PLoS ONE: NK Cell Fænotypisk Modulation i lungekræft Miljø

Abstrakt

Baggrund

Nature killer (NK) celler spiller en vigtig rolle i anti-tumor immunterapi. Men det viste, at tumorceller påvirket eventuelt på NK celle normale funktioner gennem nogle molekyler mekanismer i tumor mikromiljø.

Materialer og metoder

Vores undersøgelse analyserede ændringen om NK-celler overflade markører (NK-celler receptorer ) gennem immunfluorescens, flowcytometri og real-time PCR, den dræbte funktion fra muse milt NK celle og humant høj /lav lungecancer-cellelinie ved co-dyrkning. Desuden certificeret vi ovenstående resultat på lungekræft model af SCID mus.

Resultater

Vi viste, at infiltration af NK-celler i tumor periferien var relateret med lungekræftpatienter ‘prognose. Og antallet af NK-celle infiltration i lungekræft væv er nært beslægtet med de patologiske typer, størrelse af den primære kræft, rygning historie og prognose af patienterne med lungekræft. Udtrykket af NK-celler inhibitor receptorer steget markant i tumor mikromiljø, i modsat ekspressionen af ​​NK-celler aktiverede receptorer falde storslået.

Konklusioner

overlevelsestid på lungekræft patient blev positivt relateret til NK-celle infiltration grad i lungekræft. Således kan nedregulering af NKG2D, Ly49I og opregulering af NKG2A angive immun tolerance mekanisme og lette metastaser i tumor miljø. Vores forskning vil tilbyde mere teori til klinisk strategi om tumor immunterapi

Henvisning:. Jin S, Deng Y, Hao J-W, Li Y, Liu B, Yu Y, et al. (2014) NK Cell Fænotypisk Modulation i lungekræft Miljø. PLoS ONE 9 (10): e109976. doi: 10,1371 /journal.pone.0109976

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 17. maj 2014; Accepteret: September 13, 2014; Udgivet: 9 oktober 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Young Research Fund Folk fra de tilskud National ellevte Five-Year Key Task Projekter af Kina (nr 2006BAI02A01) , National 973 Program (nr 2010CB529405), Tianjin videnskabelig innovation System Program (nr 07SYSYSF05000, 07SYSYJC27900), Kina-Sverige Cooperative Foundation (nr 09ZCZDSF04100), tilskuddet National Natural Scientific Foundation of China (nr 81.201.828), Young Folk Foundation of Heilongjiang Provincial Kina (Ingen QC2012C013), Health Department of Heilongjiang Provincial Kina (nr 2011-124) og Harbin Medical University Cancer Hospital større projekt Foundation (No: JJZ-2010-01). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer i verden, som har høj sygelighed og dødelighed og tegner sig for ca. 25,4% af alle tumorer. Det har været en opadgående tendens i incidensraten i de seneste år [1] – [4]. The American Cancer Society udgivet data viser, at 222,520 kræfttilfælde respiratoriske og 157,300 dødsfald i 2010, hvilket er i første omgang af sygelighed og dødelighed af alle maligne tumorer [5]. Et klinisk statistik over stadie IV NSCLC i Kina viste, at 1-, 2-, 3-, 4- og 5-årige overlevelsesrate var 44%, 22%, 13%, 9% og 6% [6]. Øjeblikket, kirurgisk resektion er stadig den vigtigste metode til at forlænge overlevelsestiden for lungekræft, men invasionen og metastase af lungecancer er den største hindring for at forbedre effektiviteten af ​​prognosen for lungekræft. For dybdegående undersøgelse af lungekræft ondartet adfærd og fokusere på omfattende behandling af metastatisk lungekræft, er det nødvendigt at etablere passende dyremodel til at studere lungekræft tilbagefald og metastase og dens omfattende terapi.

