PLoS ONE: Discovery og Præklinisk karakterisering af Novel lille molekyle TRK og ROS1 tyrosinkinaseinhibitorer til behandling af kræft og Inflammation

Abstrakt

Receptortyrosinkinaser (RTK), som svar på deres vækstfaktor ligander, phosphorylerer og aktivere nedstrøms signaler er vigtige for fysiologisk udvikling og patologisk transformation. Forøget ekspression, aktiverende mutationer og omlejring fusioner af RTK’er føre til kræft, inflammation, smerte, neurodegenerative sygdomme, og andre lidelser. Aktivering eller over-ekspression af ALK, ROS1, TRK (A, B, og C), og RET er forbundet med onkogene fænotyper af deres respektive væv, hvilket gør dem attraktive terapeutiske mål. Cancer cDNA array-undersøgelser viste overekspression af TRK-A og ROS1 i en række forskellige cancere, sammenlignet med deres respektive normale kontroller væv. Syntetiserede vi et bibliotek af små molekyler, der hæmmer de ovenfor angivne RTK’er med picomolær til nanomolær styrke. Den ledende molekyle GTx-186 inhiberede RTK-afhængig cancer celle og tumorvækst.

In vitro

in vivo

væksten af ​​TRK-A-afhængige IMR-32 neuroblastomceller og ROS1-overekspression NIH3T3 celler blev hæmmet af GTx-186. GTx-186 også inhiberede inflammatoriske signaler medieret af NFKB, AP-1, og TRK-A og potent reduceret atopisk dermatitis og luft-pouch inflammation hos mus og rotter. Desuden GTx-186 inhiberes effektivt ALK phosphorylering og ALK-afhængig cancercellevækst. Kollektivt, at RTK-inhibitor GTx-186 har en unik kinase profil med potentiale til behandling af cancer, inflammation, og neuropatisk smerte

Henvisning:. Narayanan R, Yepuru M, Coss CC, Wu Z, Bauler MN, Barrett CM et al. (2013) Discovery og Præklinisk karakterisering af Novel lille molekyle TRK og ROS1 tyrosinkinaseinhibitorer til behandling af kræft og inflammation. PLoS ONE 8 (12): e83380. doi: 10,1371 /journal.pone.0083380

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Oktober 11, 2013; Accepteret: November 2, 2013; Udgivet: 26 december, 2013 |

Copyright: © 2013 Narayanan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. RN, MY, CCC, ZW, MB, CMB, MLM, YW, JK, LS, YH, DDM, og JTD er ansat i GTx og har GTx aktieoptioner. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

receptor (RTK) familie består af 58 transmembrane proteiner, der regulerer mange celle funktioner, herunder proliferation, migration og cellecyklus progression [1]. Forøget ekspression, aktiverende mutationer, fusionsproteiner omlejringer eller coactivation af disse proto-onkogener fremme oncogen transformation af deres respektive væv [2], [3]. På grund af deres funktionelle betydning, har RTK’er udviklet som terapeutiske mål til behandling af cancer, inflammation, smerte, neurodegenerative sygdomme, og andre [4]. Discovery bestræbelser på at udvikle småmolekyleinhibitorer eller antistoffer af RTK’er er eksponentielt steget i de sidste 10-15 år. Siden opdagelsen af ​​BCR-ABL-omlejring og dets inhibitor imatinib, andre RTK-inhibitorer, såsom crizotinib (ALK-inhibitor), afatinib (EGFR-inhibitor), og lenvatinib (VEGFR inhibitor), er blevet udviklet til onkologiske indikationer [5] – [7 ].

tropomyosin-relateret kinase (TRK) er en familie på tre RTK (TRK-a, TRK-B, og TRK-C) regulerer flere signalveje, der er vigtige for overlevelse og differentiering af neuroner [8 ], [9]. Udover deres kritisk funktion i neuroner, de og deres ligander (nervevækstfaktor (NGF), hjerne vækstfaktor (BDNF), og neurotrophiner, henholdsvis) er vigtig for, neuronal cellevækst og overlevelse. Forøget ekspression og aktivering af TRK-A er opfyldt i neuroblastom, brystcancer, psoriasis, og neuropatisk smerte, for at nævne nogle få sygdomme, der skyldes TRK-A dysfunktion [10] – [12]. Selvom onkogene fusioner af TRK-A ikke er blevet identificeret til dato, dets overekspression er tilstrækkelig til at forøge proliferation og invasion af celler. Mens NGF-antistoffer er i kliniske forsøg for smerte, K252a, den eneste lille molekyle TRK-A-hæmmer i klinikken, er i øjeblikket under evaluering til behandling af psoriasis [13], [14].

