PLoS ONE: mikrovesikler fra humant Whartons Jelly mesenchymale stamceller fremme menneskelig Renal Cancer Cell Growth og aggressivitet gennem Induktion af hepatocyt Growth Factor

Abstrakt

I vores tidligere undersøgelse, mikrovesikler (MVS) frigivet fra

humane Salg Whartons jelly mesenkymale stamceller (HWJ-MSC’er) forsinke væksten af ​​blæren cancerceller. Vi vil gerne vide, om MV’er have en lignende effekt på

menneske

renalcellecarcinom (RCC). Ved anvendelse af cellekultur og BALB /c nu /nu

mus

xeno-graft model, påvirkning af MV’er upon væksten og aggressivitet RCC (786-0) blev vurderet. Celletælling kit-8 (CCK-8) assay forekomst af tumor, tumorstørrelse, Ki-67 eller

TUNEL

farvning blev anvendt til at evaluere tumorcellevækst

in vitro

eller

in vivo

. Flowcytometri assay (

in vitro

) eller undersøgelse af cyklin D1 udtryk (

in vivo

) blev udført for at bestemme ændring af cellecyklus. Den aggressivitet blev analyseret ved

Sårheling Assay Hotel (

in vitro

) eller MMP-2 og MMP-9-ekspression (

in vivo

). AKT /p-AKT, ERK1 /2 /p-ERK1 /2 eller HGF /c-MET-ekspression blev detekteret ved real-time PCR eller Western blot. Vores data viste, at MV’er fremme væksten og aggressivitet RCC både

in vitro

in vivo

. Desuden MV’er lettet progression af cellecyklus fra G

0/1 til S. HGF-ekspression i RCC blev stærkt induceret af MVS forbundet med aktivering af Akt og ERK1 /2 signalveje. RNase forbehandling ophævede alle effekter af MV’er. Sammenfattende induktion af HGF syntese via RNA overføres af MV’er aktiverer AKT og ERK1 /2 signalering er en af ​​afgørende bidragydere til den pro-tumor effekt

Henvisning:. Du T, Ju G, Wu S, Cheng Z Cheng J, Zou X, et al. (2014) mikrovesikler fra humant Wharton s Jelly mesenchymale stamceller fremme menneskelig Renal Cancer Cell Growth og aggressivitet gennem Induktion af hepatocytvækstfaktor. PLoS ONE 9 (5): e96836. doi: 10,1371 /journal.pone.0096836

Redaktør: Giovanni Camussi, University of Torino, Italien

Modtaget: Januar 26, 2014 Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 5 maj 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra Research Program for Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (10411967200) og Shanghai Song-Jiang Health Bureau (2011PD06) og National Natural Science Foundation of China (81.170.642) og Shanghai Shen Kang Plat-formen Grant (SHDC12007206) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Selvom forfatterne modtaget støtte fra Shanghai Song-Jiang Health Bureau, det ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

evne MSC til hjem til steder med tumorer har inspireret undersøgelse af disse celler som potentielle anti-tumor-værktøjer [ ,,,0],1], [2]. Imidlertid har der været diskussion om, hvorvidt MSC’er udøve anti-tumor effekt indtil nu. I ganske få undersøgelser, MSC gøre fremme udviklingen af ​​tumorer. Det er blevet dokumenteret, at MSC ikke kun er involveret i dannelsen af ​​tumor mikromiljø, men interagerer med kræftceller til at fremme deres vækst og metastase [3] – [5]. Den nøjagtige virkningsmekanisme er fortsat uklart. Immunosuppressiv handling [6], [7], trans-differentiering mod retningen af ​​mesenkymale celler [8], [9] samt forskellige bioaktive faktorer der udskilles fra MSC’er [10] er blevet foreslået at være potentielle effektorer.

Det er blevet erkendt for nylig, at MV’er frigivet fra MSC er en afgørende effektor af deres handlinger. MV’er er blevet beskrevet som en hidtil ukendt vej for intercellulær kommunikation, som kan omprogrammere målceller ved at levere funktionelle mRNA og microRNA-sekvenser [11], [12]. Da MSC er en rigelig kilde til MV’er, er det tænkeligt, at de spiller en central rolle i stamcelle biologiske effekt [13]. Forståelse rolle MV’er i formidling af tumorceller adfærd og funktion kan støtte i yderligere afsløre de nøjagtige mekanismer, der ligger til grund for MSC pro- eller anti-tumor effekt.

