PLoS ONE: Casticin forstærker TRAIL-induceret apoptose af mavekræft celler gennem endoplasmatisk reticulum Stress

Abstrakt

Baggrund

Casticin er en af ​​de vigtigste aktive komponenter opnået fra

Fructus Viticis

og er blevet rapporteret at udøve anti-carcinogen aktivitet på en række forskellige cancerceller, men den præcise mekanisme bag denne aktivitet er fortsat uklart.

Materialer og metoder Salg

Apoptotisk aktiviteter Casticin (1,0 pmol /l) og TRAIL (25, 50 ng /ml) alene eller i kombination i de gastriske cancercellelinier BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 blev detekteret ved anvendelse af en celle apoptose ELISA afsløring kit, flowcytometri ( FCM) med propidiumiodid (PI) farvning og aktiviteter af caspase-3, -8 og -9 ved ELISA og spaltning af PolyADP-ribose polymerase (PARP) protein under anvendelse western blot analyse. Dødsreceptorer (DR) ekspressionsniveauer blev vurderet ved anvendelse FCM analyse og western blotting. 2 ‘, 7’-dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) anvendt som en probe til at måle forøgelsen i reaktive oxygenarter (ROS) niveauer i celler. Flere indsatser, såsom siRNA transfektion og farmakologiske hæmmere blev brugt til at undersøge mekanismerne i disse handlinger.

Resultater

subtoxiske koncentrationer af Casticin betydeligt forstærkede TRAIL-induceret cytotoksicitet og apoptose i BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 celler. Casticin dramatisk opreguleres DR5 receptor udtryk, men havde ingen effekt på DR4 eller lokke receptorer. Sletning af DR5 af siRNA reducerede signifikant apoptose induceret af co-anvendelse af TRAIL og Casticin. Gene silencing af CCAAT /enhancer binding protein homologt protein (CHOP) og forbehandling med salubrinal, en endoplasmatisk reticulum (ER) stress-inhibitor, svækket Casticin-induceret DR5 receptor ekspression og apoptose og ROS-produktion. Casticin nedregulerede ekspressionsniveauerne af cellen overlevelse proteiner cFLIP, bcl-2, XIAP, og survivin. Desuden Casticin også inducerede udtrykkene for DR5 protein i andre gastrisk kræftceller (SGC-7901 og MGC-803).

Konklusion /Betydning

Casticin øger TRAIL-induceret apoptose gennem nedregulering af celle overlevelse proteiner og opregulering af DR5 receptorer gennem aktioner på ROS-ER stress-CHOP vej

Henvisning:. Zhou Y, Tian L, Long L, Quan M, Liu F, Cao J (2013) Casticin forstærker TRAIL-induceret apoptose af mavekræft celler gennem endoplasmatisk reticulum Stress. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10,1371 /journal.pone.0058855

Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juni 11, 2012; Accepteret: 8. februar 2013; Udgivet: 11 Mar 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af projekt NSFC (antal 30.760.248), projektet for Videnskabelig Forskning i Hunan-provinsen Administration Bureau of traditionel kinesisk medicin (nummer 2.010.081), projektet for Videnskabelig Forskning i Hunan-provinsen, Department of Education (antal 10C0975), major Projekt Item af videnskabelig forskning i Hunan-provinsen Department of Education (antal 09A054) og projekt Videnskabelig Forskning i Changsha City Bureau for Videnskab og Teknologi (antal K1104060-31). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Fructus Viticis

(

Manjingzi

er det kinesiske navn), nemlig frugten af ​​

Vitex trifolia L. Hotel (familie

Verbenaceae

) der er en traditionel kinesisk medicin anvendes som et anti-inflammatorisk middel. Casticin er en af ​​de aktive komponenter stammende fra

Fructus Viticis Salg [1]. Mange undersøgelser har vist, at Casticin udøver kræfthæmmende aktivitet i bryst- [2], cervikal [3], prostata [4], lunge- og coloncancer [5], [6], såvel som i gastrisk cancer [7]

in vitro

. Det er også blevet rapporteret, at Casticin hæmmer væksten af ​​humane myeloid leukæmi celler [8] og inducerer død af leukæmiceller ved induktion af enten apoptose eller en mitotisk katastrofe [9].