ROS1 er en proto-onkogen, der tilhører samme fylogenetiske gren som TRK-A [15]. I modsætning TRK-A, aktivering af ROS1 opstår typisk, når det er fusioneret til onkogene fusionspartnere såsom fusioneret i glioblastom (FIG) og opløst stof carrier familie 34 element 2 (SLC34A2) [2], [16]. ROS1 har vist sig at være overudtrykt i glioblastom, cholangiocarcinom, lungecancer og andre [17] – [19]. Forøget ekspression af ROS1 i forskellige kræftformer har foranlediget udvikling af selektive inhibitorer. Crizotinib, udviklet til ALK positiv lungekræft, hæmmer også ROS1 og er i et klinisk forsøg for ROS1- positiv lungekræft.

Den selektive pres påføres ved kontinuerlig RTK hæmning resulterer i fremkomsten af ​​forskellige klonale populationer af kræft celler med erhvervet resistens og ofte accelereret proliferation [20], [21]. Escape mekanismer anvendes af cancerceller til at overvinde RTK-inhibering omfatter mutationer, onkogen fusion og aktivering af sekundære kinaser og signalveje. Derfor udvikling af anden og tredje generation RTK-inhibitorer er bydende nødvendigt at behandle de resistente fænotyper, der uundgåeligt vil opstå i første generation terapi. Udvikling af inhibitorer med særskilte farmakoforer og unikke kinase hæmmende profiler vil give de nødvendige alternative strategier for at overvinde modstand.

Der er et par undersøgelser, der viser ROS1 eller TRK-A overekspression i kræft, men individuel eller kombineret udtryk for ROS1 og TRK- a i en lang række af cancere blev hidtil dårligt karakteriseret. Brug 381 cDNA prøver fra 22 kræftformer, vi demonstrerer overekspression af TRK-A og ROS1 i kræft, der ikke tidligere er beskrevet. TRK-A er overudtrykt i 100% af fæokromocytom og størstedelen af ​​andre kræft de analyserede prøver. GTx-186, en roman RTK-inhibitor med unikke kinase inhibitorisk profil, hæmmer TRK familien, ROS1, ALK, og RET kinaser ved picomolære til lav nanomolære IC

50 værdier. GTx-186 effektivt hæmmede kræftformer drevet af TRK-A og ROS1 udtryk og var også ekstraordinære overvinde inflammatoriske sygdomme, såsom dermatitis.

In vitro

undersøgelser viste, at GTx-186 hæmmer også neuropatisk smerte signalering medieret af TRK-A ligand, NGF, hvilket gør GTx-186 et værdifuldt redskab i armamentarium for kræftbekæmpelse, inflammation og smerte.

Materialer og metoder

Reagenser

Alle antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling (Danvers, MA). Realtime PCR-reagenser og TaqMan-primere og prober blev opnået fra Life Technologies (Carlsbad, CA). Rotte cytokin-array-2 blev opnået fra Ray Biotech (Norcross, GA). Cancer undersøgelse cDNA-array (CSRT 103) var fra Origene (Rockville, MD). Humane rekombinante NGF 2,5 s var fra Millipore (Billerica, MA) og dexamethason blev opnået fra LKT Labs (St. Paul, MN). Tumornekrosefaktor α (TNF-a) og lipopolysaccharid (LPS) blev indkøbt fra R crizotinib blev opløst i 10% DMSO + 90% PEG-300) som angivet i figurerne. Tumorvolumen og kropsvægt blev målt som anført i tal. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen længde * bredde * bredde * 0,5236.

Croton Olie-induceret Dermatitis

C57BL /6 mus blev behandlet to gange på 16 timer og 2 timer før anvendelse af acetone eller crotonolie (20 pi 10% crotonolie i acetone på hver indre øre) [24]. Seks timer efter crotonolie ansøgning blev dyrene aflivet, og øre slag blev vejet og opbevaret i RNA senere for RNA-isolering.

Air Pouch Inflammation Model

Luft blev injiceret i flankerne af Sprague Dawley rotter fire dage (20 ml) og to dage (10 ml) før injektion af carrageenan (1 ml 2% carrageenan) i posen [25]. Seks timer efter carrageenan administration blev dyrene aflivet, blev 5 ml saltvand injiceres i posen blev pose ekssudater opsamlet, og antallet af leukocytter og makrofager infiltreret ind i posen blev talt under et mikroskop.