Naturlig killer (NK ) celle, også kendt som store granulære lymfocytter, er en uafhængig og ikke-specifik immuncelle. Det har ingen MHC-restriktion til målceller anerkendelse og ødelæggelse, og det kan direkte dræbe tumorceller og virusinficerede målceller uden antigen pre-sensibiliseret [7], [8]. Det kan også producere et stort antal immun-aktive cytokiner kan forbedre eller udvide sin antitumorvirkning, der kan betragtes som den første linje i værtens forsvarssystem [9]. Adskillige eksperimentelle beviser demonstrerede den vigtige rolle af NK-celler i elimineringen af ​​tumorceller. Vivier et al rapport, at en lav NK-celle cytotoksicitet i perifert blod blev korreleret med en øget risiko cancer [10]. Endvidere blev NK-celler infiltrerer i tumorvævet forbundet med god prognose i kolorektal [11], gastrisk [12], og lunge [13] cancere.

Med udviklingen af ​​tumordannelse, maligne tumorceller og infiltrerende immunceller interagere og komponeret tumor mikro-miljø. De fleste af undersøgelser offentliggjort viste, at et stort antal af immunceller infiltrerer i tumorvæv spillet en vigtig rolle i forbedringen tumor prognose [14], [15]. Men som vi alle kendte, prognosen for lunge-associeret maligniteter er meget forfærdelig, selv om der er mange immunceller i lungen. Vi ønsker at vide, om der er en differentiel sammensætning ifølge den immuncelle infiltrere i maligne og ikke-maligne lunge vævsområder, og endda måske potentielt bidrage til denne virkning. Esendagli G et.al fandt, at i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter, NK-celler ikke blev næsten findes i de maligne vævsområder, blev ikke maligne modstykker selektivt befolket af NK-celler og disse NK-celler udviste kraftig cytotoksisk aktivitet ex vivo [16].

Så virkningen af ​​NK-celle-receptor-ekspression og funktion kan være anderledes forårsaget af interaktionen mellem NK-celler og tumor i tumoren mikromiljø. Ved at udforske NK-celler i kroppen og /eller lungekræft mikro-miljø, diskutere dens fordeling, receptor udtryk, funktionelle status med lungekræft invasion, metastase og prognose, klarlægge mekanismen af ​​NK-celler er involveret i lungekræft mikro-miljø fra det cellulære og molekylære niveau.

Materialer og metoder

Tumor prøver og etiske retningslinjer

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Alle tumorprøver anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra Tianjin Lung Cancer Institute og Patologisk Institut i Tianjin Medical University General Hospital. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse. Og undersøgelsen blev godkendt af Institutional etiske komité i Tianjin Medical University General Hospital.

Paraffiner Prøvetagning og frosne væv oprindelse Lungekræft

Patienterne vil kunne deltage i induktion fase af undersøgelsen, hvis de har: histologisk eller cytologisk diagnosticeret NSCLC (herunder pladecarcinom, adenocarcinom og storcellet carcinoma); ingen forudgående systemisk kemoterapi, strålebehandling og bioterapi for lungekræft inden operationen; ingen anden cancer historie; og ≤80 år.

Paraffiner Specimen prøver blev indsamlet fra 84 patienter diagnosticeret med lungekræft mellem January1st 2008 og 31. januar 2011 (64 mænd og 20 kvinder). Den mediane alder af patienterne var 60,7 ± 7,9 år (spændvidde 40 til 78 år). Der findes forskellige patologiske typer: 37 pladecarcinom patienter, 37 adenocarcinom patienter og 10 store celle carcinom patienter. På tidspunktet for diagnosen, blev patienterne vurderet i henhold til den AJCC /UICC den sjette klassificering udgave som følger: fase IIA-1 patienter, stadie IIB- 4 patienter, stadie IIIA-58 patienter, stadie IIIB-12 patienter, trin IV-9 patienter. Prøverne blev anvendt fra Tianjin Medical University Patologisk Institut.