For nylig tidligere arbejde fra vores laboratorium viste, at virkningen af ​​Casticin på apoptose af humane hepatocellulære carcinomceller er involveret i DR5 pathway uafhængigt af status for p53 [10]. Det er dokumenteret, at CCAAT /forstærker bindende protein homologt protein (CHOP), også kendt som vækst anholdelse og DNA-skader gen 153 (GADD153), direkte regulerer DR5 udtryk gennem en CHOP bindingssted i det 5-flankerende region af DR5 genet [11], [12]. Vi, og andre, har rapporteret, at nogle medikamenter, såsom 5, 7-dimethoxyflavone og dimethyl-celecoxib, inducerer DR5 udtryk gennem CHOP-afhængig transaktivering af DR5 genet [13] – [15]. Desuden har flere undersøgelser vist en tæt sammenhæng mellem endoplasmatiske reticulum (ER) stress og DR5 udtryk. ER stress induceres i udfoldet proteiner ophobes i ER lumen [16]. Det lader til, at dette svar kan aktivere specifikke apoptotiske veje til at eliminere alvorligt beskadigede celler, hvor protein foldning fejl ikke kan løses [17], [18]. Forskellige ER stress induktorer som MG132 [12], tunicamycin [19] og thapsigargin [20], har konsekvent vist sig at inducere DR5 udtryk på celleoverflader. Selvom de molekylære mekanismer for DR5 proteinekspression ved ER stress-induktorer kan variere med stimuli og celletyper, ER stress-inducerbare transskription faktor, CHOP, har givet en sammenhæng mellem ER stress og DR5. Men om Casticin inducerer DR5 ekspression i gastriske cancerceller og i bekræftende fald, arten af ​​den molekylære mekanisme involveret er ukendt.

En nylig undersøgelse har vist, at en effektiv tumornekrosefaktor-α-relateret apoptoseinducerende ligand ( TRAIL) -baseret kombinationsbehandling kan opnås ved opregulering DR4 og DR5 ekspression, og gælder målretning tumor celle mitokondrier at stimulere deres apoptose-inducerende egenskaber [21]. Evne mitokondrier at mægle apoptose er stramt reguleret af medlemmer af Bcl-2 superfamilien [22]. Undertrykke anti-apoptotisk protein ekspression, med antisense-RNA eller siRNA, har vist sig at sensibilisere cancerceller for TRAIL [23]. Som et resultat, midler, som nedregulerer sådanne anti-apoptotiske proteiner som survivin, cellulære FADD-lignende interleukin-1β-omdannende enzym hæmmende protein (cFLIP), Bcl-2, og X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) kan potentielt sensibilisere kræft celler til de apoptotiske virkninger af TRAIL [23], [24].

i den foreliggende undersøgelse, derfor har vi fokuseret på at undersøge, om Casticin potenserer TRAIL-induceret kræft celle apoptose, og hvis ja, hvordan Casticin forstærker denne effekt. Vi fandt, at Casticin potenserede TRAIL-induceret apoptose ved opregulering DR5 gennem ROS-ER stress-CHOP-vejen og ved nedregulering af ekspressionen af ​​celle overlevelse proteiner Bcl-2, XIAP, cFLIP, og survivin i gastriske cancerceller.

Resultater

subtoxiske koncentrationer af Casticin selektivt øger TRAIL-induceret cytotoksicitet i mavens cancerceller

cytotoksicitet af Casticin og TRAIL, alene eller i kombination, blev undersøgt i humane gastrisk cancer linjer BGC- 823, SGC-7901 og MGC-803, som bestemt ved MTT-assayet. Casticin og TRAIL alene forårsagede cytotoksicitet af gastriske cancerceller, i en koncentrationsafhængig måde (figur 1A og B). Lidt til cytotoksicitet ( 20%) blev observeret ved en lavere koncentration af Casticin (1,0 pmol /l, figur 1A). Behandling af gastriske cancerceller med 25-50 ng /ml TRAIL i 24 timer inducerede begrænset cytotoksicitet ( 20%). Men samtidig behandling af gastriske cancerceller med Casticin (1,0 pmol /l) og TRAIL (25 ng /ml eller 50 ng /ml) markant øgede de cytotoksiske virkninger i forhold til behandling med Casticin eller TRAIL alene (figur 1C).