I vores tidligere undersøgelse, MV’er afledt HWJ-MSC’er svækket væksten af ​​blæren tumorceller (T24) gennem nedregulering af AKT aktivering og opregulering af spaltet Caspase-3 [14]. RCC er en anden almindelig urologiske tumor. Vi havde en stor interesse i påvirkning af MV’er på dens vækst og aggressivitet.

Menneskelige

renalcellecarcinom 786-0 celler blev anvendt i denne undersøgelse. I modsætning T24, 786-0 celler udtrykker både HGF og c-MET, der repræsenterer en cancer tidligt progenitorcelle markør [15]. Derfor er megen opmærksomhed på effekten af ​​MV’er på HGF /c-MET signalvejen.

in vivo

in vitro

data viser, at MV’er frigivet af HWJ-MSC favorisere vækst og aggressivitet RCC. Yderligere indsigt er givet i mekanismerne bag denne effekt. Dataene viser, at induktion af HGF-ekspression i RCC via RNA oplysninger overføres af MV’er er en af ​​vigtigste bidragydere til aktivering af AKT og ERK1 /2 signalveje, som bidrager til den pro-tumor effekt af MV’er. Mediet konditioneret med HWJ-MSC’er er blevet demonstreret at inducere nativt og udenlandske HGF syntese i beskadigede tubulære celler [16]. I en nylig undersøgelse, fandt vi, at

menneske

HGF mRNA til stede i MVS afledt HWJ-MSC’er leveres i

rotte

rørformede celler udsat for hypoxi /re-iltning og er oversat til proteinet . Vi mener, at levering af

menneske

HGF mRNA i

menneske

tumorceller kan være en af ​​virkningsmekanismer.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

i denne undersøgelse al forskning med menneskelige deltagere blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse af det kinesiske Academy of Medical Science og Medical School i Shanghai Jiao Tong University. Menneskelige individer i denne undersøgelse gav skriftligt informeret samtykke til at deltage i forskning og give os mulighed for at offentliggøre case detaljer. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Shanghai Jiao Tong University. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Shanghai Jiao Tong University. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell kultur

Dette eksperiment blev godkendt af Research etiske komité på Shanghai Jiao Tong University Affiliated First Folkets Hospital . HWJ-MSC’er blev isoleret og opformeret som beskrevet før [17].

Menneskelig

RCC linje (786-0) (Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Shanghai, Kina) blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco).

Isolering og karakterisering af MVS

MV’er frigivet af HWJ-MSC’er blev isoleret og karakteriseret som tidligere beskrevet [14]. Til fremstilling af MVS HWJ-MSC’er blev dyrket i lav-glucose DMEM frataget FBS og suppleret med 0,5% bovint serumalbumin (BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) natten over. Supernatanterne blev opsamlet og centrifugeret ved 2000 g i 20 min for at fjerne debris. De cellefri supernatanter blev ultra-centrifugeret ved 100000 g (Beckman Coulter Optima L-80K-ultracentrifuge; Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) i 1 time ved 4 ° C. De ovenstående væsker blev opgivet, og de isolerede MV’er blev suspenderet med M199 (Sigma-Aldrich) indeholdende 25 mM HEPES (pH 7,4) og underkastet en anden ultracentrifugering under de samme betingelser. MV’er blev resuspenderet i serumfrit M199. Indholdet af MV’er protein blev kvantificeret ved

Bradford metode

mens

Limulus test

blev ansat til at udelukke endotoksin kontaminering af MV’er. RNA ekstraheret fra MV’er ved anvendelse af TRIZOL-reagens blev analyseret ved spektrofotometer. Flowcytometrisk analyse af MV’er viste tilstedeværelsen af ​​CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 og CD105, men ikke CD34 og CD45 (data ikke vist). De fremstillede MV’er blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Transmissionselektronmikroskopi

Suspensionen blev fikseret med 2,5% glutaraldehyd i PBS i 2 timer. Efter skylning MV’er var ultracentrifugeres og suspenderet i 100 pi PBS. En 20 pi dråbe MV’er blev sat på en Formvar /kulovertrukket gitter, negativt farvet med 3% vandig fosfor-wolframsyre i 1min og observeret ved transmissionselektronmikroskopi (HITACHI, H-7650, Tokyo, Japan). Størrelsen af ​​de isolerede MV’er varierede fra 30 nm til 500 nm.

