rs746961, rs2371923, rs487616, rs953183, rs400328, rs950487, rs759394, rs726402, rs1568645, rs929689, rs2254896, rs1951096, rs1843026, rs1543193, rs718015 , rs16091) blev udført af massespektrometri-baseret Sequenom tjeneste (Genergi Biotechnology, Shanghai, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienterne. Alle patienter er kinesiske. Undersøgelsen blev godkendt af Etik Komité Gansu Provincial Tumor Hospital.

Resultater

Ingen tilbagevendende somatiske mutationer forekommer på tre fælles

CRP

SNP steder i tumorer

for at se, om andre ikke-kodende SNP steder af

CRP

er muterede i tumorer, vi bestemt genotyperne af 3

CRP

fælles SNPs (rs7553007, rs1205, og rs3093077) sammen med 21 yderligere SNPs i 141 tumor /normal prøve par 5 kræftformer,

dvs

gastrisk, lunge-, spiserør, tyktarm og rektal kræft. Hyppigheden af ​​alleler, der er forbundet med lavere CRP niveauer er 48,9% for A allel af rs7553007, 47,9% for T-allelen af ​​rs1205, og 79,1% for T allel af rs3093077 i normale prøver (tabel 1), hvilket giver et tilstrækkeligt stikprøvestørrelser til påvisning af tilbagevendende mutationer. Derfor har vi kun identificeret 1 tilfælde af G En mutation ved rs7553007, 0 tilfælde af mutation på rs1205, og 2 tilfælde af G T mutationer ved rs3093077 i de matchede tumorprøver. Sådan en lav forekomst af somatisk mutation blev også fundet i 21 andre undersøgte ikke-kodende SNP sites fordelt på 9 forskellige kromosomer (figur 1). Disse viser, at i modsætning til de meget tilbagevendende

CRP

-286 SNP (rs3091244) mutationer [19], den 3

CRP

SNP sites analyserede heri kun tilfældigt muteret i tumorer på baggrunden mutation frekvens.

3

CRP

SNP’er (rs7553007, rs1205, og rs3093077) og 21 yderligere SNPs af 141 tumor /normal prøve par blev genotypet af Sequenom. Disse prøver blev indsamlet fra 37 gastrisk, 12 lunge, 27 esophagus, 24 colon og 41 rektale kræftpatienter. (A) De mutation frekvenser på hver SNP sites. Ingen af ​​disse steder er gentagne muteret i tumorer. Frekvensen af ​​den

CRP

-286 SNP (rs3091244) mutation i disse prøver er vist til sammenligning. (B) De poolede mutation frekvenser af SNPs med eller uden gener. Gen-associeret SNP sites tendens til at udvise lavere mutationsfrekvenser omend uden at nå statistisk signifikans (to prøve

t

test, to-halet,

s

= 0,47).

Ifølge genotypebestemmelse resultater mutationen frekvenser af SNP sites med og uden associerede gener er 0,97% (95% CI: 0,35-1,59%) og 1,30% (95% CI: 0,78-1,82%), henholdsvis . Selvom det ikke er statistisk signifikant, dette tyder på, at gen-associeret SNP sites tendens til at være mindre tilbøjelige til tilfældig mutation end dem med ukendt forening, muligvis på grund af begrænsninger, der begrænser skader på genomisk loci med funktionel betydning. Af genet-associerede SNP’er, rs1143627 og rs4073 er ​​to promotorsekvenser SNPs at finde på 31 og 199 bp opstrøms for transcription start sites af

IL-1β

IL-8

hhv. Deres lave mutation frekvenser (0,7-1,4%) hævder, at promotor lokalisering

per se

er ikke sandsynligt årsagen til somatisk hypermutation på

CRP

-286 SNP-site i tumorer; snarere ville den høje forekomst af -286 mutationen være resultatet af funktionelle konsekvenser i forbindelse med den forbedrede induktion af

CRP

, som kan bibringe værtscellekloner tilstrækkelig fordel at overleve og ekspandere i udviklingen af ​​cancer.