Virkninger af Casticin (a) og TRAIL (B) alene, eller en kombinationsbehandling af Casticin og TRAIL (C) på cytotoksiciteten af ​​BGC-823, SGC-7901, og MGC-803 celler (gennemsnit ± SD,

n

= 3).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P 0,05

vs. behandling med 1 pmol /l Casticin eller 25 ng /ml TRAIL eller behandling med TRAIL ved samme koncentration alene. Effekter af Casticin og TRAIL alene, eller en kombinationsbehandling af Casticin og TRAIL om cytotoksicitet GES-1 celler (D).

Fordi vi fandt, at den kombinerede behandling med Casticin og TRAIL stærkt induceret cytotoksicitet i gastriske kræftceller, vi næste undersøgt effekten af ​​behandling på immortaliseret human gastrisk mucosa epitelcellelinie GES-1. Interessant, har kombinationen af ​​Casticin og TRAIL fremprovokere cytotoksicitet i GES-1 celler (Figur 1D) .Disse resultater indikerer, at subtoxiske koncentrationer af Casticin selektivt sensibiliserede humane gastrisk kræftceller til Trail-induceret cytotoksicitet.

subtoxiske koncentrationer af Casticin bevidstgøre mavekræft celler til TRAIL-induceret apoptose

for at undersøge om apoptose er involveret i cellevækst hæmning efter samtidig behandling med Casticin og TRAIL, vi først undersøgt apoptose ved hjælp flowcytometrianalyse at opdage stigninger i hypodiploid celle populationer. Resultaterne viste, at antallet af apoptose var 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% og 37,1 ± 4,9% (gennemsnit ± SD,

n

= 3) for Casticin (1 pmol /l), TRAIL (50 ng /ml) og Casticin plus TRAIL henholdsvis (figur 2A). Sub-G1 population af BGC-823-celler var signifikant forøget ved 12 timer og toppede 24 timer efter forbehandling med 1 pmol /l Casticin efterfulgt af 50 ng /ml TRAIL (figur 2B). Vi næste fastsat de histon /DNA-fragment niveauer af gastrisk kræft cellelinjer BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 bruger celleapoptosen ELISA afsløring kit. Figur 2C illustrerer, at kombineret behandling af Casticin og TRAIL synergistisk induceret histon /DNA-fragmentering. De histon /DNA fragment niveauer af BGC-823 var forhøjet efter 12 timer og toppede 24 timer efter samtidig behandling med Casticin (1 pmol /l) og TRAIL (50 ng /ml, figur 2D).

Casticin forbedret TRAIL-induceret apoptotisk celledød måles ved hjælp af flow cytometrisk analyse (A og B), celle apoptosis ELISA påvisning kit (C og D) i BGC-823, SGC-7901, og MGC-803 celler (gennemsnit ± SD, n = 3 ).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO eller 0 h;

#

P 0,05

vs. behandling med 1 pmol /l Casticin eller TRAIL i samme koncentration alene i 6 timer. De enzymatiske aktiviteter af caspase-3 (E), -8 (F), og -9 (G) blev bestemt ved inkubering af 20 ug totalt protein med 200 pM kromogent substrat (Ac-DEVD-

s

NA eller Ac-IETD-

s

NA eller Ac-LEHD-

s

NA) i 100 pi assaybuffer i 2 timer ved 37 ° C. Frigivelsen af ​​chromophor

s

nitroanilid (

s

NA) blev overvåget af et spektrofotometer (405 nm). De viste data er middelværdier ± standardafvigelse (n = 3). *

s

0,01 vs. 0,1% DMSO; #

s

0,05 vs. behandling med Casticin og TRAIL alene. Spaltningen af ​​PARP blev undersøgt ved western blotting-analyse i BGC-823 og SGC-7901 celler (H).

Vi undersøgte derefter, om caspaser faktisk blev aktiveret under induktion af apoptotisk celledød ved den kombinerede behandling med Casticin og TRAIL i gastriske kræftceller. Behandling af gastic cancerceller med 1 pmol /L Casticin alene i 24 timer inducerede ikke nogen aktivitet af caspase-3, -8 og -9. Som svar på TRAIL (50 ng /ml), aktiviteterne i caspase-3, -8 og -9 ændrede sig ikke. Men den kombinerede behandling af Casticin og TRAIL inducerede aktivering af caspase-3 og -8 og lidt aktiverede caspase-9 (figur 2 E, F og G).