MV’er forbehandlet med RNase

En del af isolerede MV’er blev behandlet med 100 ug /ml RNase (Fermentas, Burlington, ON , CANADA) i 3 timer ved 37 ° C, og reaktionen blev standset ved tilsætning af RNase inhibitor (Fermentas). Efter ultracentrifugering ved 100.000 g i 1 time ved 4 ° C blev MV’er suspenderet ved M199 og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse (RNase-MV’er). Spektrofotometer afslørede, at det meste af RNA ekstraheret fra MV’er ved anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev nedbrudt af RNase-behandling (MV’er: 1,8 ± 0,3 ug RNA /mg protein; RNase-MV’er: mindre end 0,15 ug RNA /mg protein).

Animal model

Eighteen mandlige BALB /c nu /nu mus på 4-6 wk år (Laboratory Animal center of Shanghai, Academy of Science, Shanghai, Kina) blev tilfældigt inddelt i 3 grupper (n = 6 for hver gruppe). Alle mus modtog subkutan injektion af 1 x 10

7 786-0 celler med tilsætning af MV’er (200 ug /ml protein) (en mængde på MV’er frigivet med ca. 1 × 10

6 HWJ-MSC’er natten over), RNase-MV’er eller M199 (kontrol). Dyr blev overvåget hver 3. dag. Tiden-punkt for tumor forekomst blev registreret. Tumorvækst blev vurderet ved tumorvolumen, som blev beregnet med den modificerede ellipsoide formel: V = 1/2 (længde x bredde) [18]. Længden og bredden af ​​tumormassen blev målt ved skydelære.

CCK-8 assay

CCK-8 (Beyotime institut for bioteknologi, Jiangsu, Kina) blev anvendt til at bestemme

in vitro

væksten af ​​tumorceller. 786-0-celler blev podet i 96-brønds plader (2000cells /brønd) og inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Efter 24 timers inkubation blev cellerne vasket med PBS, og derefter co-dyrket med MV’er (200 ug /ml protein), RNase-MVS i M199 eller M199 (kontrol) i 24 eller 48 timer. Celler blev vasket to gange med PBS og inkuberet i 100 pi RPMI-1640 (Gibco) indeholdende 10 pi CCK-8 reagens i yderligere 3 timer. Absorbansen af ​​hver brønd ved 450 nm var spektrofotometer-metrisk målt ved anvendelse af en mikro-plade ELISA-læser (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA). Culture medium (RPMI-1640) uden celler blev anvendt som blank kontrol.

Analyse af cellecyklus og Sårheling Assay

786-0 celler (5 x 10

4) blev inkuberet med MV’er (200 ug /ml) eller RNase-MVS i M199 eller M199 (kontrol) i 48 timer. Efter behandling med trypsin, blev cellerne opsamlet og vasket to gange med PBS, derefter fikseret i 70% iskold ethanol i 24 timer. De fikserede celler blev farvet med 50 pg /ml propidiumiodid (PI) (Sigma) i PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 (Sigma) og 50 ug /ml RNase (Sigma), og derefter analyseret af G

0 /G

1, G

2 /M og S fasen sats ved en FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson FACS Calibur, Franklin Lake, NJ, USA).

sårheling Assay

blev også udført for at vurdere cellemigrering. 786-0 celler (5 x 10

4) blev udsået i 6-brønds plader i ferske RPMI-1640-medier (Gibco) i 12 timer af initial kultur, og fortsatte derefter til kultur til en anden 12 og 24 timer med tilsætning af MV’er eller RNase-MV’er i M199 eller M199 (kontrol). De grundlæggende trin indebærer at skabe et “sår” i en celle monolag, erobre billederne i begyndelsen og i slutningen under cellemigration at lukke såret. Såret blev skabt ved manuelt at skrabe cellemonolaget med en P200 pipette spids. Det område af sårede område mangler celler blev registreret for evaluering.