Statistiske analyser blev udført hjælp GraphPad Prism-software.

Resultater

TRK-A og ROS1 er over-udtryk i flere kræftformer

Isolerede undersøgelser har identificeret den overekspression af enten TRK-A eller ROS1 i neuroblastom [26], lungekræft [2], glioblastom [16], og cholangiocarcinom [17]. Da begge disse kinaser er proto-onkogener, vi spekuleret på, at oplysninger om kombineret ekspression kan bidrage til at forudsige additiv eller synergistisk vækst af den respektive cancer. Til bestemmelse af TRK-A og ROS1 ekspressionsmønster blev tissue scan cDNA arrays indeholdende 381 cDNA prøver fra 22 cancere og tilstødende normale væv anvendes (figur 1). Cancere i adrenal (7/10 cancer prøver udtrykte TRK-A), pancreas (5/17 TRK-A), ovarie (7/20 TRK-A), spiserør (9/20 TRK-A og ROS1), urinblære ( 6/22 TRK-A), og endometrium (9/17 ROS1) udtrykte forøgede niveauer af TRK-A og /eller ROS1, sammenlignet med tilsvarende normale prøver. Interessant, 100% af fæokromocytom, en neuro-endokrin adrenal cancer med sympatiske nervesystem oprindelse, prøver overudtrykt TRK-A mellem 50-1000 gange, sammenlignet med normale adrenale væv. Tidligere rapporter har vist, at fæokromocytom cellelinie, PC12, udtrykte det højeste niveau af TRK-A blandt talrige

in vitro

cellulære systemer undersøgte, der bekræfter disse resultater [27]. Prøver fra kræft i urinblæren (3 prøver) og spiserøret (4 prøver) udtrykte både TRK-A og ROS1, hvilket potentielt kan medføre additiv eller synergistisk spredning. Cancere i prostata, bryst og andre ikke udviste detekterbare niveauer af nogen af ​​kinaser. Da disse resultater er fra en lille delmængde af prøverne, skal de valideres med yderligere prøver.

Angivelse af TRK-A og ROS1 blev kvantificeret ved realtime PCR i cDNA fra 381 prøver fra 22 forskellige kræftformer og tilsvarende normale væv. TRK-A og ROS1 udtryk blev normaliseret til actin og repræsenteret som fold forskel fra normale ikke-kræft prøver ved hjælp ddCt metode. Gennemsnit af normale prøver blev taget for beregningen ddCt. Ad.C-Adrenal kræft; Normal-cDNA fra Non-kræft væv. Tal under prøverne indikerer normale prøver.

In vitro karakterisering af GTx-186

GTx186 er en imidazo [4,5-f] isoindol derivat relateret til tidligere offentliggjort roman RTKI GTx -134 [28]. For at udnytte den onkologiske, inflammatoriske, og nociceptive roller TRK-A og ROS1 tyrosinkinaser, vi byggede et bibliotek af små molekyler, der selektivt hæmmer kinaser i fylogenetiske gren indeholder TRK-A og ROS1. GTx-186 selektivt inhiberede TRK-A, TRK-B, TRK-C, ROS1, ALK, og RET-medierede phosphorylering med IC

50 værdier i picomolære til lave nanomolære område (tabel 1). På den anden side, GTx-186 inhiberede IGF-1R og EGFR-medieret phosphorylering ved meget højere koncentrationer (større end 100-1000 nM), hvilket indikerer dets selektivitet over kun en delmængde af kinaser. Da ALK og RET ekspression i normale væv er minimale og knockout dyr har ligegyldige fænotyper [29], [30], krydsreaktivitet med disse to kinaser er af lille bekymring muliggør GTx-186 til behandling af TRK-A og ROS1-afhængige sygdomme, med minimal risiko for uønskede virkninger.