Vi har også undersøgt, hvilke caspase specifikt aktiveres i reaktion på Casticin og TRAIL behandling under anvendelse caspaseinhibitorer, herunder den pan-caspaseinhibitor zVAD-fmk, caspase-3 inhibitor zDEVD-fmk, caspase-8 inhibitor zIETD-fmk og caspase-9-inhibitor zLEHD-fmk. Som vist i figur 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk og zIETD-fmk faldt betydeligt aktivitetsniveauet af caspase-3 induceret af den kombinerede behandling af Casticin og TRAIL, men zLEHD-fmk havde en svag virkning. zVAD-fmk og zIETD-fmk kan samtidig fuldstændig blokere caspase-8-aktivering, og zDEVD-fmk delvist blokeret aktivering af caspase-8; imidlertid havde zLEHD-fmk lidt påvirke aktiveringstilstanden af ​​caspase-8 (figur 2F). Tilsvarende fandt vi, at caspase-9 let blev aktiveret i celler behandlet med Casticin og TRAIL men ikke i celler behandlet med Casticin og TRAIL i nærvær af z-IETD-fmk, zVAD-fmk og zLEHD-fmk (Figur 2G). Kollektivt antyder disse resultater, at Casticin med tilføjelse af TRAIL inducerer caspase-8-aktivering opstrøms for caspase-9-aktivering [10].

Vi endelig undersøgt, om Casticin kunne forbedre TRAIL-induceret PARP-spaltning og fandt, at Casticin forbedret TRAIL-induceret en stigning i PARP spaltning i BGC-823 og SGC-7901 celler (Figur 2H). Disse resultater indikerer kraftigt, at en subtoksisk koncentration af Casticin forbedrer TRAIL-induceret apoptose af gastriske cancerceller.

Casticin inducerer ekspressionen af ​​DR5 i gastriske cancerceller

apoptose af hepatocellulære carcinomceller induceret af Casticin var involveret i DR5 opregulering [10]. Derfor behandlede vi BGC-823-celler med Casticin i 24 timer og derefter anvendt Western blot-analyse for at undersøge cellerne for TRAIL receptor ekspression. Casticin steg DR5 ekspression i en koncentrationsafhængig måde, men havde ingen virkning på DR4-ekspression eller DcR1 eller DcR2 induktion (figur 3A). Induktion af DR5 ekspression ved Casticin forekom ved 6 timer og toppede efter 24 timer (figur 3B). Disse resultater antyder, at DR5 opregulering er kandidat mekanisme, gennem hvilken Casticin forøger de apoptotiske virkninger af TRAIL i BGC-823 celler.

Virkninger af Casticin på niveauet af TRAIL receptorekspression bestemt under anvendelse western blot (A og B) og cellen overfladiske DRs ved flow cytometrisk analyse (C og D) i BGC-823 celler. Effekter af Casticin på niveauerne af DR5 protein niveauer i SGC-7901, MGC-803 og GES-1-celler ved hjælp af Western blot analyse (E).

For at afgøre, om DR på celleoverfladen var involveret i induktionen af ​​apoptose ved Casticin blev celleoverfladeekspression af DR5 og DR4 observeret ved anvendelse af flowcytometri. Efter celle udsættelse for Casticin (1,0 pmol /l), blev niveauet af DR5 på celleoverfladen forøget (figur 3C). Men Casticin ikke påvirke størrelsen af ​​DR4-ekspression (figur 3D). Tilsammen indikerer disse resultater, at Casticin opregulerer ekspressionen af ​​DR5 på celleoverfladen.

Uanset om opregulering af DR5 ved Casticin er specifik for BGC-823-celler eller også forekommer i andre gastrisk cancer cellelinjer, blev også undersøgt. Casticin induceret DR5 udtryk i mavekræft SGC-7901 og MGC-803 cellelinjer, men havde ikke indlysende virkninger på sit udtryk i immortalisering gastrisk mucosa GES-1 cellelinje (figur 3E). Sammen disse resultater tyder på, at opregulering af DR5 ved Casticin er ikke specifik for en bestemt type mavekræft celle.

DR5 induktion ved Casticin kræves til forbedring af TRAIL-induceret apoptose i BGC-823 celler

for at fastlægge den rolle, DR5 receptorer i forøgelsen af ​​TRAIL-induceret apoptose ved Casticin, vi brugte siRNA specifikt til DR5 at nedregulere sit udtryk. Transfektion af celler med siRNA for DR5 men ikke med kontrol siRNA reduceret Casticin-induceret DR5 udtryk.