Real time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celle- eller tumorprøver under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og blev derefter omvendt transkriberet med Moloney leukæmivirus (M-MLV) revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA) og Oligo dT-primere (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 60 min ved 42 ° C. Real-time PCR blev udført ved TaqMan genekspression assays (Applied Bio-Systems, Foster City, CA, USA) til påvisning af genekspression af HGF, MMP-2, MMP-9 eller β-actin anvendelse af følgende primere:

HGF

: 5’CTCTGGTTCCCCTTCAATAG, 3’GATAGCCCCATTTCTGGATGTC;

MMP-2

: 5’CCCATTTTGATGACGATGA, 3’CAAGTTACCGTTCCTCATGTT;

MMP-9

: 5’CGAACTTTGACAGCGACAAGA, 3’GATACCAGGAGCGGGACTT;

β-actin

: 5’AAGGTGACAGCAGTCGGTT, 3’GGAGAGGGTTCAGGTGTGT;

kvantificering af målgenet blev normaliseret ved β-actin, en intern kontrol-gen. Ct for målgenet og β-actin blev bestemt for hver prøve. De eksperimentelle prøver blev udtrykt som en n-fold forskel i forhold til kontrollen (M199-behandlede celle- eller tumorprøver). Den relative ekspression af mRNA-ekspression blev beregnet ved 2

-ΔΔCT. Triplikater af hver prøve blev udført.

Western blot-analyse

Proteinekstrakter (30 ug pr bane) underkastedes elektroforese og derefter overført til polyvinylidenfluoridmembran. Immuno-blotting blev udført ved at inkubere hver membran med en anti-HGF (fortynding: 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), c-MET (fortynding: 1:250, Abcam, Cambridge, UK), AKT (fortynding: 1 :1000, Abcam, Cambridge, UK), p-AKT (fortynding: 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), ERK1 /2 (fortynding: 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), p-ERK1 /2 ( fortynding: 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), MMP-2 (fortynding: 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), MMP-9 (fortynding: 1:500, Abcam, Cambridge, UK), cyclin D1 ( fortynding: 1:250; Abcam, Cambridge, UK) eller β-actin natten over ved 4 ° C. Efter at være blevet vasket i PBS, blev hver membran inkuberet i 1 time med et sekundært antistof konjugeret med peroxidase ved stuetemperatur. Bandet blev udviklet ved anvendelse af forstærket kemisk-luminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Densiteten af ​​hvert bånd blev bestemt. Resultaterne blev gentaget to gange for at bekræfte reproducerbarheden

Immunhistokemi

Kort fortalt blev objektglassene inkuberet med antistof mod humant HGF (fortynding: 1:100; Abcam, Cambridge, UK) eller Ki. 67 (fortynding: 1:200; Abcam, Cambridge, UK) efterfulgt af en HPR-konjugeret sekundært antistof ved anvendelse af DAB som substrat. Negativ kontrol blev udført ved at erstatte primære antistoffer med en ikke-immun immunoglobulin af samme iso-type. Kerner blev modfarvet med Harris hematoxylin. Celle apoptose blev vurderet ved en terminal transferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay under anvendelse af en

In Situ Celledød Detection Kit

(Roche, Mannheim, Tyskland). Alle sektioner blev revideret af en læge blindet for dette eksperiment.

Supplerende eksperimenter

Tredive mandlige BALB /c nu /nu mus på 4-6 uger år blev tilfældigt subkutant podet med 1 × 10

7 786-0 celler med tilsætning af konditioneret medium (CM) fra HWJ-MSC’er MVS isoleret fra CM eller kontrolmedium (M199 eller lav-glucose DMEM). Dyr blev overvåget hver 3. dag. Tiden-punkt i tumor forekomst og tumorstørrelse blev registreret.

In vitro

, 786-0 celler blev podet i plader med 96 brønde (2000 celler /brønd) og inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Efter 24 timers inkubation blev cellerne vasket med PBS, og derefter co-dyrket med CM, MV’er isoleret fra CM eller kontrolmedium i 24 eller 48 timer. CCK-8 Assay blev udført for at bestemme cellevækst.

