PLoS ONE: G4-DNA Formation i HRAS arrangøren og Rationel Design af Decoy Oligonukleotider for Cancer Therapy

Abstrakte

HRAS

er en proto-onkogen involveret i tumorigenese af urinblæren kræft. I

HRAS

promotor identificerede vi to G-rige elementer,

hras

-1 og

hras

-2, at fold, henholdsvis i en antiparallel og en parallel quadruplex (

qhras

-1,

qhras

-2). Når vi introducerede i rækkefølge

hras

-1 eller

hras

-2 to punktmutationer, der blokerer quadruplex dannelse, transskription steg 5 gange, men da vi stabiliserede G-quadruplexes ved guanidinium phthalocyaniner, transkription faldet til 20% af kontrollen. Af Chip fandt vi, at sekvens

hras

-1 kun er bundet af MAZ, mens

hras

-2 er bundet af MAZ og Sp1: to transkriptionsfaktorer genkender guanin bokse. Vi har også opdaget af EMSA, at rekombinant MAZ-GST binder til både

HRAS

quadruplexes, mens Sp1-GST kun binder sig til

qhras

-1. Den overekspression af MAZ og Sp1 synergistisk aktiverer

HRAS

transskription, mens tavshed hvert gen af ​​RNAi resulterer i en stærk nedregulering af transskription. Alle disse data viser, at

HRAS

G-quadruplexes opfører sig som transskription repressorer. Endelig har vi designet lokkefugle oligonukleotider efterligner den

HRAS

quadruplexes, idet (R) -1-O- [4- (1-Pyrenylethynyl) phenylmethyl] glycerol og LNA ændringer for at øge deres stabilitet og nukleaseresistens (G4- lokkefugle). G4-lokkefugle undertrykt

HRAS

transskription og forårsagede en stærk antiproliferativ effekt, medieret af apoptose, i T24 blære cancerceller hvor

HRAS

er muteret

Henvisning:. Membrino A , Cogoi S, Pedersen EB, Xodo LE (2011) G4-DNA Formation i

HRAS

Arrangøren og Rationel design af Decoy Oligonukleotider for Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24421. doi: 10,1371 /journal.pone.0024421

Redaktør: Mark Isalan, Center for Genomic forordning, Spanien

Modtaget: Juni 3, 2011; Accepteret: August 9, 2011; Udgivet: 8 September, 2011

Copyright: © 2011 Membrino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AIRC 2010 “Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuscruipt

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ras genet familie består af tre funktionelle proto-onkogener (

HRAS

,

NTM

og

KRAS

) der koder for guanin proteiner deler en høj homologi (p21

RAS) [1]. Disse proteiner, som ligger på den indre cellemembran gennem en farnesylgruppe [2], er aktive, når de er bundet til GTP, og inaktive, når GTP hydrolyseres til BNP [3]. Ras-proteiner regulerer cellulære reaktioner på mange ekstracellulære stimuli, herunder mitogener og differentieringsfaktorer [4]. De ras generne udtrykkes i et væv-specifik måde:

HRAS

er stærkt udtrykt i hud og skelet muskler,

KRAS

i tyktarmen og thymus og

NTM

i mandlige germinale væv [1]. Ras gener har tilsvarende strukturer og sekvenser med fem exoner, hvoraf den første er ikke-kodende, og konserverede splejsningssteder. Intronerne, i stedet, har forskellige længder og sekvenser [1]. Ras proto-onkogener omdannes til onkogener ved punktmutationer, der reducerer kapaciteten af ​​det kodede protein for at hydrolysere GTP til GDP, med det resultat, at p21

RAS forbliver konstitutivt aktiv. Hyperaktiveret ras-proteiner stimulerer phosphorylering kaskader herunder Raf /MEK /ERK pathway, som fører til ukontrolleret celleproliferation [5], [6]. Mutationer i ras-gener findes hyppigt i mange humane tumorer [7], [8].