For at undersøge, om DR5 opregulering indebærer Casticin-forstærket TRAIL-induceret gastrisk celle apoptose, flowcytometrisk analyse blev anvendt til at undersøge, om suppression af DR5-ekspression ved siRNA kunne formindske virkningen af ​​Casticin på TRAIL-induceret apoptose. Figur 4B viser, at virkningen af ​​Casticin på TRAIL-induceret apoptose effektivt blev reduceret i celler transficeret med DR5 siRNA, hvorimod celler transficeret med kontrol siRNA var upåvirkede. Taget sammen indikerer disse resultater, at induktionen af ​​DR5 er kritisk for sensibilisering af tumorceller til virkningerne af Casticin i TRAIL-induceret apoptose.

aktion af siRNA for DR5, om virkningerne af Casticin-induceret DR5 ekspressionsniveauer (A) under anvendelse af western blot analyse og TRAIL-medieret apoptose (B).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P. 0,05

vs. behandling med 1 pmol /l Casticin plus 50 ng /ml TRAIL i kontrol- og scRNA transficerede celler

Casticin-induceret DR5 opregulering er medieret gennem induktion af CHOP i BGC-823 celler

CHOP-medieret opregulering af DR5 er blevet påvist [11] – [15]; derfor, vi næste undersøgt, hvordan denne transskription faktor kan være involveret i Casticin-induceret DR5 opregulering. Figur 5A viser, at Casticin induceret CHOP ekspression, som forekom parallelt med stigningen i DR5 ekspression.

Virkninger af siRNA for CHOP på virkningen af ​​Casticin-induceret DR5 og hak ekspression (A og B) under anvendelse af western blot analyse og TRAIL-medieret apoptose (C) i BGC-823-celler (gennemsnit ± SD,

n

= 3).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P. 0,05

vs. behandling med 1 pmol /l Casticin plus 50 ng /ml TRAIL i kontrol- og scRNA transficerede celler

For at teste rolle CHOP i Casticin-induceret opregulering af DR, blev gendæmpning af CHOP af siRNA anvendes. Transfektion med CHOP siRNA undertrykte signifikant Casticin-induceret DR5 opregulering (figur 5B), mens Casticin opreguleres ekspressionen af ​​DR5 i ikke-transficerede og kontrol-transficerede (krypteret RNA) celle.

Vi næste anvendes flowcytometrisk analyse til undersøge, om undertrykkelse af CHOP af siRNA svækket den allergifremkaldende effekt ved Casticin på TRAIL-induceret apoptose. Transfektion med CHOP siRNA væsentligt reduceret effekten (fra 37,1 ± 5,3% til 13,5 ± 1,3%, gennemsnit ± SD,

n

= 3) på Casticin plus TRAIL-induceret apoptose (figur 5C), mens behandling med kontrol siRNA ikke havde nogen virkning (figur 5C). Disse resultater indikerer, at CHOP er involveret i DR5 opregulering og bidrager til sensibiliserende effekt af Casticin på TRAIL-induceret apoptose i vores eksperimentelle model.

Casticin induceret endoplasmatiske reticulum (ER) stress i gastriske cancerceller

det er kendt, at eR inducerer eR stress markørproteiner (såsom GRP78 og phospho-eIF2α), som opregulerer ekspressionen af ​​CHOP [12], [19], [20]. I den foreliggende undersøgelse blev virkningen af ​​Casticin på ekspressionen af ​​ER stress markørproteiner undersøgt. Vores resultater viser, at Casticin rent faktisk inducerer alle disse markører for ER stress i BGC-823 celler (figur 6A). For at bestemme om ER stress er involveret i potensering af Casticin på apoptose induceret af TRAIL, salubrinal, en inhibitor af ER stress, blev anvendt. Salubrinal (50 pmol /l) signifikant beskyttede BGC-823 celler fra apoptose induceret af co-anvendelse af Casticin og TRAIL (figur 6B).