CRP

-286 SNP mutation er forbundet med muteret

APC

i endetarmskræft

CRP

-286 SNP mutation er mest fremherskende i tyktarmskræft [19], hvor

p53

,

K-ras

og

APC

er blandt de hyppigst muterede gener, der fremmer tumorigenese via distinkte mekanismer [22 ] – [24]. Vi ønskede således at undersøge, om der er nogen sammenhæng mellem disse mutationsbegivenheder. Muteret

p53

,

K-ras

og

APC

blev identificeret ved sekventering af deres respektive hotspot mutation regioner,

dvs

301-1044 af

p53

, 24-442 af

K-ras

, og fra 3922 til 4453 af

APC

i cDNA-sekvens spænder ifølge statistikkerne fra COSMIC database. På trods af deres høje forekomster (ca. 50%),

CRP-

286 SNP mutation viser ingen tilsyneladende sammenhæng med muteret

p53

(n = 35; tabel 2 og figur 2A.) Eller

K-ras

(n = 35; tabel 3 og figur 2B.). Den manglende sammenhæng mellem

p53

og

CRP

-286 SNP mutationer blev også bekræftet i spiserøret kræft (n = 36;. Tabel 4 og figur 2C), hvor

p53

repræsenterer den hyppigst muterede gen.

CRP

-286 SNP mutationer viser ingen sammenhæng med muteret

p53

eller

K-ras

i colon (AB) eller spiserøret kræft (c) (Fishers eksakte test, to-halet). Hvert rektangel repræsenterer en tumor prøve med grå farve angiver vildtype status. De søjlediagrammer til højre viser de procentdele af patienterne bærer de angivne mutationer i to patientgrupper med eller uden CRP-286 mutationer. Vejviser

I modsætning hertil en to fold berigelse af mutant

APC

blev observeret i kolon tumorer med den samtidige

CRP

-286 SNP mutationer (n = 38, tabel 5 og figur 3A). Men sådan sammenhæng ikke nå den statistiske signifikans formentlig på grund af den begrænsede stikprøvestørrelse, at vi kunne opnå. Vi således undersøgt yderligere 67 tumor /normal prøve par af rektal cancer (tabel 6 og figur 3B), som er meget lig tyktarmskræft i både celletypen oprindelse og genomiske forandringer [25] viser høj forekomst af både

APC

[25] og

CRP

-286 SNP-mutationer [19]. Faktisk samtidig forekomst af disse to mutationer i dette prøvesæt blev mere tydelig (odds ratio: 5,56, 95% CI: 1,17-26,36) og signifikant (

s

= 0,04). Disse resultater tyder således at CRP og APC kan samarbejde om overlappende veje under udviklingen af ​​tyktarmskræft.

CRP

-286 SNP-mutationer tendens til at co-forekomme med

APC

mutationer i colon (A) (Fishers eksakte test, to-halet,

s

= 0,47) og rektale cancere (B) (Fishers eksakte test, to-halet,

s

= 0,04 ). Hvert rektangel repræsenterer en tumor prøve med grå farve angiver vildtype status. De søjlediagrammer til højre angiver procentdele af patienterne bærer APC-mutationer i to patientgrupper med eller uden CRP-286 mutationer. Vejviser

Diskussion

in vitro

aktiviteter CRP [3], [4], [6], [11], [13], [14], herunder anerkendelse af endogene eller eksogene faresignaler, regulering af komplement aktivering, induktion af proinflammatoriske cellereaktioner, fører til tanken om, at CRP kan fungere som et opløseligt mønstergenkendelse receptor i den medfødte immunitet og værtsforsvar [6], [7]. Men manglen på konsekvente støtte fra forskning i dyremodeller [26] – [34], mennesker [35], [36] og genetisk epidemiologi [15], [20], [21], [37] gør det usikkert om CRP spiller nogen væsentlig rolle i kronisk inflammation

in vivo

eller blot repræsenterer en uspecifik markør som antydet af den akutte fase udtryk mønster. I denne henseende, identifikation af den meget tilbagevendende

CRP

-286 SNP mutationer i flere typer af human cancer [19] indeholder en overbevisende dokumentation for, at dette protein er en potentiel drivkraft for tumorigenese og et centralt element i de lovgivningsmæssige netværk af inflammation.