Frosne vævsprøver blev genereret fra 66 kirurgiske prøver med lungekræft mellem January1st 2008 og January1st 2011. Der er herunder 52 mænd og 14 kvinder. Den mediane alder af patienterne var 60,5 ± 8,4 år (spændvidde 40 til 78 år). Der var herunder forskellige patologiske typer: 28 pladecarcinom patienter, 28 adenocarcinom patienter og 10 store celle carcinom patienter. Patienterne blev vurderet i henhold til den AJCC /UICC den sjette klassificering udgave som følger: fase IIA-1 patienter, stadie IIB-4 patienter, stadie IIIA-45 patienter, stadie IIIB-9 patienter, stadie IV-7 patienter. Prøverne blev anvendt fra Tianjin Lung Cancer Research Institute.

Immunofluorescens

immunfænotyper analyse af CD56 og CD16 blev udført som følger. Kort fortalt, blev formalin-fikserede, paraffinindlejrede sektioner (4 um) opvarmes af fade i 45 minutter, derefter deparaffiniseret i xylen og rehydreret i en gradueret serie af ethanolopløsninger. Snittene blev derefter nedsænket i citronsyre-natriumcitrat (pH 7) og mikrobølge ved kraftig forbrænding i 5 minutter, lav varme i 15 minutter, og naturlig køling til stuetemperatur for at hente antigenicitet. Endogen peroxidase blev standset med 3% H

2O

2 i 30 min. Efter vask med PBS blev snittene inkuberet med 2% BSA i 2 timer i stuetemperatur og derefter inkuberet med CD56 og CD16-antistof (Santa Cruz, fortyndet til 1:100) natten over ved 4 ° C. Snittene blev inkuberet med muse-anti-ged og ged anti-mus fluorescens-antistof (Santa Cruz, fortyndet til 1:200) i 35 min og DAPI i 5 min. Efter vask med PBS fjerde gange blev sektionerne montering af glycerol (pH 9,0). Den røde fluorescens udtrykte CD56

+, den grønne fluorescens udtrykte CD16

+, den blå fluorescens udtrykte cellekernen. Vi kan finde CD56

+ og /eller CD16

+ udtrykke i NK-celle. SPOT billedanalyse-software blev anvendt i analyseprocessen. Procentdelen af ​​CD56 og /eller CD16-positive celler blev bestemt ved tælling i afsnit. NK celletal af per view felt blev scoret efter følgende kriterier: +, NK celletal på per-view felt 10; ++, NK celletal på per-view felt 10, 20; +++, NK celletal på per-view felt 20. Alle felter i pr afsnit i tre uafhængige forsøg blev beregnet.

RNA ekstraktion, cDNA syntese, og DNA isolation

Den samlede RNA blev ekstraheret med Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse til fabrikantens protokol. Den totale RNA blev fordøjet med R Nase-fri D Nase-I (Promega, Madison, USA) og anvendt til cDNA-syntese med revers transkriptase-systemet (Takara Biotech, Dalian, Kina).

Kvantitativ realtid PCR

cDNA-syntese blev udført som beskrevet ovenfor. Den specifikke primer RT eksperiment var som følger: NK1.1: 5’TCTCTTGAATAAACACACAGCAT -3 ‘, NKG2A: 5’CTGAGAAGGATTTTG -3’, NKG2D: 5’TTCTCACAGTTCCTCT -3 ‘, LY49I: 5’TTCTATTCTTGCTTTAG -3 ‘. Primerparrene og GAPDH primerpar blev anvendt til Q-PCR med SYBR Premix Ex Taq RT-PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) i en ABI PRISM 7900 realtid System (Bio-Rad) med følgende betingelser: 95 ° C i 30 s, 40 amplifikationscykler (95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s) og et smeltepunkt cyklus fra 60 ° C til 95 ° C. Dataene blev analyseret under anvendelse af ABI PRISM 7900 Manager-software. Alle reaktioner blev udført med tre tekniske gentagelser.