I et andet supplerende eksperiment, 786-0-celler (5 x 10

4) blev udsået i 6-brønds plader i ferske RPMI-1640-medier (Gibco ) i 12 timer initial kultur og blev derefter inkuberet med MV’er (200 ug /ml protein), MV’er med tilsætning af PF2341066 (Pfizer, 6 uM), PF2341066 eller kontrolmedium i 48 timer. Totale proteiner i celler blev isoleret for Western blot-analyse af p-AKT og p-ERK1 /2. Virkningerne af forskellige behandlinger på cellevækst blev også vurderet ved CCK-8-analysen.

Statistisk analyse

Data indberettes som midlet ± standardafvigelse (SD). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af

SPSS v19.0.

Statistisk forskel mellem data midler blev bestemt ved 2-tailed

Students t-test

variansanalyse

(ANOVA) som passende. En værdi på

P 0,05

blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

MV’er lette vækst og migration af 786-0 celler in vitro

CCK-8 assay viste, at MV’er høj grad fremme proliferationen af ​​786-0-celler efter 48 timer inkubation henviser RNase forbehandling ophævede denne virkning (fig. 1A). Analyse af cellecyklus viste også, at 786-0 celler behandlet med MV’er overvejende akkumuleret i S-fase i forhold til G

0 /G

1 fase i RNase-MV’er eller kontrolgruppen (Fig. 1B og 1C). På baggrund af disse resultater, mener vi, at MV’er letter udviklingen af ​​cellecyklus, derved fremskynde udbredelsen af ​​RCC. Desuden blev

Sårheling Assay

anvendes til at vurdere evnen af ​​cellemigrering. Data viste, at MV’er tydeligt øge celle migration (fig. 1D).

(A) CCK-8-analysen. Efter 48-0 celler MVS høj grad fremmet cellevækst mens forbehandling med RNase ophævede denne virkning. De celler inkuberet med M199 blev betragtet som kontrol. *

P

0,01 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er; (B) (C) Cell cycle analysis. 786-0 celler behandlet med MV’er akkumuleret primært i S-fase i forhold til G

0 /G

1 fase i RNase-MV’er eller kontrolgruppen. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er; (D)

Sårheling Assay

. Migrationen evne 786-0 celler var signifikant forstærket af MV’er.

MV’er fremskynde udviklingen og progressionen af ​​podede tumorer

Ved tilstedeværelse af MVS blev tumor knuder dannet i nogle af mus så tidligt som 6d efter podning med 786-0-celler (fig. 2B). Ved 18d, tumorincidensen nåede 100% (Fig. 2B). Derimod var der ingen dannelse af tumorknuder i mus behandlet med kontrol medium, indtil 12d efter inokulering (fig. 2B). Den endelige tumorincidens var kun 75% (Fig. 2B). Desuden tumorvækst under induktionen af ​​MV’er var hurtigere end den induceret ved RNase-MV’er eller køretøj som angivet ved måling af tumorstørrelse (fig. 2A og 2C). Desuden blev der påvist mere Ki-67-positive og færre TUNEL-positive tumorceller på tumor sektioner fra mus, der fik behandling med MV’er (Fig. 2D). Af interesse, cyclin D1 proteinekspression i tumorvæv var markant opreguleret ved MV’er (fig. 3A og 3B). Cyclin D1, som en kritisk mediator, er involveret i overgang cellecyklus fra G

1 til S-fasen. Derfor stigningen i cyclin D1-ekspression letter cellecyklusprogression. Ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 anvendes til at vurdere evnen af ​​tumor aggressivitet. Ved hjælp af RT-PCR og western blot, fandt vi, at MV’er føre til en betydelig opregulering af deres genet og proteinekspression (fig. 3A-3C). Alle disse beviser viser, at MV’er fremmer tumor udvikling og progression, i overensstemmelse med resultaterne af

in vitro

eksperiment.

(A) Nøgne mus podet med 786-0 celler. 786-0-celler blandet med MV’er eller RNase-MV’er i M199 eller M199 (kontrol) blev inokuleret subkutant i nøgne mus aflivet 36d efter podning; (B) Tumorhyppigheden. Der var en højere tumorforekomst i nøgne mus behandlet med MV’er sammenlignet med RNase-MV’er eller kontrol; (C) Tumorvolumen. I modsætning til RNase-MV’er eller kontrol, MV’er førte til udviklingen af ​​en større tumor i nøgne mus. *

P

0,05 MVS vs. RNase-MV’er eller kontrol; (D) Ki-67 og TUNEL-farvning. I nærvær af MV’er var der flere Ki-67-positive farvning af celler og færre celler der farves positive for TUNEL på tumorsnit.