Promoter mutationer i

TERT

[38], [39] og

CRP

[19] udgør de første eksempler på, at ikke-kodende regulatoriske regioner kan også målrettes til fremme tumorigenese ved at modulere ekspressionen i stedet for aktiviteter vigtige gener. Det er imidlertid noget unikt ved

CRP

at mutationen sker ved en fælles SNP-stedet. Dette giver anledning til bekymring, om SNP sites er generelt mere sårbare over for genetiske ændringer, der fører til den høje forekomst af passager mutationer. For at løse dette problem, vi genotype 24 SNPs af 141 tumor /normal prøve par. Disse SNP’er er placeret på 9 forskellige kromosomer, og består af 3 SNP’er af

CRP

, 2-promotoren SNP’er af inflammatoriske cytokiner, 1 SNP af en ikke-kodende gen, 18 SNP’er med ukendt association. Trods det, blev alle de SNP sites sig at være muteret i tumorer med kun lav baggrund frekvens. Derfor den meget tilbagevendende mutation på

CRP

-286 SNP site er sandsynligvis resultatet af valget ved udvikling af kræft, men ikke bare på grund af de generelle egenskaber knyttet til SNP hjemmeside eller genomisk placering. Det er dog stadig muligt at -286 mutationen er blot en konsekvens af tumorigenese og yderligere funktionelle assays er forpligtet til at afklare dette punkt.

Det er dog interessant, at selv om fire undersøgte

CRP

SNPs alle påvirker serum niveau af CRP, kun -286 SNP er målrettet efter tumorigenese. Dette tyder på, at effekten af ​​de andre 3 SNPs er sekundære til -286 SNP, som kan delvist forklares ved afhængighed af

CRP

udtryk på promotor CpG methylering, en vigtig epigenetisk mekanisme i gen lyddæmpning [ ,,,0],40]. Faktisk har vi for nylig vist, at høj CRP ekspression er korreleret med lav promotor methylering, og vice versa [19]. Af de 5 CpG motiver i

CRP

promoteren, evolutionært bevaret -286 CpG synes at være nøglen, især for ekstrahepatiske celletyper, ved fastsættelsen af ​​den basale niveau af

CRP

udtryk [19] . Da størstedelen af ​​de -286 mutationer er C A /T overgange, der forstyrrer methylering motiv, er det tænkeligt, at sådanne genetiske ændringer vil igen bidrage til at skifte på promotoraktiviteten af ​​

CRP

sandsynligt via sænke inhiberende methylering signal og lette binding af transkriptionsfaktorer til det underliggende E-box-sekvens [41]. Disse kan i sidste ende gøre det muligt senere deltagelse af distale regulerende elementer, der indeholder den anden

CRP

SNPs.

Den høje tilbagefald og omsiggribende

CRP

-286 SNP-mutationer i tumorer tyder den lokalt producerede CRP, i stedet for cirkulerende CRP, driver udviklingen af ​​kræft. Dette paradoks kan forklares ved den stramme afhængighed af de foranstaltninger, CRP på inflammatoriske mikromiljøer [3], [13], [14], [36]. Cirkulerende CRP er produceret af leveren som en pentamer primært viser antiinflammatoriske aktiviteter [7], [42], [43]. Udover hepatocytter, ekstrahepatiske celler er også i stand til at udskille CRP lokalt som respons på inflammatoriske stimuli. Desuden udløser beriget med inflammatoriske loci vil fremkalde hurtige kropsbygning ændringer i pentamerisk CRP bogføre sin

in situ

produktion [44] – [49], for at frigøre det fulde potentiale i ligandbinding [47], [48] , [50], supplerer forordningen [46], [48], [51] – [54] og stimulering af proinflammatoriske og angiogene celle responser [48], [49], [55] – [61]. Som sådan bør den lokale overflod af CRP og dens interaktioner med stressende mikromiljø være mere relevante for sygdomsprogression; mens cirkulerende CRP niveauer hovedsageligt spejle den underliggende inflammatoriske status.

dysregulering af Wnt signalvejen er den hyppigste begivenhed observeret i kolorektal cancer, som normalt manifesterer sig ved at inaktivere mutationer af

APC

eller aktivering mutationer af

β-catenin

[25]. En direkte konsekvens af

APC

inaktivering er stabilisering af

β-catenin

og afvigende aktivering af de nedstrøms target gener [62]. Det er derfor af interesse, at

CRP

har vist sig at være et mål af

β-catenin

[63]. Desuden vores resultater viser, at

CRP

-286 SNP-mutationer tendens til at co-forekomme med mutant

APC

i colon og rektal tumorer. Disse ville betyde, at de to sekretoriske molekyler,

dvs..

CRP og Wnt, kan handle i feedback og kooperative manerer at fremme tumorigenese, som fortjener yderligere undersøgelser. I betragtning af den afvigende aktiverede Wnt signalering og stærkt induceret

CRP

udtryk i tumorer, aktuel målrette begge molekyler kan være en potentiel mulighed for kolorektal cancer terapi.

Tak

Vi takker hr . Jing Zhao for hans fremragende teknisk bistand.