Cell

De høje og lave metastase store cellet lungekræft-cellelinjer L9981-Luc og NL9980-Luc fra Tianjin Lung Cancer Institute [17], [ ,,,0],18] blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Hyclone, Amerika) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Hyclone, America) i en fuldt befugtet inkubator (Nuaire, US Autoflow) ved 37 ° C med 5% CO

2. Cellerne blev holdt i en eksponentiel vækstfase under forsøg.

SCID model

SCID (svær kombineret immundefekt) mus købt fra kinesiske Academy of Medical Sciences dyr institutioner blev huset i patogenfrie dyr faciliteter. Kvindelige anvendte mus var 5-7 uger af alder ved eksperimentets begyndelse. Kvinde SCID-mus (16 dyr i hver forsøgsgruppe) inokuleret subkutant i højre inguen med 2 * 10

6 celler suspenderet i 150 ul PBS. Ni dyr i kontrolgruppen havde nogen inokulering. Tumorstørrelser blev målt hver 7. dag, og deres fluorescensintensitet blev målt med Amerikas sande essensen af ​​levende billeddannende system (Xenogen IVIS200). Efter 6 ugers observation blev dissektion udført og eksplanteret tumorer, lunger og milt blev fjernet for yderligere analyse. Disse forsøg blev gentaget mindst to gange for at bekræfte resultaterne. De dyr forsøgsprotokoller blev godkendt af Udvalget for Etik dyreforsøg og forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforsøg i Tianjin Medical University Cancer Research Center.

lymfocyt indsamle og flowcytometri opdage

De lunger og milt blev poleret i stykker. Derefter lymfocytterne indsamle blev ekstraheret med lymfocyt Separation Medium (Shenzhen, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Procentdele af NK-celler blev vurderet og separeret med flowcytometri ved anvendelse af monoklonale antistoffer (MoAb’er) anti-CD3

– FITC /NK1.1

+ PE (BD Phamingen, San Di ego, CA). Under analyse, CD3

– blev /NK1.1

+ Befolkning bestemt. For at bestemme overfladeekspression af NK-celle ligander på NK-celler, blev cellerne derefter farvet med gede-anti-muse NK1.1-FITC, CD3- Alexa Fluor 647, NKG2A-FITC, NKG2D-PE, Ly49I-PE (BD Phamingen, San Di ego, CA) i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Analysen blev udført på FACS Sort (Becton Dickinson, Mountain View, CA) ved hjælp af Cell Quest software (Becton Dickinson) og celleoverfladen udtryk blev kvantificeret med værdien af ​​de gennemsnitlige fluorescensintensiteter opnået med de specifikke mAbs.

Co-kultur

Oprenset NK1.1

+ /CD3

– NK-celler (aktiveret med 100 U /ml IL-2 under 2 h) fra muse milt blev co-dyrket med lungecancer cellelinje L9981-Luc /NL9980-Luc som (A) 0.25:1, (B) 0.5:1, (C) 01:01 og (D) 02:01 til 24, 48, 72 timer. Efter co-dyrkning blev fluorescensintensiteten af ​​NK-celler målt med Amerikas sande essensen af ​​levende afbildningssystem.

Kvantitativ realtids-PCR

RNA blev isoleret fra eksplanterede tumorer via Trizol og reverse transskriberet ved hjælp af specielle priming (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR blev udført på en ABI PRISM 7900 instrument under anvendelse af SYBR green assays. De specifikke primere er anført i det følgende (tabel 1). Amplifikationen blev udført som følger. Efter indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 30 sekunder, blev skabeloner denatureret ved 95 ° C i 5 sekunder, primere blev annealet og forlængelse af DNA blev udført ved 60 ° C i 30 sekunder (hver cyklus blev gentaget 40 gange). Udtrykket af målgener blev kompenseret ved hjælp af ekspressionen af ​​GAPDH og præsenteres ved udtrykket forholdet mellem ubehandlede kontrol celler og behandlede celler.