(A) (B) Gel fotografi og Densito-metrisk analyse af cyclin D1, MMP-2 og MMP-9-protein-ekspression. MV’er førte til en betydelig opregulering af cyclin D1, MMP-2 og MMP-9-protein ekspression i tumorvæv. RNase forbehandling destrueres disse virkninger. Densiteten af ​​hvert bånd blev bestemt. Værdier i grafen er udtrykt som densitometridata forhold mellem valsens D1 /β-actin, MMP-2 /β-actin eller MMP-9 /β-actin som foldes over kontrol (stiplet linje). Data blev opnået fra 3 dyr for hvert forsøg. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er; (C), Gene ekspression af MMP-2 og MMP-9. Genekspressionen af ​​MMP-2 eller MMP-9 var markant opreguleret ved MV’er. Ct (tærskel cyklus) for hvert gen blev bestemt for hver prøve. Kvantificeringen af ​​MMP-2 eller MMP-9 blev normaliseret ved β-actin. Genekspressionen i kontrolgruppen blev betragtet som kalibratoren (stiplet linje) .Den relative ekspression af målgenet blev beregnet ved 2

-ΔΔCt. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

. 0,05, RNase-MV’er vs. MV’er

Aktivering af AKT og ERK1 /2 signalering i podede tumorer er fremkaldt af MV’er

i betragtning af den tætte associering AKT og ERK1 /2 signalering med overlevelse, vækst og migration af RCC [19], [20], vi også bestemt ændring af disse to signalering fremkaldt af MV’er i

in vivo

forsøgsopstilling. Western blot-analyse afslørede, MVS førte til en robust stigning i phosphorylering niveau af AKT i inokulerede tumorer i modsætning til RNase-MV’er eller kontrol (fig. 4A og 4B). MV’er forårsagede også en forholdsvis svagere, men signifikant stigning i p-ERK1 /2-niveau (fig. 4A og 4B).

(A) (B) Gel fotografi og Densito-metrisk analyse af for AKT, p-AKT , ERK1 /2 og p-EREK1 /2 proteinekspression i inokulerede tumorer. MV’er førte til en betydelig fosforylering af tumor AKT og ERK1 /2-proteiner. Densiteten af ​​hvert bånd blev bestemt. Værdier i grafen er udtrykt som densitometridata forhold mellem p-AKT /β-actin, p-ERK1 /2 /β-actin, p-AKT /AKT eller p-ERK1 /2 /ERK1 /2 som foldes over kontrol (stiplet linje ). *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er

MV’er inducerer HGF-ekspression i RCC enten in vitro eller in vivo

Det. er dokumenteret, at HGF /c-MET er involveret i kræft celledeling og invasion [21], [22]. Desuden over- eller mis-ekspressionen af ​​HGF og c-MET ofte korrelerer med dårlig prognose og metastase af human RCC [23] – [26]. HGF /c-MET-signalering kan også føre til aktivering af både AKT og ERK1 /2 signalering. Derfor har vi gjort yderligere undersøgelse af virkningen af ​​MV’er på HGF /c-MET-ekspression i RCC.

Efter 48 timers inkubation med MVS HGF proteinekspression i 786-0 celler var betydeligt opreguleret som påvist ved western blot-analyse henviser c-MET-ekspression ikke undergår en sådan ændring (fig. 5A og 5B). Et lignende resultat blev opnået ved undersøgelse af HGF mRNA-ekspression (fig. 5C). Den induktive effekt af MV’er på HGF også verificeret i

in vivo

eksperimentel indstilling. I nærvær af MV’er, var der en markant intensivering af HGF farvning på tumorsnit (fig. 5D). Western blot-analyse viste også, at tilsætningen af ​​MV’er ført til en markant stigning af HGF proteinekspression i tumorvæv (fig. 5E-5F). Som

in vitro

, c-MET proteinekspression i podede tumorer ikke blive påvirket af MV’er (fig. 5E-5F). Forbehandling med RNase forventeligt frustrerende for ændringer i HGF udtryk enten

in vivo

eller

in vitro

, hvilket indebærer den afgørende rolle af RNA oplysninger leveret af MV’er i HGF induktion. Da HGF induktion er parallelt med aktivering af AKT og ERK1 /2, kan MV’er udløse aktiveringen af ​​AKT og ERK 1/2 via HGF induktion, i det mindste delvis.