HRAS

mutationer er mindre almindelige, men de har en høj forekomst i huden papillomer og urinblæretumorer [9]. Som 80% af blæretumorer havnen

HRAS

mutationer [10] og mere end halvdelen af ​​blæretumorer overekspression

HRAS

[11], både mutation og overekspression er vigtige faktorer i tumorigenese for blærekræft [12]. Faktisk er det blevet for nylig vist, at lav-niveau udtryk for konstitutivt aktiv

HRAS

inducerede simpel urotelial hyperplasi, mens en fordobling af den aktiverede

HRAS

onkogen udløste hurtigt voksende og gennemtrængende tumorer i hele urin tarmkanalen. I betragtning af den afgørende rolle, som

HRAS

overekspression og mutationer i tumorigenese for blærekræft, kunne man attraktiv terapeutisk strategi være at hæmme

HRAS

transskription med molekyler, der er i stand til at påvirke aktiviteten af ​​genet promotoren. Til dette mål vi spurgte, hvordan

HRAS

transskription reguleres. Vi observerede, at promotoren for

HRAS

indeholder talrige kopier af GGGCGGG element eller dens komplement. Dette G-box er blevet vist at interagere med Sp1 transkriptionsfaktor [13], [14]. Opstrøms for transkriptionsstartsitet (TSS) er der løber af guaniner spænder over tre Sp1 sites, som er potentielle steder for G-quadruplex formation. Vores hypotese således at G-rige elementer kunne spille en rolle i transskription regulering. G4-DNA er usædvanlige strukturer stabiliseret af plane arrays af fire guaniner (G-kvartet) i tilknytning til hinanden ved Hoogsteen hydrogenbindinger [15]. Kanterne af de terminale G-kvartetter er forbundet af løkker, der kan variere i både længde og topologi, hvilket giver anledning til en række forskellige konformationer [16]. Genom-dækkende analyser har vist, at kørsler af guaniner er rigelige i gen-promotorregioner omgivende TSS [17] – [20]. Det er blevet teoretiseret derfor, at G4-DNA kan være involveret i transkription regulering [21] – [25]. Vores undersøgelse giver overbevisende dokumentation for, at

HRAS

transskription reguleres af samspillet mellem Sp1, MAZ og G4-DNA, der fungerer som en transskription repressor. På grundlag af denne opdagelse har vi designet G-rige oligonukleotider specifikke for

HRAS

som har en stærk antiproliferativ virkning i urin cancerceller, der bærer en mutant

HRAS

. Selv om cytotoksicitet af visse G-rige oligonukleotider er tidligere blevet rapporteret, deres virkningsmekanisme er endnu ikke fuldt forstået [26], [27]. Vores undersøgelse viser, at de designede quadruplex-dannende oligonukleotider kan virke ved sekvestrering MAZ og dermed skader

HRAS

transskription. For deres potente antiproliferativ virkning i T24 urinblære kræftceller, G4-lokkedyr synes at være meget lovende effektor lægemidler til urinblæren kræftbehandling.

Resultater

HRAS

promotor er strukturelt polymorf

promotor af den menneskelige

HRAS

gen mangler typiske TATA og CAAT kasser, indeholder en høj G + C-indhold (80%) og flere kopier af GGGCGGG (G-box) , anerkendt af transskription faktor Sp1 [13], [14]. De tre G-bokse tættest på RNA start- sites overlapper quadruplex-dannende sekvenser, nemlig

hras

-1 (435-462, tiltrædelse nummer J00277) og

hras

-2 (506-530 , J00277) (figur 1). Ifølge en nylig undersøgelse, quadruplex-dannende sekvenser dækker Sp1 bindende elementer er til stede i flere gener [28]. Vi har opnået en første antydning af, at den

HRAS

promotor er strukturelt polymorf mens sekventering ekspressionsvektoreme specielt konstrueret til denne undersøgelse. Når sekventering primer-forlængelse blev udført med primere komplementære til G-rige streng, Taq polymerase uventet anholdt på

hras

-2 eller

hras

-1 G-rige elementer. I modsætning hertil med primere komplementære til de C-rige streng vi ikke observere nogen hindring. Dette antydede, at både

hras

-1 og

hras

-2 sekvenser dannede usædvanlige strukturer. Vores hypotese blev bekræftet ved polymerase-stop-assays. Vi har designet to lineært vildtype-skabeloner indeholder

hras

-1 eller

hras

-2 og en mutant skabelon, hvor fire G → T mutationer blev indført i

hras

– 2 for at forhindre quadruplex formation. Primer-forlængelse reaktioner viste, at Taq-polymerase i nærværelse af kalium arresteret i 3′-enden af ​​

hras

-2 eller

hras

-1, lige før den første kørsel af guaniner i overensstemmelse med dannelsen af ​​en G-quadruplex struktur af hver G-rige element (figur S1)

To G-rige elementer (

hras

-1 og

hras

. – 2) lokaliseret opstrøms for transkriptionsstartstedet kan potentielt folde til G-quadruplex strukturer. De quadruplex-dannende G-rige elementer indeholder bindingssteder for transkriptionsfaktorer MAZ og Sp1.