Statistisk analyse

Eksperimenter blev udført tre gange. Data er præsenteret som middelværdier ± SD. Den statistiske evaluering blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA test eller rank-sum test når måledata er Gaussisk fordeling med SPSS Software systemet, udgave 17.0. Hvis dataene er tælling data, Chi-square testen blev anvendt.

P Salg værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Samlet overlevelse blev sammenlignet af Kaplan-Meier efterladte kurve, Login-rank rank-sum test, der anvendes blandt grupper.

Resultater

NK celle lokalisering og morfologi karakteristisk i lungekræft mikro-miljø

de infiltrerede NK-celler i lungekræft væv blev hovedsageligt koncentreret i tumoren stroma, der udgør tumor mikromiljø (figur 1). Hos NSCLC væv, CD56

+ NK celler med 1, 2 og 3 grad af infiltration var 44,0%, 22,6%, 33,3%, CD16

+ NK celler var 45,2%, 22,6%, 32,1%, og CD56

+ CD16

+ NK celler var 45,2%, 23,8%, 31,0%, henholdsvis. Ingen signifikant forskel blev observeret (

s Restaurant B. lungeadenocarcinom; C. Stor celle lungekræft. Udtrykket af NK-celler i pladecellekræft var betydeligt højere end i adenocarcinom og storcellet carcinom. Vejviser

NK-celle infiltration og lungekræftpatienter prognose

overlevelsestiden for lungekræft patient var positivt forbundet med NK-celle infiltration grad i lungekræft. blev eksisteret Jo mere infiltration af NK-celler, jo længere overlevelsestid af patienter gjorde (

s

= 0,030) (figur 3, tabel 4).

overlevelsestid på lungekræft patient var positivt relateret til NK-celle infiltration grad i lungekræft. Jo mere infiltration af NK-celler blev eksisterede, jo længere overlevelsestid af patienter gjorde. Patienterne i niveau 3-gruppe har den længste overlevelsestid. Blandt tre grupper statistisk signifikans er exit. (

s

= 0,030)

Real-time PCR bekræfte NK-celle infiltration omfang i lungekræft

Forskellene i NK celle receptorer CD56 og CD16 mRNA-ekspression mellem forskellige patologiske typer af lungekræft blev detekteret og kontrolleret af Real-time PCR. Vi fandt, at NK-celler fænotype mRNA i forskellige histologiske type af lungekræft har statistisk signifikans (fig.4). Dette er i overensstemmelse med resultatet af histologi.

NK-celler receptorer CD56 og CD16-fænotype mRNA i forskellige histologiske typer lungekræft har statistisk signifikans.

Transplanterede tumorer-lunge metastase modeller etableret

Transplanterede tumorer-lunge metastase modeller blev en succes etableret i SCID mus med høj (L9981) /lav (NL9980) metastatiske humane store cellet lungekræft-cellelinjer. Den fjerne metastaser af xenotransplantatet tumoren blev detekteret ved fluorescens-billeddannelse in vitro (Fig.5A). Sammenlignet med lavt metastatisk gruppe (6,84 x 10

6 ± 3,26 × 10

6), lungemetastaserne fluorescens værdi mus i høj metastatisk gruppe (30,97 × 10

6 ± 14,3 × 10

6) var bemærkelsesværdigt højere end i lav-metastatisk gruppe (

s

= 0,035) (Fig.5B, C, D)

A:. Living fluorescens billeddannelse opdage musemodel ( venstre er den rigtige inguen subkutant tumor i 1 uge, og den midterste er til 6 uger efter injektion, til højre er lungemetastaserne tumorer i seks uger efter podning), B:. vækst kurve af subkutant transplantation tumor i SCID mus, C: lungemetastaser luminescens billeddannelse af tumor-bærende mus in vitro, D:. sammenligningen af ​​luminescens værdi mellem transplanterede tumor og lungemetastaser af høj (L9981) /lav (NL9980) metastatiske humane store cellet lungekræft-cellelinjer