(A) (B) Gel fotografi og densitometrisk analyse af HGF og c-MET proteinekspression i 786-0 celler. Ved 48 timer efter tilsætning af MVS HGF proteinekspression i 786-0 celler var tydeligt opreguleret mens c-MET-ekspression undergik ingen væsentlige ændringer. Forbehandling med RNase ødelægges virkningen af ​​MV’er. Densiteten af ​​hvert bånd blev bestemt. Værdier i grafen er udtrykt som densitometridata forhold mellem HGF /β-actin eller c-MET /β-actin som foldes over kontrol (stiplet linje). *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er; (C) HGF genekspression i 786-0 celler. Efter 48 timers inkubering med 786-0 celler, MV’er væsentlige inducerede opregulering af HGF-genekspression, frustreret ved RNase-behandling. Ct (tærskel cyklus) for hvert gen blev bestemt for hver prøve. Kvantificeringen af ​​HGF blev normaliseret ved β-actin. HGF-ekspression i kontrolgruppen blev betragtet som kalibratoren (stiplet linje). Den relative ekspression af målgenet blev beregnet ved 2

-ΔΔCt. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, RNase-MV’er vs. MV’er; (D) HGF farvning på tumor sektioner. Der var en betydelig intensivering af HGF farvning på tumor sektioner i fastsættelsen af ​​MV’er sammenlignet med RNase-MV’er eller kontrol; (E) (F) Gel fotografi og densitometrisk analyse af HGF og c-MET proteinekspression i tumorvæv. MV’er stærkt induceret HGF protein-ekspression i tumorvæv. Som

in vitro

, forbehandling med RNase ophævede den induktive effekt. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

. 0,05, RNase-MV’er vs. MV’er

In vitro

, c-Met-hæmmer ophæver aktiveringen af ​​AKT og ERK1 /2 signalering i 786-0 celler og cellevækst induceret af MV’er

som

in vivo

MVS førte til en markant aktivering af AKT og ERK1 /2 signalering i 786-0 celler efter 48 h inkubation (fig. 6A og 6B). Til verifikation af sammenslutningen af ​​HGF induktion med aktivering af AKT og ERK1 /2, blev c-Met-hæmmer tilføjes blokere HGF /c-Met signalvejen. Af interesse, med tilsætning af c-Met inhibitor, aktivering af AKT og ERK1 /2 signalering induceret af MV’er var væsentligt forfejlet (fig. 6A og 6B), hvilket viser, at HGF-induktion er en af ​​de kritiske bidragydere til aktivering af AKT og ERK1 /2 signalering. Endvidere c-Met inhibitor væsentligt retarderet tumorcellevækst stimuleret af MV’er som vist ved CCK-8 (fig. 6C).

(A) (B) Gel fotografi og densitometrisk analyse af p-AKT og p- ERK1 /2 proteinekspression i 786-0 celler. MV’er førte til markante fosforylering af AKT og ERK1 /2 proteiner efter 48 timers inkubation med 786-0 celler, afskaffet ved c-Met-hæmmer. Densiteten af ​​hvert bånd blev bestemt. Værdier i grafen er udtrykt som densitometridata forhold mellem p-AKT /β-actin, p-ERK1 /2 /β-actin som foldes over kontrol (stiplet linje). *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, MVS + c-Met inhibitor vs. MV’er;

×

P

0,05, c-Met-inhibitor vs. kontrol; (C) CCK-8 Assay. Efter 48 timers inkubation med 786-0 celler, tilsætning af c-Met inhibitor stærkt retarderet cellevækst induceret af MV’er. *

P

0,01 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, MVS + c-Met inhibitor vs. MV’er;

×

P

. 0,05, c-Met-hæmmer vs. kontrol

Mediet betinget af HWJ-MSC har en lignende pro-tumor effekt som MV’er både

in vivo

in vitro

i modsætning til at styre, den konditioneret medium (CM) af HWJ-MSC’er førte til tidligere tumor forekomst og større tumorstørrelse (fig. 7A og 7B). CCK-8 Assay afslørede også, at CM høj grad accelereret væksten af ​​786-0 celler som

in vivo

(fig. 7C). På baggrund af disse resultater, sikrer vi, at MV’er er en af ​​afgørende effektorer af HWJ-MSC. At udforske de virkningsmekanismer af MV’er kan støtte i at afsløre, hvordan HWJ-MSC udøve den pro-tumor effekt på RCC.

