PLoS ONE: In Vivo Expression Mønster af glimmer og MICB og dens relevans til Auto-Immunitet og kræft

Abstrakt

Ikke-konventionel MHC klasse I MIC molekyler interagerer ikke med TCR, men med NKG2D, en C-type lektin aktiverende receptor til stede på de fleste NK, γδ og CD8

+ ap T-celler . Mens denne interaktion er kritisk i udløsning /kalibrere den cytotoksiske aktivitet af disse celler, det faktiske omfang af dens

in vivo

engagement, i mennesket, i infektion, kræft eller autoimmunitet, behov for yderligere vurdering. Sidstnævnte har taget fart sammen med den rapporterede udvidelse af perifere CD4

+ CD28

-NKG2D

+ T-celler i leddegigt (RA). Vi først indledt for at udvide denne rapport til en større kohorte af ikke kun RA-patienter, men også dem, der berøres af systemisk lupus erythematosus (SLE) og Sjögrens syndrom (SS). I RA og SS, blev denne første observation yderligere testet i målvæv: leddet og spytkirtlerne, hhv. Som konklusion og på trods af lejlighedsvise og vilkårlige udvidelse af den tidligere anklagede T-celle delpopulation, kunne observeres nogen sammenhæng mellem CD4

+ CD28

-NKG2D

+ og auto-immunitet. Desuden

in situ

, tilstedeværelsen af ​​NKG2D matches af CD8

+, men ikke fra CD4

+ T-celler. Parallelt hermed alt kropsvæv scanning af både

MICA

MICB

transkription tydeligt viser, at trods oprindelige formodninger, og med undtagelse af det centrale nervesystem, begge gener er almindeligt transkriberes og derfor muligvis oversat og membranbundne. Udvide denne analyse til en række humane tumorer afslørede ikke et sammenhængende mønster af ekspression vs. normale væv. Kollektivt disse data spørgsmålstegn tidligere antagelser, korrelere et væv-specifik ekspression /induktion af

MIC

i relevans for auto-immune eller tumor processer

Henvisning:. Schrambach S, Ardizzone M, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)

In Vivo

Expression Mønster af glimmer og MICB og dens relevans for autoimmunitet og kræft. PLoS ONE 2 (6): e518. doi: 10,1371 /journal.pone.0000518

Academic Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public-Santé, Luxembourg

Modtaget: 17. april, 2007; Accepteret: 7 maj 2007; Udgivet: 13 Jun 2007

Copyright: © 2007 Schrambach et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Université Louis Pasteur, den Hopitaux Universitaires de Strasbourg, foreningen française du Gougerot Sjögren et des syndromer sek, Ligue contre le Cancer, Foreningen pour la recherche sur le Cancer (ARC).

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cytotoksisk CD8

+ og hjælper CD4

+ αβ T-celler genkender konventionelle peptid-loaded hovedhistokompatibilitetskompleks (. MHC) klasse I og II-molekyler henholdsvis [1]. De førstnævnte interaktion fører til eliminering af viralt inficerede eller de tumorized målceller, sidstnævnte hjælper Amplify /regulere primært humorale immunrespons mod exo eller auto-antigener [2], [3]. Selv om denne lærebog definition af adaptive immunrespons er klare, virkelighedstro funktionelle /dysfunktionelle konsekvenser af disse interaktioner, sammenholdt med den anden, medfødte, skuespillere af immunitet, er langt fra enkel. Dette er måske bedst eksemplificeret i autoimmune reaktioner, hvor afhængig af sygdommen, arterne (human eller mus i det væsentlige), og den eksperimentelle model, har forskellige komponenter i immunsystemet er sekventielt sat i forgrunden, hvilket fører til den logiske antagelse at stort set alle aktører i immunsystemet er involveret enten i udløsning og /eller fortsættelse af sygdommen [4] – [6].

i modsætning til de ovennævnte konventionelle MHC-i-molekyler, MIC molekyler [7], [8] ikke interagerer med TCR

per se

men gør det med NKG2D, en C-type lectin aktiverende receptor udtrykt på NK, γδ og CD8

+ ap T-celler [9], [10 ]. Denne interaktion er blevet vist at over-ride inhiberende signal tilvejebragt af Killer inhiberende receptorer (KIR) og /eller CD94 /NKG2A /B molekyler, som afføler tilstedeværelsen af ​​henholdsvis HLA-ABC og -E på målceller. Mens på T-celler, NKG2D fungerer som en co-stimulerende molekyle [11], kan det aktivere NK-celler såvel som IL-15-aktiveret intraepiteliale T-lymfocytter i en TCR uafhængig måde [12]. MIC-NKG2D engagement menes at være således væsentlige eliminere inficerede celler og /eller tumorer [13], [14]. Hvorvidt dette samspil er også relevant i autoimmunitet er et spørgsmål om nyere vægt [15].