Virkninger af Casticin på ekspressionsniveauerne af ER stress associerede proteiner (A ) under anvendelse western blot analyse og TRAIL-medieret apoptose (B) i BGC-823-celler (gennemsnit ± SD,

n

= 3).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P 0,05

vs. behandling med. 1 pmol /l Casticin plus 50 ng /ml TRAIL i celler forbehandlet med 50 pmol /l salubrinal. Virkninger af tunicamycin på ekspressionsniveauerne af ER stress associerede proteiner (C) under anvendelse western blot analyse og TRAIL-medieret apoptose (D) i BGC-823-celler (gennemsnit ± SD,

n

= 3).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P. 0,05

vs. behandling med

Vi har også testet, om behandling af BGC-823 celler med det endoplasmatiske reticulum (ER) stress inducer, tunicamycin [25 ], kunne hæve DR5 proteinniveauer og forbedre TRAIL-induceret apoptotisk celledød. Vi fandt, at tunicamycin (3,0 mmol /l) tidsafhængigt øget protein niveauer af DR5, p-eIF2α, GRP78 og CHOP, i BGC-823 celler (figur 6C). Samtidig behandling med tunicamycin (3,0 pmol /l) og TRAIL (50 ng /ml) steg signifikant procentdelen af ​​celler i sub-G1-fasen, sammenlignet med tunicamycin eller TRAIL alene (figur 6D). Disse resultater understøtter den hypotese, at ER stress deltager i forstærkende virkning af Casticin på apoptose induceret af TRAIL.

Casticin-induceret DR5 opregulering og apoptose potensering er ROS-afhængige i BGC-823 celler

vi har for nylig vist, at 5, 7-dimethoxyflavone selektivt øger TRAIL-induceret apoptose ved ROS stimulerede ER-stress udløser CHOP-medieret DR5 opregulering i hepatocellulære carcinomceller [15]. Vi undersøgte således, om Casticin inducerer ROS-produktion. 2 ‘7’-dichlorofluorescein diacetat (DFCH-DA) blev anvendt som en probe til at måle en stigning i ROS-niveauer i celler. Tidsforløb eksperimenter afslørede, at niveauerne af ROS oprindeligt blev forøget ved

1 time, nåede en top ved 3 timer og varede i op til 24 timer efter behandling med 1,0 pmol /l Casticin (figur 7A). Casticin induceret ROS-produktion i en koncentrationsafhængig måde (figur 7B).

Virkninger af Casticin på ROS-generering (A og B) og virkningerne af NAC på Casticin-induceret DR5 og CHOP opregulering (C) under anvendelse vestlige blot-analyse og TRAIL-medieret apoptose (D) i BGC-823-celler (gennemsnit ± SD,

n

= 3).

*

P 0,05

vs. behandling med DMSO;

#

P. 0,05

vs. behandling med 1 pmol /l Casticin plus 50 ng /ml TRAIL i celler forbehandlet med NAC

For at dechifrere forholdet mellem ROS generation og CHOP-afhængig DR5 induktion, vi undersøgt, om ROS regulerer Casticin-inducerede TRAIL-receptorer og CHOP i nærvær og fravær af

N

-acetylcysteine ​​(NAC), som er en scavenger af oxygenfrie radikaler. Vi fandt, at forbehandling af celler med NAC reducerede Casticin-inducerede opregulering af DR5 og CHOP ekspression (figur 7C).

Dernæst undersøgte vi, hvorvidt ROS spiller en rolle i Casticin-inducerede TRAIL potensering. Som vist i figur 7D, Casticin signifikant forøget TRAIL-induceret apoptose i BGC-823 celler, og forbehandling af celler med NAC markant reduceret Casticin-induceret apoptotisk celledød forbedring fra 52,4 ± 3,3% til 8,2 ± 0,8%, (middel ± SD, n = 3) tyder på, at ROS spiller en kritisk rolle ved mediering af virkningerne af Casticin i TRAIL-induceret apoptose.