GTx-186 Hæmmer TRK-A-afhængige IMR-32 neuroblastomcellelinje og xenotransplantat Growth

Siden IMR-32 neuroblastomceller udtrykker TRK isoformer og er afhængige på TRK-a for deres vækst [31], vi anvendte denne linje som en model til at undersøge virkningerne af GTx-186 på TRK-a phosphorylering og vækst, både

in vitro

in vivo

. Den yderst potent GTx-186 inhiberede NGF-induceret phosphorylering af p42 /44 MAPK, en kinase nedstrøms for TRK-A, som medierer proliferation og inflammation som reaktion på NGF [32], ved en koncentration så lav som 10 nM (figur 2A). På den anden side, en 10 gange mindre potent analog inhiberede NGF-induceret p42 /44 MAPK-phosphorylering kun ved en koncentration større end 100 nM. Efterfølgende blev IMR-32-celler behandlet med stigende koncentrationer af GTx-186 for at bestemme virkningen på cellevækst efter 72 timer. Som vist i figur 2B, GTx-186 inhiberede dosisafhængigt væksten af ​​IMR-32-celler med en IC

50 værdi på ca. 100 nM. GTx-186 også fuldstændig hæmmet NGF-afhængig migration af IMR-32-celler (figur 2C), hvilket indikerer, at inhibering af TRK-A er både anti-proliferativ og anti-invasiv. Under identiske betingelser, GTx-186 havde ingen virkning på væksten af ​​SH-SY5Y-celler, en neuroblastomcellelinje som mangler TRK-A [26].

A. GTx-186 inhiberer NGF-induceret ERK (p42 /44 MAPK) phosphorylering. IMR-32-neuroblastomceller blev serum sultet i 2 dage, forbehandlet i 2 timer med de angivne koncentrationer af GTx-186 og behandlet med 200 ng /ml NGF i 30 min. Celler blev høstet og Western blot udføres for phospho-ERK og total-ERK. B. GTx-186 inhiberer proliferation af IMR-32-celler. IMR-32-celler blev udpladet i vækstmedium og behandlet med angivne koncentration af GTx-186 i 3 dage. Celler blev fikseret og farvet med sulforhodamin B (SRB) og optisk densitet (OD) blev målt ved 535 nm. C. GTx-186 inhiberer migration af IMR-32-celler. IMR-32-celler blev udpladet i en Platypus migration assayplade og blev behandlet med vehikel, NGF, eller en kombination af NGF og GTx-186. Billeder blev fanget under lysmikroskop 12 timer efter behandlingen. D-G. GTx-186 inhiberer IMR-32 neuroblastoma xenograft vækst. IMR-32 celler blev subkutant implanteret i nøgne mus (10 millioner celler /mus). Når tumorerne nåede 100-200 mm

3, dyr (n = 8) blev randomiseret og behandlet dagligt med vehikel eller 20 mg /kg /dag i.v. GTx-186. Tumorvolumen (D) og kropsvægt (F) blev målt hver dag i 4 dage. Dyrene blev aflivet, tumorerne vejet (E), der er lagret i formalin, og behandles til TUNEL immunhistokemi (G-Antal TUNEL-positive celler (venstre felt) og intensiteten af ​​TUNEL-farvning (højre panel)). Værdier er udtrykt som Gennemsnitlig ± S.E. NGF-nervevækstfaktor; Åbne barer er vehikelbehandlede og fyldt barer er GTx-186-behandlede prøver. * -statistically Signifikant ved p 0,05; ** – Statistisk signifikant ved p 0,01

For at vise, at de anti-proliferative virkninger af GTx-186 er reproducerbare

in vivo

i en tumor xenograft model, IMR-32. celler blev implanteret i nøgne mus og tumorbærende dyr blev behandlet med vehikel eller GTx-186 intravenøst. På grund af den hurtige proliferative og meget invasive karakter af IMR-32 celler, tumorer voksede fra 200 mm

3 til 2000 mm

3 inden 4 dage. GTx-186 effektivt og væsentligt reduceret tumorvækst (figur 2D), startende fra dag 1 til udgangen af ​​undersøgelsen, hvilket resulterer i mere end 80% inhibering af tumorvækst. Disse effekter blev fremkaldt uden synlige toksiske effekter, herunder eventuelle ændringer i kropsvægt (figur 2F). GTx-186 reducerede også signifikant tumorvægt (Figur 2E) med mere end 50% i forhold til vehikelbehandlede dyr. For at bestemme mekanismen for denne anti-tumor effekt, blev fikseret i formalin tumorvæv immunhistokemisk farvet for TUNEL og antallet af TUNEL-positive celler og TUNEL-farvning intensitet blev evalueret. GTx-186 øget apoptose af tumorceller ved mere end to gange sammenlignet med vehikelbehandlede dyr som vist ved såvel antallet af TUNEL-positive celler og TUNEL-farvning intensitet (figur 2G). Disse effekter blev fremkaldt med en steady state koncentration på ca. 50 nM GTx-186, hvilket er sammenligneligt med

in vitro

IC

50 værdier.