NK celle fænotypiske graduering i lungekræft mikro-miljø

NK1.1

+ CD3

– NK-celler i lunger af høj metastatisk gruppe (3,40 ± 0,90) var signifikant højere end i milt (0,10 ± 0,06) (

s

= 0,003). NK1.1

+ CD3

– NK-celler i milten af ​​high-metastaser gruppe (0,10 ± 0,06) var signifikant lavere end i lav-metastase gruppe (1,66 ± 0,82) og kontrolgruppen (3,80 ± 2,05) (

s

= 0,017,

s

= 0,025) (fig.6)

NK1.1

+ CD3

-. NK-celler i lungerne af høj -metastatic gruppe var signifikant højere end i milten (

s

= 0,003). NK1.1

+ CD3

– NK-celler i milten af ​​high-metastaser gruppe (0,10 ± 0,06) var signifikant lavere end i lav-metastase gruppe (

s

= 0,017) og kontrol gruppe (

s

= 0,025).

NKG2D udtryk niveau af NK-celler fra milt i high-metastase gruppe (4,17 ± 0,85) var bemærkelsesværdigt lavere end i kontrolgruppen (7,80 ± 2,67) (

s

= 0,034) og lav-metastase gruppe (6,00 ± 0,96) (

s

= 0,040) (Fig.7B)

A:. NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler fra lunge i high-metastatisk L9981 gruppen var signifikant højere end i lav-metastatisk NL9980 gruppe og kontrolgruppen (

s

= 0,000). Ly49I ekspressionsniveauet fra lungerne i L9981-gruppen og NL9980-gruppen var signifikant højere end i kontrolgruppen (

s

= 0,000) B: NKG2D udtryk niveau af NK-celler fra milt i L9981-gruppen (4,17 ± 0,85) var bemærkelsesværdigt lavere end i kontrolgruppen (

s

= 0,034) og NL9980 gruppe (

s

= 0,040). Ly49I ekspressionsniveauet i NL9980 gruppe var bemærkelsesværdigt højere end i L9981 gruppe (

s

= 0,010) og kontrolgruppen (

s

= 0,004). C: NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler fra lungen var signifikant højere end fra milten i høj metastatisk L9981 gruppe (

s

= 0,007) og Ly49I ekspressionsniveauet fra lunge var bemærkelsesværdigt opreguleret end den, milt (

s

= 0,003) D: blev eksisterede nogen signifikant forskel af alle de receptorer udtryk niveau af NK-celler i lav metastase NL9980 gruppe. E: Ly49I udtryk niveau af NK-celler fra lungen var betydeligt højere end fra milten i kontrolgruppen (

s

= 0,033)

NKG2A udtryk niveau af NK-celler. fra lunge (5,13 ± 2,36) var signifikant højere end fra milt (1,47 ± 0,68) i high-metastatisk gruppe (

s

= 0,007) (Fig.7C). NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler fra lunge i high-metastatisk gruppe (5,13 ± 2,36) var signifikant højere end i lav-metastatisk gruppe (4,70 ± 1,96) og kontrolgruppen (0,73 ± 0,26) (

s

= 0.000) (Fig.7A).

Ly49I udtryk niveau af NK-celler fra lunge i høj metastatisk gruppe (4,82 ± 1,78) var bemærkelsesværdigt opreguleret end i milten (1,50 ± 0,10) (

p

= 0,003) (Fig.7C). Den Ly49I Ekspressionsniveauet af NK-celler fra lungerne (2,79 ± 0,40) var signifikant højere end fra milten (1,13 ± 0,40) i kontrolgruppen (

s

= 0,033) (Fig.7E). Ly49I ekspressionsniveauet af NK-celler fra lungen i høj metastatisk gruppe (4,82 ± 1,78) og lav-metastatisk gruppe (6,11 ± 2,23) var signifikant højere end i kontrolgruppen (2,79 ± 0,40) (

s

= 0.000) (Fig.7A). Ly49I ekspressionsniveauet af NK-celler fra milten i svagt metastatisk gruppe (3,40 ± 1,00) var bemærkelsesværdigt højere end i høj-metastatisk gruppe (1,50 ± 0,10) (

s

= 0,010) og kontrolgruppen (1,13 ± 0,40) (

s

= 0,004) (Fig.7B).