Casticin nedregulerer ekspressionen af ​​forskellige celleoverlevelsestilstande proteiner i BGC-823 celler

det er blevet rapporteret, at adskillige anti-apoptotiske proteiner, såsom survivin, cFLIP, XIAP, Bcl-2 og Bcl-xL kan regulere TRAIL-induceret apoptose [25], [26]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om visse identificerede celleoverlevelsestilstande proteiner var involveret i forstærkende virkning af Casticin på apoptose induceret af TRAIL. BGC-823 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af Casticin i 24 timer og derefter undersøgt for Bcl-xL, Bcl-2, survivin, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (cellulær inhibitor af apoptose protein 1) og TRAF1 (TNF-receptor-associeret faktor 1) udtryk. Casticin inhiberede Bd-XL, Bcl-2, survivin, cFLIP og XIAP-ekspression (figur 8A). Virkningerne af Casticin på ekspressionen af ​​Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP og cFLIP var dramatisk, mens nedregulering af CIAP-1 ikke var meget udtalt. Disse resultater antyder, at nedregulering af celleoverlevelsessignaler proteiner er en af ​​de mekanismer, der driver forstærkende virkning af Casticin på apoptose induceret af TRAIL. Salg

BGC-823 celler blev behandlet med Casticin i de angivne koncentrationer i 24 timer. Western blot-analyse blev anvendt til at bestemme ekspressionsniveauerne af anti-apoptose-proteiner (cFLIP, Bcl-2, XIAP, CIAP-1 og survivin) og pro-apoptose-proteiner (Bax og overtagelse). β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

Vi undersøgte derefter, om Casticin kunne modulere ekspressionen af ​​pro-apoptotiske proteiner. Vi fandt, at Casticin dramatisk opreguleres ekspressionen af ​​Bax i en koncentrationsafhængig måde (figur 8B). Casticin også øget spaltning af bud i en koncentrationsafhængig måde, som det fremgår af faldet af ekspressionen af ​​Bid-protein (figur 8B). Disse resultater antyder, at Casticin samtidig kan aktivere den iboende mitokondrier-medieret vej og den ydre DR-induceret vej som vist ved den trunkerede pro-apoptotisk protein Bid.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte evne Casticin, en polymethoxyflavone stammer fra

Fructus Viticis

, at modulere TRAIL signalering i gastriske kræftceller, og vores resultater tyder på, at Casticin potenserer TRAIL-induceret apoptose i mavekræft BGC-823, SGC-7901 og MGC-803 celler ved (1) induktion DR5 ekspression og (2) downregulatin af celleoverlevelsessignaler proteiner forbundet med tumorcelleresistens imod TRAIL. Casticin opregulering af DR5 synes at være medieret gennem aktivering af ROS-ER stress-CHOP pathway (figur 9).

Casticin oprindeligt fremmer ROS-generering og udløser ER stress, inducerer derefter DR5 opregulering gennem aktivering af CHOP som derefter øger TRAIL-induceret aktivering af DR5-induceret og mitokondrier-medieret apoptoseveje. Samtidig Casticin letter TRAIL-induceret apoptotisk celledød ved inhibering af anti-apoptose-proteinet (cFLIP, Bcl-2, survivin og XIAP) ekspression og aktivering af pro-apoptose proteiner.

Vi har vist, at Casticin induceret DR5 ekspression i gastriske cancerceller. Disse resultater er i overensstemmelse med de af vores tidligere arbejde [10], vi rapporterede, at den apoptotiske effekt af Casticin i humane hepatocellulært carcinom celler er involveret i DR5 opregulering, men de ikke behandle spørgsmålene om, hvorvidt Casticin kan forbedre TRAIL-induceret apoptose eller mekanismen for overfølsomhed. Her har vi vist, at DR5 opregulering er kritisk for sensibilisering af celler til TRAIL, som gendæmpning af receptoren (DR5) svækket TRAIL-induceret apoptose. Således kan DR5 opregulering sensibilisere celler til TRAIL-induceret apoptose [27]. Talrige mekanismer er blevet beskrevet for induktion af DR, herunder ROS-generering, p53 induktion, og NF-KB, DDIT3 (DNA beskadigelse-inducerbar transkript 3), peroxisom receptor-γ og MAPK-aktivering proliferator-aktiverede [27], [28] . I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at Casticin induceret CHOP og at gendæmpning af CHOP af siRNA blokeret virkningen af ​​Casticin på induktionen af ​​DRs og på TRAIL-induceret apoptose. Vores resultater svarer til dem af andre undersøgelser, der indikerede, at CHOP binder til DR5 promotoren og opregulerer denne receptor ekspression [12], [29].