GTx-186 fremkalder Anti-inflammatoriske effekter in vitro

TRK-A og dets ligand NGF er mediatorer af inflammatoriske sygdomme, såsom dermatitis, psoriasis og arthritis. NGF udtrykkes i makrofager og

in vitro

, NGF inducerer TNF-α-syntese og synergistisk med interferon-γ for at øge ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner [33]. Disse virkninger kan vendes ved TRK-A-hæmmere. Desuden har NGF og TRK-A blevet impliceret i en række inflammatoriske og allergiske tilstande, herunder astma og polymorfonukleære leukocytter kemotaxi [34]. For at forstå virkningen af ​​GTx-186 på inflammation induceret af forskellige cytokiner og vækstfaktorer, PC12-celler blev forbehandlet med GTx-186 eller dexamethason og efterfølgende behandlet med PMA eller NGF for at inducere ekspressionen af ​​inflammatoriske cytokiner. Mens GTx-186 effektivt inhiberede ekspressionen af ​​MMP-3-, en matrixmetalloproteinase, induceret af både PMA og NGF, dexamethason inhiberede MMP-3-ekspression kun induceret af PMA, men ikke af NGF (figur 3A). Dette viser, at NGF og PMA mægle inflammation gennem distinkte veje, og glukokortikoider, såsom dexamethason, er kun effektive i ikke-NGF-medieret inflammation. For at bestemme bredere anti-inflammatoriske virkninger af GTx-186, om nogen, IMR-32-celler (figur 3B), normale humane keratinocytter (NHEK, figur 3C), LADMAC makrofager (figur 3D) og RAW 264,7 musemakrofager (figur 3E) blev forbehandlet med GTx-186, og inflammatoriske cytokiner blev induceret ved NGF, TNF-α, eller LPS. GTx-186 hæmmede effektivt vigtige inflammatoriske mediatorer såsom økonomidirektører, IL-8 og IL-1β med potens sammenlignelig med dens virkninger på kinase aktivitet.

Cellerne blev serum udsultet i 2 dage, forbehandlet med angivne koncentrationer af GTx-186 i 30 minutter og behandlet med vækstfaktorer eller cytokiner i 12-16 timer. RNA blev ekstraheret, cDNA syntetiseret, og ekspression af inflammatoriske gener blev målt ved realtime PCR under anvendelse Taqman primer og prober. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og gentaget mindst tre gange. Værdier er udtrykt som Gennemsnitlig ± S.E. Dex-Dexamethason; PMA-phorbolmyristatacetat; NGF-nervevækstfaktor; TNF-α-tumornekrosefaktor; LPS-Lipopolysaccharid; MMP3-Matrix Metalloproeinase 3; IL-8-Interleukin 8; PC-12-pheochromocytomceller celler; IMR-32-Neuroblastomceller; NHEK-Normal humane epidermale keratinocytter; LADMAC-makrofag /monocytter; RAW-264,7-Mouse makrofagceller.

GTx-186 Hæmmer Croton Oil-induceret atopisk dermatitis i mus

Siden TRK-A har været impliceret i psoriasis [12] og dermatitis [ ,,,0],35] og GTx-186 inhiberede IL-8, en af ​​de kritiske cytokiner der medierer dermal inflammation [36] (figur 3C), evaluerede vi GTx-186 i en crotonolie model af atopisk dermatitis. Crotonolie forøger erytem, ​​øre vægt og vaskulær lækage, en fænotype svarende til atopisk dermatitis [37]. Anvendelse af crotonolie forøget ødem og vægt af ører, som blev dosisafhængigt reduceret med GTx-186 (figur 4A). RNA fra øre slag blev isoleret og ekspression af forskellige gener i de inflammatoriske pathways blev målt (figur 4B). Crotonolie forøgede ekspression af alle de målte inflammatoriske pathway-gener, herunder NGF, som blev alle markant inhiberet af GTx-186 og dexamethason.