NK celle dødelig virkning i lungekræft mikro-miljø

NK1.1

+ CD3

– NK-celler aktiveres af IL-2 in vitro har signifikant cytotoksisk aktivitet til høj /lav metastatisk lungekræft store celler. En signifikant forskel blev observeret mellem forskellige effektor-mål-forhold (

s

= 0,005,

s

= 0,017). NK-celler havde højere cytotoksisk aktivitet til NL9980 end til L9981 i samme effektor-mål-forhold (

s

= 0,035) (tabel 5).

NK-celle-receptor-mRNA der udtrykker i subkutant transplanteret svulst i mus

i de transplanterede tumorer i tumor-bærende gruppe, NKG2D udtryk niveau af NK-celler i høj metastaser gruppen var signifikant højere end i lav-metastase gruppe (

s

= 0,018), og Ly49I ekspressionsniveauet af NK-celler i høj metastase gruppe var også bemærkelsesværdigt højere end lav-metastase gruppe (

s

= 0,001). Imidlertid blev eksisterede ingen signifikant forskel i NK1.1 og NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler mellem høj og lav metastase gruppe (

s

0,05) (fig.8)

NKG2D. ekspressionsniveauet af NK-celler i høj metastase L9981-gruppen var signifikant højere end i lav-metastase NL9980 gruppe (

s

= 0,018), og Ly49I ekspressionsniveauet af NK-celler i L9981 gruppe var også bemærkelsesværdigt højere end NL9980 gruppe (

s

= 0,001). Ingen signifikant forskel i NK1.1 og NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler blev eksisterede mellem høj og lav metastase gruppe.

Diskussion

Denne undersøgelse viste, at NK-celler infiltration og NK-celler receptorekspression ændring i NSCLC tumor miljø. Fra vores forskning, fandt vi, at de NK-celler infiltreret hovedsageligt i tumor stroma, der udgør tumor mikro-miljø. Disse observationer er i overensstemmelse med tidligere observationer der viser, at lunge tumor mikromiljø [16]. Desuden fik vi overraskelse, at antallet af NK-celle infiltrerer i lungekræft væv er tæt forbundet med de patologiske typer, størrelsen af ​​den primære cancer, rygning historie og prognose af patienterne med lungekræft.

Tidligere litteratur underforstået, at nogle molekyler udtrykker i tumoren og nogle medier, der frigives fra tumor almindeligvis ført til tumorundvigelse mekanismer fra NK-celle immunologisk overvågning [19], [20]. Der er høje niveauer af ikke-klassisk MHC I molekylær HLA – E og HLA – G i tumoren celleoverfladen. De var NK-celleaktivering CD94 /receptor NKG2A og celleoverflade immunglobulin prøve transkription molekylære 2 (ILT2) inhibitorisk ligand, som kan begrænse NK cellebeskadigelse funktion [21] – [23]. Samtidig kan tumorceller udskiller nogle tumor suppressor faktorer inhibering af NK-celle-funktion, såsom IL-10 [24] og TGF-β [25]. Omkring tumor infiltrerer NK celle, havde nogle særlige ændringer i nogle andre humane tumorer blevet undersøgt. I nyrekræft kunne NK celle i tumoren kun blev aktiveret med IL-2-stimulering har målcellen opløsning funktion. Og til de samme patienter var der betydelige forskelle mellem det perifere blod NK-fænotype med i tumor [26] – [28]. NK celleoverfladereceptor dNAM-1, 2B4, CD16-ekspression reduceres i ovariecancer, hvilket kan resultere i NK-celle-aktivering funktion blev stærkt beskadiget [29].