leddegigt (RA) er en arketypisk autoimmun sygdom, og som sådan genoptager vores nuværende viden og udfordringer med hensyn til autoimmunitet [16 ]. Et stort system af arbejde har givet efter for mange hypoteser om indledning og fortsættelse af sygdommen. Gennem tiden har T-celler eller B-celler er blevet anerkendt som de primære aktører i sygdommen. Det formodede vævsspecifik eller systemisk auto-antigen (er) hos mennesker stadig vanskeligt at definere, i modsætning til flere naturlige eller transgene /gen målrettet dyremodeller, hvor flere selv-antigener er blevet anerkendt til kunne iværksætte denne sygdom [17]. En af de seneste formodede aktører i RA patogenese er fremsendt som en diskret population af CD4

+ T-celler, der mangler co-stimulerende molekyle CD28 og er blevet rapporteret til at blive udvidet i RA [18], [19]. Senere undersøgelser har rapporteret, at disse T-celler udtrykker, i stedet for CD28, den ovenfor beskrevne NKG2D [15]. Følgende arbejde blev indledt på denne antagelse og havde til formål at først kopiere disse indledende data i en større, bedre defineret, kohorte af RA-patienter. Det blev yderligere udvidet til to andre autoimmune sygdomme: systemisk lupus erythematosus (SLE) og Sjogrens syndrom (SS). I RA og SS plaget patienterne var det også muligt at undersøge

MIC

udtryk niveau i målvæv, både på messenger RNA og protein niveau. Endvidere i perifert blod udover at måle tilstedeværelsen af ​​CD4

+ NKG2D

+ -celler per se, vi også indstillet til at analysere TCR β repertoire af disse celler i visse enkeltpersoner (jf

infra

). Endelig og for første gang en samlet organer /væv scan lov til at afdække den kendsgerning, at i modsætning til hvad der oprindeligt blev antaget og har siden indtastet lærebøger [20], og med undtagelse af det centrale nervesystem,

MICA

MICB

blev transskriberet i stort set alle væv /organ undersøgt. Den yderligere udvidelse af denne analyse at tumorized prøver hjalp med at give en bedre forståelse af

MIC

transskription i både sundhed og sygdom.

Materialer og metoder

Patienter og kontroller

25 raske frivillige samt 75 patienter, der lider af leddegigt (n = 35; 1988 American College of Rheumatology kriterier) [21], SLE (n = 15; 1997 reviderede American College of Rheumatology kriterier) [22] og SS ( n = 25, 2002 amerikanske og europæiske kriterier) [23] blev inkluderet i denne undersøgelse (tabel 1). Alle prøver blev opnået fra frivillige, der deltog i Reumatologisk klinik i Strasbourg universitetshospitaler og blev indsamlet under rutinemæssige kliniske (diagnostiske /prognostiske /terapeutisk) procedurer foreskrevet af en af ​​medforfatterne, Dr. J. Sibilia. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver enkelt efter aftale med Helsinki-erklæringen og fransk lovgivning, i henhold til hvilken der ikke godkendelse fra en etisk komité var påkrævet i dette tilfælde. Alle patienter og kontroller var uafhængige.

flowcytometri

Følgende, skiftevis konjugeret (PE, FITC, PerCP, Cy5 eller APC) antistoffer blev anvendt i tre-og -four- farve flowcytometri: anti -CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, – TCR γδ. T-celle-repertoiret blev analyseret ved den følgende PE og FITC konjugeret anti-TCRV

β (1, 2, 3, 4, 5,1, 5,2, 5,3, 7,1, 7,2, 8, 9, 11, 12, 13,1, 13,2 , 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21,3, 22, 23) (Beckman Coulter) antistoffer. Isotype-matchede kontroller blev anvendt til hver farvning. NKG2D udtryk blev analyseret ved hjælp af PE-konjugeret ON72 (Beckman Coulter) og 1D11 (BD PharMingen), enten PE-konjugeret eller biotinyleret; sidstnævnte detekteret ved streptavidin-PC5 (BD PharMingen). Perifere blodceller blev undersøgt enten ufraktioneret eller efter Ficoll densitetsgradientcentrifugering. Mononukleære celler blev også isoleret ved Ficoll densitetsgradientcentrifugering fra artikulære fluida opnået fra 1 RA, 3 slidgigt og 2 ikke gigtpatienter autoimmune. Flowcytometri blev udført på enten en BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) eller FC 500 (Beckman Coulter) systemer.