Promotorsekvenser

hras

-1 og

hras

-2 danne stabile G4-DNA-strukturer in vitro

En indsigt i G-quadruplexes dannet af

HRAS

G-rige elementer blev opnået ved DMS-fodaftryk, cirkulær dikroisme (CD) og fluorescens resonans (FRET) -forsøg. Figur 2 viser de opnåede resultater med sekvens

hras

-1. DMS-fodspor af 27-mer

hras

-1 i vand eller buffer indeholdende 100 mM Li

+ eller CS

+ (bane 1, 4, 5) viser, at alle guaniner reagerer med DMS . I stedet i nærvær af 50, 100 eller 140 mM KCI (bane 2, 3, 9), de guaniner af G-kører A-D gradvis beskyttet, mens guaniner G8 og G14 i mellemtiden “TTGC” og “CGCA “sekvenser ikke. Denne spaltning mønster tyder på, at

hras

-1 foldes til en G-quadruplex (

qhras

-1). I nærvær af 50 nM TMPyP4,

hras

-1 giver et stærkt fodaftryk enten ved lav (1 mM) eller høj (100 mM) KCI koncentration (bane 7, 8) [29]. Som forventet, mutant sekvens

h1-mut

, idet

hras

-1 med fire G → T mutationer, afskaffe foldning, ikke giver nogen fodaftryk. For at bestemme streng orientering af

qhras

-1 vi brugte CD (Figur 2c, d). CD-spektret af

qhras

-1 i 100 mM KCl er kendetegnet ved positive og negative ellipticities ved 287 og 260 nm, typisk for en antiparallel konformation [30]. Opvarmning af prøven vi opnåede en smeltekurve (287 nm ellipseform

versus

temperatur), som ikke var helt overlejres med kølekarakteristikken, som først var lidt tofaset mens den anden var monofasiske. En mere følsom analysemetode blev opnået ved FRET-smeltende eksperimenter med sekvens

hras

-1 endemærket med FAM og TAMRA ved 5 og 3′-enden, henholdsvis. Vi opnåede en godt løst bifasisk smeltende kurve med

T

M s ved 53 og 67 ° C angiver, at

hras

-1 folder i mindst to quadruplexes (Figur 2e). Når koncentrationen af ​​

hras

-1 blev øget en størrelsesorden fra 200 nM til 2 uM,

T

M blev ikke ændret: en adfærd er typisk for en intramolekylær struktur ( ikke vist). Tilsammen antyder disse data at

hras

-1 vedtager en antiparallel quadruplex der kunne antage forskellige topologier: den ene med laterale loops er vist i fig 2f [16]. Selvom vi ved, ved footprinting og cd-data de guaniner, der er involveret i dannelsen af ​​antiparallelle

qhras

-1, et indblik i strukturen af ​​denne quadruplex vil kun opnås ved NMR. Figur 3 viser de opnåede resultater med sekvens

hras

-2. DMS-fodspor af 24-mer

hras

-2 viser, at i 10, 50, 100 og 140 mM KCl (bane 2-5), G-kører A-D er beskyttet mod DMS, mens G10 , G12, G13, G21 og G22 reagere med DMS. Dette indikerer, at guanin triader danner quadruplex bør være G3-G4-G5, G7-G8-G9, G14-G15-G16, G18-G19-G20. Det faktum, at G16 viser nogle reaktivitet til DMS tyder på, at pentaguanine G12-G16 strækning kan deltage til quadruplex enten med G14-G15-G16 eller med G13-G14-G15. Mutant

h2-mut

sekvens og vildtype

hras

-2 i 100 mM Li

+ eller Cs

+ gav ikke nogen fodaftryk (bane 6-8). Den fodaftryk i nærvær af 50 nM TMPyP4 er meget stærk (bane 9, 10). CD-spektret af

hras

-2 viser en stærk ellipticitet ved 260 nm, der indikerer en G-quadruplex med en parallel konformation (figur 3c) [30]. Denne struktur er så stabil, at cd ved 85 ° C stadig viser en intens 260 nm ellipseform. Stabiliteten ved forskellige KCl-koncentrationer blev bestemt med sekvens

hras

-2 mærket med FAM og TAMRA. Vi udførte FRET-smeltende eksperimenter ved 20, 40, 60, 100 og 140 mM KCl og opnåede