Vores forskning resultat prompt at det aktiverede receptor NK celler nedreguleres og hæmmende receptor af NK-celler er opreguleret i det transplanterede tumor og de fjerne metastatiske læsioner af menneskelige store celle lungekræft-cellelinjer, som kan være den vigtigste årsag, der fører til NK celledræbende evne faldet.

NKG2D er en receptor for MHC klasse i chain-relaterede a og B molekyler, som ofte udtrykkes af epiteliale cancere. Ligering af NKG2D inducerer anti-tumorale effektorfunktioner i både NK- og T-celler. NKG2D anerkendelse spiller en vigtig rolle i tumor immunovervågning [30], og at NKG2D primært virker til at udløse perforin-medieret apoptose [31]. Vores forskning bekræftet, at NKG2D udtryk niveau af NK-celler fra milt i high-metastaser gruppe var bemærkelsesværdigt lavere end i kontrolgruppen (

s

= 0,034) og lav-metastase gruppe (

s

= 0,040). I de transplanterede tumorer i tumorbærende gruppe, NKG2D mRNA-ekspression niveau af NK-celler i høj metastase var væsentligt højere end i lav-metastase gruppe (

s

= 0,018).

NKG2A er en hæmmende NK receptor, som er blevet rapporteret at danne disulfidbundne heterodimerer med invariant CD94. Den NKG2A ligand er blevet identificeret som HLA-E, en ikke-klassisk MHC-klasse-I b-molekyle, der er bredt fordelt på forskellige væv, udviser relativt lav overfladeekspression, og har begrænset polymorfi [32]. Den inhiberende receptor CD94 /NKG2A spiller en stor rolle i NK cellemedieret lysis af aktiverede CD4

+ T-celler [33]. NKG2A ekspressionsniveauet af NK celle fra lunge var signifikant højere end fra milt i high-metastatisk gruppe (

s

= 0,007). NKG2A ekspressionsniveauet af NK-celler fra lunge i high-metastatisk gruppe var signifikant højere end i lav-metastatisk gruppe og kontrolgruppen (

s

= 0,000). Således kan nedregulering af NKG2D og opregulering af NKG2A angive immuntolerance mekanisme og lette metastase i tumor miljø.

Interaktion af MHC klasse I med Ly49 receptorer forhindrer aktiveringen af ​​NK-celler og derved lysis af målcellen. Således NK-celler udnytte Ly49 receptorer at skelne “selv” fra “mangler-selv ‘. Tab af MHC klasse I molekyler på målceller aflaster NK-celle af Ly49-medieret inhibering, hvilket således tillader NK-celler til at mediere cytotoksicitet [34]. Den Ly49I Ekspressionsniveauet af NK-celler fra lungen var betydeligt højere end fra milten i kontrolgruppen (

s

= 0,033). Ly49I ekspressionsniveauet af NK-celler fra lungen i høj metastatisk gruppe og lav metastatisk gruppe var signifikant højere end i kontrolgruppen (

s

= 0,000). I de transplanterede tumorer i tumor-bærende gruppe, Ly49I mRNA-ekspression niveau af NK-celler i høj metastaser gruppe var også bemærkelsesværdigt højere end lav-metastase gruppe (

s

= 0,001).

Desuden er en højere modstandsdygtige over for cytotoksiske aktivitet af NK-celle eksisterer i den humane high-metastatisk storcellet lungecancer-cellelinje L9981, hvilket er langt højere end i lav-metastatisk storcellet lungecancer-cellelinie NL9980. Desuden er det muligt, at andre receptorer af NK-celler ændret i tumor miljø. I melanom, kunne NK-celler øge ekspressionen af ​​CD86, og ligering af CD86 med CTLA4Ig signifikant øget evne NK-celler til at dræbe tumorceller [35].