Immunhistokemi

synovial væv blev opnået fra 1 RA albue og 1 osteoarthritis patienter på tidspunkt for knæalloplastik. Spytkirtel væv blev opnået fra 4 SS og en sund frivillig under næsekorrektion. For immunohistokemi blev 4 um kryostatsnit fremstillet af synoviale væv eller spytkirtler og lynfrosset i flydende nitrogen. Successive snit blev fikseret i acetone, lufttørret, rehydreret i PBS og blokeret med 0,3% hydrogenperoxid. Snit blev inkuberet med anti: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), -CD4, -CD8 i 1 time ved stuetemperatur. Binding blev påvist under anvendelse af biotinyleret sekundært anti-IgG og streptavidin-peroxidase. Sektioner blev modfarvet med Harris ‘hæmatoxylin og monteret med Glycergel.

Northern blotting

Menneskelig mRNA blots blev købt fra Invitrogen (Invitrogen Northern Territories). Membranerne blev sekventielt hybridiseret med

MICA, β-actin

β

2-mikroglobulin (β

2 m)

cDNA, udsat efterfølgende højstringente vasker (64 ° C , 0,1XSSC, 0,1% SDS), før eksponering for Kodak Xomat (Eastman Kodak, Rochester, NY) i henholdsvis 8 timer ved -70 ° C, 1 time ved stuetemperatur og 4 timer ved -70 ° C.

Real-time kvantitativ PCR

tilbehør spytkirtel biopsier blev opnået fra en uafhængig sæt af 20 (19 kvindelige og en han, gennemsnitsalder 51, median 52) patienter med primær SS. Spytkirtler fra 5 patienter, der gennemgår orofacial kirurgi (for uafhængige årsager) blev opnået under de procedurer og tjente som kontroller mens både patologi samt patientens historie yderligere elimineret tegn på auto-immunitet i disse kontrolpersoner. Totalt cellulært RNA blev isoleret ved TRIzol LS® (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. Kvaliteten af ​​ekstraheret RNA blev konstateret gennem gelelektroforese. 1 ug totalt RNA blev udsat for omvendt-transkription under anvendelse af oligo-dT og ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega) efter producentens anbefalinger. Real-time kvantitativ PCR blev udført på en ABI PRISM 7000 under anvendelse af følgende oligonukleotider og TaqMan®-prober. Ekspressionsniveauerne af

glimmer

MICB

blev kalibreret ved hjælp af husets holder 18S RNA påvises ved anvendelse af følgende frem og reverse primere henholdsvis 3′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-5 ‘, 3’-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 ‘og SYBR Green.

MICA

transkripter blev påvist under anvendelse af følgende frem, tilbage oligonukleotider og TaqMan® probe henholdsvis 3′-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 ‘, 3′-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5′- og 3′-ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5’ og de af

MICB

med F 3′-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 ‘, R 3′-CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5′, 3’-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 ‘i samme rækkefølge som ovenfor. Positive opregulering af

MIC

transskription blev konstateret i HeLa-celler dyrket ubehandlet eller varmechok som tidligere beskrevet [24].

Resultater og Diskussion

På trods af, at den indledende ” glitch “udløser autoimmune sygdomme generelt og leddegigt i særdeleshed, er fortsat det meste gådefulde, årtiers forskning har samlet flere plausible scenarier mens ved initiering, diverse veje og kaskader tendens til mere eller mindre forevige en auto-reaktiv (T og /eller B-celle drevet) kraft, til sidst fører til symptomatisk patologi [6], [25] – [28]. En af de nyeste mistænkte T-celle subpopulationer som sådan, er den del af CD4

+ hjælper T celler, der udtrykker den aktiverende receptor NKG2D, men blottet for co-stimulerende molekyle CD28 [15]. NKG2D, en type-II transmembrane overflade homodimer består af en C-typen lektin ekstracellulære domæne, efterfulgt af et transmembrant og en kort cytoplasmatisk hale blottet for enhver særlig signalfunktion. Molekylet signalerer faktisk (i hvert fald i mennesket) via interaktion med det transeuropæiske membranen adapter protein DAP10 (DAP10 og DAP12 i mus afhængigt af NKG2D isoform) [29]. NKG2D genkender flere forskellige fjernt beslægtet ikke-konventionel MHC klasse I molekyler; i mennesket MIC [7] og RAET1 [30] (ULBP) [31] og i muse RAE1 og H60 [9], [29]. Det oprindelige formål med dette arbejde var at fremme vores viden om den potentielle rolle for MIC-NKG2D interaktion i autoimmunitet i mennesket. For at en sådan at være tilfældet, (mindst) to betingelser skal være opfyldt: (1) først og ideelt, organer målrette for autoimmunitet (dermed potentielt alle organer og /eller væv), bør ikke udtrykke MIC på basal tilstand i andre ord, MIC bør kun fundet i syge væv eller patologiske tilstande. (2) For det andet, at systemisk og /eller væv-infiltreret autoreaktive CD4

+ T-celler udtrykker NKG2D og være faktisk udvidet i en sådan sygdom; en optakt til deres potentielle funktionelle relevans.