A. C57BL /6-mus (20-25 g; n = 3) blev administreret to gange med den angivne dosis af GTx-186 (sc) eller dexamethason (sc), 16 timer og 2 timer, før påføring af crotonolie (20 pi 10 % crotonolie i acetone på hver indre øre). Seks timer efter crotonolie ansøgning blev dyrene aflivet, øre slag blev vejet og opbevaret for RNA-isolering. * Angiver signifikans ved p 0,05 fra acetone anvendt vehikelbehandlede dyr. # Indikerer signifikans ved p 0,05 fra crotonolie anvendt vehikelbehandlede dyr. B. RNA blev isoleret fra øre slag af dyrene i panel A og ekspression af angivne gener blev målt ved realtime PCR og normaliseret til GAPDH ved hjælp TaqMan-primere og prober. Værdier er udtrykt som Gennemsnitlig ± S.E. Dex-dexamethason; 186-GTx-186; NGF-nervevækstfaktor; IL-Interleukin; CCL-kemokinligand; MMP-matrixmetalloproteinase; MCSF-makrofagkolonistimulerende faktor.

GTx-186 Hæmmer carrageenan-induceret inflammation i Rat Air Pouch Model

NGF-antistoffer er klinisk succes i behandling af arthritis smerter [38]. Imidlertid blev potentiale til at behandle systemisk inflammation i forbindelse med smerte ikke vurderet. Da GTx-186 inhiberede inflammatoriske cytokiner i en række forskellige cellelinjer, herunder makrofager, testede vi GTx-186 i carrageenan-induceret systemisk inflammation ved anvendelse af en luftpose model. Luftsækken model er fysiologisk og mekanistisk sammenlignes med arthritis, og derfor denne model blev brugt til at evaluere GTx-186 [25], [39]. Administration af carrageenan forøget leukocyt og makrofag infiltration i luft-pose, sammenlignet med saltvandsbehandlede dyr (figur 5A og 5B). Subkutan og intra-pouch administration af GTx-186 signifikant reduceret leukocyt- og makrofag infiltration. Intra-pose administration af GTx-186 fremkaldte et bedre svar end subkutan administration, hvilket indikerer en positiv sammenhæng mellem eksponering narkotika på stedet for inflammation og anti-inflammatoriske virkninger.

A-C. Pose blev skabt subkutant i en flanke af rotter (n = 3) ved injektion af 20 ml luft fire dage før og 10 ml luft to dage før behandling. GTx-186 (sc i panel A og intra-pose eller sc i panel B, 40 mg /kg), dexamethason (30 mg /kg sc) eller indomethacin (30 mg /kg sc) blev administreret tre gange, 48 timer, 24 timer, og 1 time, inden administration af carrageenan (1 ml 2%). Seks timer efter carrageenan administration blev dyrene aflivet, 5 ml saltvand blev injiceret i posen til at skylle posen fluid og antallet af leukocytter og makrofager infiltreret ind i posen blev talt under et mikroskop. TNF-α blev målt under anvendelse af et ELISA i posen ekssudater fra forsøget i panel B. (C). D. Virkning af GTx-186 på inflammatoriske cytokiner i carrageenan-induceret luft-pose inflammation blev målt i posen ekssudater bruger cytokin array. Vigtige cytokiner blev kvantificeret og udtrykt som søjlediagrammer til højre. Værdier er udtrykt som Gennemsnitlig ± S.E. n = 3. 186-GTx-186; Indom-Indomethacin; Dex-Dexamethason; TNF-tumornekrosefaktor; IL-Interleukin; CINC-cytokininduceret Neutrofil-kemoattraktant protein.

luftsæk ekssudater blev underkastet cytokin array til bestemmelse af virkningen af ​​GTx-186 og indomethacin på det globale cytokin proteinekspression (fig 5D og tabel S2) . Interessant, GTx-186 og indomethacin afveg i deres virkninger for at hæmme cytokiner. Mens både GTx-186 og indomethacin hæmmede carrageenan-induceret TNF-α, IL-1β, fractalkin, IL-13, og leptin, kun GTx-186 inhiberede CINC-1, CINC-2, IL-6, og LIX. På den anden side, hverken GTx-186 eller indomethacin hæmmede carrageenan-induceret CINC-3, TIMP-1, PDGFa, MMP-8, og MCP-1, hvilket indikerer, at disse cytokiner ikke kan være kritiske formidlere af betændelse i luftsækken model .

TNF-α er en vigtig mediator af inflammation i carrageenan-induceret akut inflammation i luft pouch synoviale modeller. Lokale niveauer af TNF-α korreleret med hævelse og omfanget af inflammation, der blev vendt ved et anti-TNF-α-antistof [25].