T

M værdier på 78 for, 82 85, 90 og 92 ° C, henholdsvis (figur 3d). I dette tilfælde, også,

T

M blev ikke ændret, når koncentrationen blev forøget en størrelsesorden (fra 200 nM til 2 uM) (ikke vist). Samlet set vores data viser, at

hras

-2 danner en parallel G-quadruplex (

qhras

-2), hvis formodede struktur udledes af DMS-fodaftryk og CD skal have enten 1/1/4 eller 1/2/3 sløjfer (figur 3e). En endelig struktur opgave vil kun være muligt på grundlag af NMR-data.

(a) Wild-type (

hras

-1) og muteret (

h1-mut

) sekvenser analyseret af DMS-fodaftryk. Fuld firkanter indikerer DMS-reaktive guaniner, åbne firkanter angiver DMS-reaktive guaniner; (B) DMS-fodaftryk af

hras

-1 i vand (bane 1);

hras Salg -1 i 50 og 100 mM KCI (bane 2 og 3);

hras

-1 i 100 mM CsCI eller LiCI (bane 4 og 5);

h1-mut

i 100 mM KCl (bane 6);

hras

-1 i 50 mM TMPyP4, 1 mM KCl (bane 7);

hras

-1 i 50 mM TMPyP4, 100 mM KCI (bane 8);

hras

-1 i 140 mM KCl (bane 9);

h1-mut

i 100 mM KCl (bane 10); (C) CD-spektre ved 25 og 90 ° C viser, at

hras

-1 folder ind i en antiparallel G-quadruplex; (D) Smeltning kurver for quadruplex

hras

-1 opnået plotte 287-nm ellipseform mod T. A

T

M på omkring 63 ° C blev opnået ved opvarmning og afkøling kurver ; (E) FRET-smeltende kurver quadruplex

hras

-1 mærket med FAM og TAMRA viser, at det kan foldes i to G-quadruplexes med

T

M på 53 og 67 ° C (.. Ex 475 nm, Em 520 nm); (F) Mulige konformationer for

hras

-1, baseret på fodaftryk og cd-data, er antiparallelle quadruplexes med laterale og laterale /diagonal sløjfer. Den quadruplex med laterale loops er vist i figuren.

(a) vildtype og muterede

hras

-2 sekvenser analyseret af DMS-fodaftryk. Fuld firkanter indikerer DMS-reaktive guaniner, åbne firkanter angiver DMS-reaktive guaniner; (B) DMS-fodaftryk af

hras

-2 i vand (bane 1);

hras

-2 i 1, 10, 50, 100 mM KCl (bane 2-5);

hras

-2 i 100 mM LiCl eller CsCl (baner 6,7);

h2-mut

i 100 mM KCI (bane 8);

hras

-2 i 50 nM TMPyP4, 1 mM KCl (bane 9);

hras

-2 i 50 nM TMPyP4, 100 mM KCl (bane 10). Guaniner G10, G12, G13 og G21, G22 spaltes mens de andre guaniner kan (kun G16 viser en lav reaktivitet). Mutant

h2-mut

viser ikke nogen fodaftryk i 100 mM KCI; (C) CD spektre af quadruplex

hras

-2 ved forskellige temperaturer mellem 25 og 90 ° C antyder dannelsen af ​​en antiparallelt G-quadruplex; (D) FRET-smeltning af quadruplex

hras

-2 ved 20, 40, 60, 100 og 140 mM KCl viser kun en overgang med T

M fra 78, 82, 85, 90, 92 ° C; (E) Mulig G-quadruplex struktur for

hras

-2, en parallel kropsbygning med 1/1/4 eller 1/2/3 loops, baseret på fodaftryk og cd-data.