(A) Tumor incidens. Der var en højere tumorincidensen i nøgne mus behandlet med CM eller MV’er sammenlignet med kontrol; (B) Tumorvolumen. I modsætning til kontrol, CM eller MV’er førte til udviklingen af ​​en større tumor i nøgne mus. *

P

0,05 MVS vs. kontrol;

#

P

0,05, CM vs. kontrol; (C) CCK-8 Assay. Efter 48 timers inkubation med 786-0 celler, CM eller MV’er høj grad fremmet tumorcellevækst. *

P

0,01 MVS vs. kontrol;

#

P

0,01, CM vs. kontrol

Diskussion

Funktionen af ​​MV’er som nye formidlere på celle-til-celle kommunikation. er blevet påvist i adskillige undersøgelser [27] – [29]. En horisontal overførsel af funktionelle mRNA’er og mi-RNA’er via MV’er er involveret i genetisk udveksling mellem celler [30] – [32]. Den genetiske information overføres af MV’er er den vigtigste effektor af funktionelle og pheno-typiske forandringer i modtagerlandene celler [27], [30], [33]. I dyremodeller af nyreskade, MV’er efterligner den gavnlige effekt af MSC. Følgelig MVS frigives af MSC’er kan være en kritisk bidragyder til deres pro- eller anti-tumor egenskaber. At udforske den molekylære ændringer i tumorceller fremkaldt af MV’er gør favor til videregivelse af essensen af ​​MSC ‘handling.

Nogle forskere har rapporteret, at MV’er stammer fra humane MSC’er udøve anti-tumor effekt i

i vivo

in vitro

eksperimentel indstilling [34], [35]. I vores tidligere undersøgelse, MV’er frigivet af HWJ-MSC’er forhindrede også blære tumorcellevækst. RCC er en anden almindelig urologiske tumor. Vi var meget nysgerrig indvirkning MV’er på denne tumor. In vitro og in vivo forsøg blev udført for at løse dette problem.

Vi held isolerede MV’er fra HWJ-MSC’er ‘supernatant og karakteriseret dem. MV’er var sammensat af heterogen lipide dobbeltlag vesikler i området fra 30-500 nm og udtrykt CD9, CD29, CD44, CD63, CD73 og CD105. MV’er var rig på RNA (1,8 ± 0,3 ug RNA /mg protein) og RNase forbehandling næsten fuldstændigt ( 90%). Destrueret RNA indhold

Ved brug af forskellige metoder, vi gjorde det klart indflydelse MV’er på væksten af ​​RCC.

In vitro

MVS fremmer væksten af ​​786-0 som det fremgår af CCK-8 assay. I nærvær af MV’er, dannelse af RCC tumor var hurtigere mens tumorstørrelsen var større. Desuden var der flere prolifererende tumorceller og færre celler i apoptose på histologisk undersøgelse. Ændringen af ​​cellens cyklus udløst af MV’er blev også bestemt. MV’er førte til akkumulering af 786-0 celler primært i S-fasen i stedet G0 /G1-fasen.

In vivo

, cyklin D1 proteinekspression i tumorvæv var også i høj grad opreguleret. Cyclin D1, som en kritisk mediator, er involveret i overgang cellecyklus fra G1 til S-fasen [36]. Det er tænkeligt, at MV’er fremme RCC vækst gennem lettelse af tumor cellecyklusprogression. Et lignende fænomen er også observeret i visse dyremodeller for akut nyre- eller leverskade. Administration af MV’er frigivet fra stamceller inducerer en cellecyklus genindførsel af tilskadekomne epitelceller via aktivering af regenerative programmer [37] -. [40]

På den anden side, fandt vi, at MV’er favorisere RCC invasion.