Det er velkendt, at CHOP er en typisk ER stress-regulerede protein involveret i ER stress-induceret apoptose [11]. Vores fund af CHOP induktion ved Casticin tyder på, at Casticin kan udløse ER stress og øge ekspressionsniveauerne af GRP78 og eIF2α, som er ekstra proteiner akkumuleret eller forhøjet under ER stress [17]. Det synes derfor sandsynligt, at Casticin inducerer ER stress. Salubrinal er en selektiv inhibitor af ER stress-induceret apoptose [30]. Tilstedeværelsen af ​​salubrinal tilsyneladende beskyttet gastriske cancerceller fra Casticin plus TRAIL-induceret apoptose. Det ser således ud, at Casticin inducerer apoptose potensering ved at inddrage ER stress mekanismer.

Vi fandt, at den måske vigtigste opstrøms signal knyttet til Casticin modulation af TRAIL-receptorer er ROS. Vores resultater viser utvetydigt, at Casticin inducerede produktion af ROS, og at quenching af ROS ved antioxidanten

N

-acetylcysteine ​​svækkede virkningen af ​​Casticin på induktionen af ​​CHOP og DR5. Vi fandt, at quenching ROS også svækket Casticin potensering af TRAIL-induceret apoptose. Vores resultater er i overensstemmelse med dem, der rapporteres i tidligere undersøgelser ved hjælp af sulforaphane, zerumbone og celastrol for DR5 induktion. Resultater af nuværende og tidligere undersøgelser tyder kraftigt, at ROS spiller en stor rolle i modulering af TRAIL receptor DR5 [31], [32]. Vores resultater er i overensstemmelse med de af tidligere arbejde, rapporterede vi, at Casticin forårsagede ophobning af sub-G1 celler og forøget ROS produktion i HeLa, CaSki og SiHa cellelinier, men ikke i PBMC’er [33]. Men vi viste, at Casticin reducerede GSH indhold (

P 0,05

), men ikke påvirke niveauet for intracellulære ROS i PLC /PRF /5 og Hep G2-celler [10]. En plausibel forklaring på den tilsyneladende konflikt data er, at der er forskelle i modalitet, der regulerer handlinger i forskellige celletyper.

Vi identificerede også, at den anden mekanisme for sensibilisering indebærer reguleringen af ​​anti-apoptotiske proteiner. Casticin nedreguleret udtrykket elevels af Bcl-2, Bd-XL, XIAP og survivin, som alle er blevet knyttet til tumor celle modstand mod TRAIL [34], [35]. Faktisk nedregulering af XIAP, Bcl-2 og Bcl-XL-ekspression er blevet vist at sensibilisere tumorceller til TRAIL [36], [37]. Wang

et al.

(2005) [8], at Casticin faldt Bcl-2-ekspressionsniveauer og nedreguleret forholdet mellem Bcl-2 /Bax ekspression i K562-celler. Vores resultater er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viste, at en ethanol ekstrakt af den tørrede modne frugter af

kyskhedstræ

faldt niveauet af Bd-2, Bd-XL og Bid protein, og steg i niveau af Bax-protein [7]. Rapporten fra Chen

et al.

(2011) for nylig viste, at Bax blev opreguleret, mens ekspressionsniveauer af Bd-XL og XIAP blev nedreguleret ved Casticin [33].

Kobayakawa et al. rapporterede, at Casticin markant inhiberede væksten af ​​KB-celler, men ikke inhiberer proliferation af A431-celler, hvilket svarer til de normale cellelinier 3T3 Swiss Albino og TIG-103 [38]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at Casticin specifikt induceret apoptose i humane gastriske cancerceller, men ikke i GES-1-celler, selv om der ikke er fastlagt mekanismen for selektiv induktion af apoptose. Vores resultater antyder, at Casticin kan være et bestemt antitumormiddel med lav toksicitet.

Sammenfattende vores resultater viser, at Casticin bidrager til følsomheden af ​​tumorceller til trail ved at bruge flere mekanismer. Casticin oprindeligt fremmer ROS-generering og udløser ER stress derefter inducerer DR5 opregulering ved aktivering af CHOP der følgelig forøger TRAIL-induceret aktivering af DR5-induceret og mitokondrier-medieret apoptoseveje. Samtidig Casticin letter TRAIL-induceret apoptotisk celledød ved inhibering af anti-apoptose proteinekspression og aktivering af pro-apoptose proteiner. Fremtidige undersøgelser bør sigte fuldt ud at realisere potentialet i en kombination af Casticin og TRAIL terapi til behandling af patienter med mavekræft.