G4-DNA destabiliserende punktmutationer i

hras

-1 og

hras

-2 kraftigt opregulere

HRAS

transskription

Som sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 er placeret umiddelbart opstrøms for transkriptionsstartsitet og formen

in vitro

stabile G-quadruplexes, vi spurgte, hvad der sker med

HRAS

transskription, når kapaciteten af ​​quadruplex dannelse af sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 afskaffes. For at løse dette punkt, vi konstrueret et plasmid, pHRAS-luc, der bærer ildflueluciferase drevet af

HRAS

promotor. Fra pHRAS-luc vi opnået ved steddirigeret mutagenese to mutant-plasmider: pHRAS-mut1 og pHRAS-mut2, hvor to guaniner i den anden og tredje G-tetrader af de formodede quadruplexes blev erstattet med thymin /cytosin eller thyminer (figur 4a) . Disse mutationer ophævede kapacitet sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 til at folde ind i en quadruplex (Figur S2). Vildtype og mutant plasmider blev co-transficeret i HeLa-celler med pRL-CMV, en vektor, der koder for

Renilla

luciferase. Otteogfyrre timer efter transfektion vi målte ildflue og

Renilla

luciferaser aktivitet i lysater af ubehandlede og behandlede celler. Resultaterne rapporteret i figur 4b viser, at blokering quadruplex dannelse forårsager en dramatisk forøgelse af ildflue-luciferase-ekspression, op til 5 gange sammenlignet med kontrollen. Dette indikerer kraftigt, at G-quadruplexes dannet af sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 er strukturelle elementer af

HRAS

promotor, opfører sig som repressorer, som observeret for

CMYC

gen [21]

(a) To G4-DNA destabiliserende punktmutationer i

hras

-1 eller

hras

. – 2 element er blevet indført. Plasmid pHRAS-mut1 indeholder en muteret

hras

-1 element, mens plasmid pHRAS-Mut2 indeholder en muteret

hras

-2 element; (B) Dual luciferase assay viser, at punktmutationer forårsage op til en 5-fold stigning i

HRAS

promotor-aktivitet (se figur 5 legende).

G4-DNA stabiliserende guanidinium phthalocyaniner undertrykke

HRAS

transskription

da quadruplex DNA opfører sig som en repressor element for

HRAS

undersøgte vi effekten på transskription af G4-DNA stabiliserende ligander. På grund af deres specificitet for G4-DNA, i vores eksperimenter vi bruges som ligander modificerede phthalocyaniner: tetrakis- (diisopropyl-guanidin) phthalocyanin (DIGP) og dens Zn-holdige derivat Zn-DIGP (figur 5a) [31] – [33] . HeLa-celler blev først behandlet med 1 eller 5 uM DIGP eller Zn-DIGP i 24 timer og derefter co-transficeret med en blanding af pHRAS-luc og pRL-CMV. Efter transfektion blev cellerne lade vokse i 48 timer før ildflue og

Renilla

luciferaser aktivitet blev målt med et luminometer. Som en kontrol (i) vi behandlet cellerne med TMPyP2, et porphyrin, der ikke binder til G4-DNA [34]; (Ii) vi bruges som en reporter vektor pHRAS-mut1 eller pHRAS-mut2 bærer en muteret G-element i stand til at danne en quadruplex struktur. Figur 5b, c, d viser, at DIGP og Zn-DIGP kraftigt inhiberer luciferase fra vildtype pHRAS-luc, mens TMPyP2 ikke. Hertil kommer, at de phthalocyaninerne ikke hæmme luciferase i cellerne behandlet med mutant plasmider pHRAS-mut1 eller pHRAS-Mut2, i overensstemmelse med det faktum, at G-quadruplexes ikke kan dannes ved disse vektorer. Disse data giver yderligere bevis, at quadruplexes

qhras

-1 og

qhras

-2 fungere som transskription repressorer.

(a) struktur tetrakis- (diisopropyl-guanidin) phthalocyanin (DIGP), der anvendes, med sin Zn-holdige analog Zn-DIGP, for luciferase eksperimenter; (B) Dual luciferaseassays viser, at guanidinium phthalocyaniner DIGP og Zn-DIGP, stabiliserende

hras

-1 og

hras

-2 quadruplexes, undertrykke

HRAS

promotor-aktivitet. Denne effekt er ikke observeret med mutant plasmider pHRAS-Mut1 og pHRAS-Mut2 (kontrol) (paneler c og d). Relativ luciferase er givet ved R

T /R

NT × 100, hvor R

T og R

NT er (ildflueluciferase) /(

Renilla

luciferase) i T24 celler behandlet med phthalocyaniner og ubehandlede celler. Forskelle fra kontrollen understøttes af Students

t

test, P 0,05 (én stjerne), P. 0,01 (to stjerner)

Transskription faktorer Sp1 og MAZ binder til quadruplex danner sekvenser (QFS)

hras

-1 og

hras

-2

som vores transskription data tyder på, at begge sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 er kritiske for transskription, vi spurgte, om de er anerkendt af nukleare proteiner. Et svar på dette spørgsmål blev opnået ved mobilitet-shift assays med en HeLa nukleare ekstrakt. Figur 6a viser, at både

HRAS

dobbelthuse formular med en HeLa nukleare ekstrakt adskilte DNA-protein komplekser, hvilket påpege relevansen af ​​disse sekvenser for

HRAS

transskription. Ishii

et al.

Viste, at sekvens

hras

-2, som indeholder to kopier af GGGCGGG, er bundet af Sp1 [13], [14]. Men sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 bør også interagere med myc tilhørende zink-finger transskription faktor (MAZ), dets bindingssted være (G /C) GG (C /A) GGG [35], [36]. Faktisk er det blevet rapporteret, at MAZ og Sp1 ofte regulerer transkription i en kooperativ måde [37], [38].

(a) EMSA viser dannelsen af ​​DNA-proteinkomplekser mellem duplekser

hras

-1 og

hras

-2 og HeLa nukleare ekstrakt; mængder af ekstrakt benyttes (ug) er angivet, radiomærket DNA var omkring 4 nM. Bogstaverne a, b og c angiver DNA-proteinkomplekser; (B) kromatin immunofældning analyse viser interaktionen af ​​MAZ og Sp1 med sekvenser

hras

-1 og

hras

-2. Samspillet mellem MAZ og Sp1 med

HRAS

sekvenser blev analyseret ved en PCR-amplifikation af 190 bp (

hras

-1) og 161 bp (

hras

-2) fragmenter. De to bands til komplekse MAZ:hras-1 er blevet opnået i nærvær og fravær af Mg

2+ i blandingen (c) EMSA viser bindingen af ​​MAZ-GST og Sp1-GST til quadruplexes

qhras

-1 og

qhras

-2.

for at bevise, at Sp1 og MAZ binder til sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 under

in vivo

betingelser, vi udførte kromatin immunofældning (chip) eksperimenter. Living HeLa-celler blev behandlet med formaldehyd at tværbinde DNA-proteinkomplekser blev kromatin klippet i fragmenter og derefter immunpræcipiteret med anti-MAZ og anti-Sp1-antistoffer (Abs). Den overflod af

HRAS

promoter sekvenser i immunpræcipitaterne blev målt ved PCR ved anvendelse af primere specifikke for sekvenser

hras

-1 og

hras

-2. Resultaterne rapporteret i figur 6b viser, at: IgG Ab ikke immunfælde DNA-protein-komplekser, der indeholder sekvens

hras

-1 eller

hras

-2 (negativ kontrol); anti-MAZ Ab gjorde Immunpræcipitatet en DNA-proteinkompleks indeholdende

hras

-1 og

hras

-2; anti-Sp1 Ab trukket ned et kompleks med

hras

-2. Ved at måle intensiteten af ​​båndene, vi fandt, at

HRAS

sekvenser var mere rigelige i immunopræcipitater med anti-MAZ og anti SP1 Abs end i IgG Ab immunprecipitatet. Vi konkluderede således, at under

in vivo

betingelser MAZ er forbundet til sekvenser

hras

-1 og

hras

-2, mens Sp1 er forbundet til sekvens

hras

-2. Dette blev bekræftet af EMSA med rekombinant MAZ og Sp1 (figur S3). Som tidligere undersøgelser har vist, at MAZ binder til G4-DNA fra den murine

KRAS

[24] og

c-myb

[39] promotorer, vi undersøgt, om det også binder til

HRAS

quadruplexes. Vi udførte EMSA med rekombinant MAZ og Sp1, der blev udtrykt i

E. coli

som GST-fusionsproteiner (figur S4). Figur 6c viser, at ved pH 7,4, 50 mM KCI,

qhras

-1 og

qhras

-2 med stigende mængder af MAZ-GST formular – i overværelse af 100 gange overskydende nonradiolabelled poly d (IC) – to retarderede bånd på grund af dannelsen af ​​to DNA-proteinkomplekser, sandsynligvis med 1:01 og 1:02 støkiometri. Det er vigtigt at bemærke, at i 50 mM CsCI, hvor

HRAS

sekvenser er ustruktureret (se DMS footprinting), begge komplekser destabiliseret indikerer, at DNA-protein-interaktion medieres af quadruplex struktur. I en buffer ved pH 9, hvor MAZ sandsynligvis ændrer sin egen foldning DNA’et-protein-interaktion også inhiberes. Vi testede også bindingen af ​​Sp1-GST til

HRAS

quadruplexes og fandt, at Sp1-GST interagerer med antiparallelle

qhras

-1 quadruplex, men i en svagere måde i forhold til MAZ.

MAZ og Sp1 synergistisk aktivere

HRAS

transskription

For at bevise, at MAZ og Sp1 er involveret i

HRAS

transskription, vi co-transficerede plasmid pHRAS-luc i HeLa-celler enten med pMAZ (kodende for MAZ) eller pSp1 (kodende for SP1) eller med en blanding af begge plasmider (figur 7A). Når pMAZ eller pSp1 blev cotransficeret med reporter vektor, niveauet af luciferaseekspression steget med 50% sammenlignet med kontrol. Når både pMAZ og pSp1 blev cotransficeret med reporter vektor, transskription steget næsten 3 gange i løbet af kontrollen, hvilket indikerer, at begge proteiner synergistisk aktiveret

HRAS

promotor. Synergien var stærkere (7 gange sammenlignet med kontrol), når pMAZ og pSp1 blev cotransficeret med mutant vektor pHRAS-mut1 eller pHRAS-Mut2, bærende muteret

hras

-1 eller

hras

– 2 sekvenser, som er i stand til at danne quadruplex strukturer. Dette antyder, at transskription aktiveres, når sekvenser

hras

-1 og

hras

-2 er i udfoldet duplex kropsbygning. Desuden som bevis for, at transskription kræver, både MAZ og Sp1, vi bankede ned med Valideret shRNA hver af de to transkriptionsfaktorer separat (Figur S5). HeLa-celler blev behandlet med shRNA specifikt for MAZ eller Sp1 og niveauerne af

HRAS

transkripter blev målt ved real-time PCR, ved 48 og 72 timer efter behandling. Det kan ses, at

HRAS

transkription blev reduceret til 30 og 20% ​​af kontrol, 48 timer efter behandling med anti MAZ og anti Sp1 shRNA henholdsvis (figur 7b). Tilsammen vores data viser, at

HRAS

transskription aktiveres synergistisk af MAZ og Sp1.

(a) HeLa-celler transficeret med pHRAS-luc /pRL-CMV, pHRAS-luc /pRL-CMV /pMAZ; pHRAS-luc /pRL-CMV /pSp1; pHRAS-luc /pRL-CMV /pMAZ /pSp1. De dobbelte luciferase assays blev udført 24 timer efter transfektion. Relativ luminiscence er givet ved R

T /R

NT × 100, hvor R

NT er (ildflueluciferase) /(

Renilla

luciferase) i T24-celler behandlet med kun pHRAS-luc og pRL-CMV, mens R

T er (ildflueluciferase) /(

Renilla

luciferase) i T24 celler behandlet med pHRAS-luc + pMAZ og /eller pSp1 + pRL-CMV. Forskelle fra kontrollen understøttes af Students

t

test, P 0,05 (én stjerne), P 0,01 (to asterisk); (B) Niveau af

HRAS

afskrift i HeLa celler, hvor MAZ eller Sp1 blev slået ned af valideret shRNAs.

MAZ destabiliserer de

HRAS

G-quadruplexes

i betragtning af at MAZ er afgørende for

HRAS

transskription og anerkender

qhras

-1 og

qhras

-2, spurgte vi, om disse quadruplexes udfoldes af MAZ. For at besvare dette spørgsmål, vi udførte FRET-smeltende eksperimenter med rekombinant MAZ-GST. Quadruplex

qhras

-1 endemærket med FAM og TAMRA blev inkuberet i 50 mM KCI, i 30 minutter i nærværelse af stigende mængder af MAZ-GST eller kontrolprotein (BSA eller trypsinogen). De smeltende kurver (-dF /dT) viste, at

qhras

-1 alene smelter med sin typiske bifasisk profil med

T

M ved 53 og 67 ° C (figur 8a kurve 1 ). Men når

qhras

-1 blev inkuberet med MAZ-GST på (mol protein) /(mol DNA) forholdet R = 2,5, 5, 10 (kurverne 4, 5 og 6), smelteprofilen ændret betydeligt som

T

M s faldt til ~46 ° C. Dette indikerer, at både

qhras

-1 quadruplexes destabiliseres af MAZ-GST. Som forventet, uspecifikke proteiner såsom BSA eller trypsinogen ved r = 10 påvirkede ikke smeltning af

qhras

-1 (kurverne 2,3). På grund af sin høje stabilitet i kalium (

T

M = 78 ° C i 10 mM KCl),

qhras

-2 blev analyseret i 100 mM NaCl, hvor

T

M var 65 ° C. Inkuberet med MAZ-GST på r = 2,5, 5, 10, den quadruplex smeltede ved 42 ° C, hvilket indikerer, at også

qhras

-2 blev destabiliseret af MAZ-GST, men ikke af BSA eller trypsinogen. Vi konstaterede også, at GST ikke havde nogen indflydelse på smeltning af de

HRAS

quadruplexes (Figur S6B). En ekstra kontrol, som vi udføres for at udelukke, at bakterielle proteiner ikke bidrog til quadruplex destabilisering var at blande Glutathione Sepharose 4B harpiks med en ekstrakt opnået fra ikke-transformerede BL21 DE3 pLysS bakterier. En SDS-PAGE-analyse af eluatet med 10 mM reduceret glutathion viste, at ingen bakterielle proteiner bundet ikke-specifikt til harpiksen (figur S6A).

FRET-smeltende eksperiment viser, at i 50 mM KCI, MAZ-GST ved r = 2,5, 5 og 10 (r = [MAZ] /[G4-DNA]) (kurverne 4, 5 og 6) destabiliserer quadruplex

qhras

-1 i 50 mM KCI, 50 uM Zn-acetat [kurve 1 (panel a)] og quadruplex

qhras

-2 i 100 mM NaCl, 50 pM Zn-acetat [kurve 1, (panel b)]. BSA og TR (trypsinogen) ved r = 10 ikke har nogen effekt på

qhras

-1 og

qhras

-2 quadruplexes) (kurverne 2 og 3, paneler a og b); (C) Skematisk fremstilling af

HRAS

transskription regulering foreslået af denne undersøgelse. Når de kritiske promotorelementer

hras

-1 og

hras

-2 er foldet, de opfører sig som transskription repressorer. Dette antydes af, at quadruplex-destabiliserende punktmutationer i

hras

-1 og

hras

-2 resultat i en betydelig forøgelse af transskription, mens quadruplex-stabiliserende phthalocyaniner findes at undertrykke transskription . MAZ, gennem sin evne til at genkende quadruplex strukturer, bør rekrutteres til initiativtageren kritiske region. Den MAZ-DNA interaktion destabiliserer G-quadruplexes, den kritiske

hras

-1 og

hras

-2 elementer antager en duplex kropsbygning, der favoriserer bindingen af ​​Sp1 og andre proteiner af transskription maskiner . Disse begivenheder resulterer i aktiveringen af ​​transskription.

Vi blev overrasket over udfoldelsen aktivitet MAZ, da vi for nylig rapporteret, at MAZ stabiliserede det murine

KRAS

quadruplex [24]. Det bør dog erindres, at MAZ have seks zink fingre kan interagere med DNA i en kompleks måde, som observeret med qTBP42 og CBF-A [40], [41]. Disse proteiner forstyrre dimere quadruplex dannet af FMR1 d (CGG)

n repeat men også stabiliserer telomere quadruplex d (TTAGGG)

n. CBF-4 og qTBP42 har fire RNP-domæner, men kun to er involveret i G4-DNA-binding. Det er blevet påvist, at forskellige RNP kombinationer er ansvarlig for enten den stabiliserende eller destabiliserende aktivitet.

G4-DNA lokkefugle ODN’er efterligner

HRAS

quadruplexes hæmme transskription og cellevækst

i betragtning af at

HRAS

transskription aktiveres ved en kombineret virkning af MAZ og Sp1 og at

qhras

-1 og

qhras

-2 binder til MAZ (

qhras

-1 også binder sig til Sp1), vi designet en lokkedue strategi mod

HRAS

onkogen. Vi ræsonnerede, at disse oligonukleotider efterligner quadruplexes

qhras

-1 eller

qhras

-2 (G4-lokkefugle) bør lægge beslag MAZ og hæmmer

HRAS

transskription samt cellevækst ( Figur 8c).