Igen og selvom lærebogen definition af MIC udtryk er, at kvasi-begrænsning til enterocytter [20], [24], er virkeligheden langt fra så skarpskåret og denne reduktionistiske view simpelthen ikke afspejler virkeligheden (se nedenfor). Faktisk de første monoklonale antistoffer dannet mod MICA viste sig at plette fortrinsvis, hvis ikke kvasi-udelukkende, menneskelige enterocytter, med undtagelse af thymusepitel [24]. Dette var i overensstemmelse med de oprindelige nordlige blottings fremhæve transskription af genet, ikke i cellelinier (transformerede) af lymphohematopoeitic afstamning, men i de af epitel /fibroblastisk oprindelse [7]. På den anden side har genoverførsel eksperimenter klart vist, igen og igen, at uanset afstamning af modtagerens cellelinie, hvis transgenet (under en heterelogous promotor, som er) er korrekt transkriberes, MIC protein uvægerligt syntetiseres og når celleoverfladen [24], [32] – [37], og derfor udelukker enhver cellulær “begrænsning element (er)”, såsom de precedently vist at være nødvendige for korrekt overfladeekspression af andre ikke-klassisk MHC klasse i-gener, f.eks klassisk HLA signalsekvens afledte peptider i tilfælde af HLA-E /Qa-1 hos mennesker /mus [38] eller bakterielt afledte N-formylerede peptider i tilfælde af H2-M3 i mus [39]. Derfor kritiske spørgsmål er, hvor væv /organ

glimmer

MICB

er faktisk transskriberet, i hvilket tilfælde man kunne trygt antage deres deraf følgende overflade udtryk. Så trivielt som dette spørgsmål kan synes, næsten 15 år, siden deres identifikation [7], ikke systematisk transkriptionel analyse af

MIC

gener er blevet offentliggjort til dato. Her præsenterer vi en første sådan analyse. Faktisk omfattende Northern blotting af et stort antal af humane væv og organer viser tydeligt, at i modsætning til tidligere stridigheder, både

glimmer

MICB

er almindeligt transskriberet. Som det ses i figur 1 (øverste panel), er disse transkripter findes i stort set alle organer undersøgt med den bemærkelsesværdige undtagelse af det centrale nervesystem (top, ekstreme højre panel, figur 1). Dette korrelerer faktisk perfekt med transkriptionen mønster af klassisk MHC-I loci, som vist ved at probe de samme membraner med en

β

2m

cDNA-probe (mellemliggende paneler, figur 1). Betale mere opmærksom på

MIC

udtryk mønster, man bemærker, at selv et organ “fyldt” med lymphohematopoeitic celler – milten – ikke blottet for

MICA

udskrifter og indeholder

MICB

udskrifter i lige store mængder som til andre organer (lunge, nyre …). Igen, den klare mangel på

MIC

fra centralnervesystemet er bemærkelsesværdigt, og faktisk uventet, idet det klart paralleller at klassiske MHC-I-gener (

β

2m

panel ), og dette på trods af, at i hvert fald de umiddelbare promotorområder af disse loci (

MIC

og konventionel

MHC-i

) ikke viser nogen indlysende sekvenshomologi [24]. Endelig og for at dække de grunde så meget som muligt med hensyn til

MIC

transskription, vi udvidet denne transkriptionelle kortlægning fra sunde til tumorized væv. En række tumorer af forskellige vævstyper blev analyseret og sammenlignet med raske tilstødende væv (figur 2). Igen,

MIC

transkription var bredt til stede, og ingen generelle mønster for induktion /repression kunne iagttages i tumorer vs. raske væv (figur 2), i modsætning precedently foreslået [13]. Derfor, alt i alt,

MIC

transskriberes i stort set alle undersøgte væv med undtagelse af det centrale nervesystem. Det overordnede mønster i tumorer er tegn på en “løs” transskription mønster. Årsagen til, at nogle anti-MIC antistoffer tilsyneladende har vist at skildre et begrænset vævsekspressionsmønstret skal derfor ligge et andet sted, f.eks genetisk polymorfisme [40], diverse N-koblede glycosyleringsmønstre (MICA har 8 potentielle N-koblede glycosyleringssteder) [7], [24].

Panelet repræsenterer RNA stammer fra store menneskelige organer. Hvert panel indeholder lunge-RNA som en intern standard. Top panel blev hybridiseret med

MICA

cDNA. Forskellen udskrift længde

glimmer

MICB

skyldes en tidligere dokumenteret større 3’UT i

MICB

mRNA [50]. Den midterste panel afbilder udtryk for

β

2m

, betegnende for den β

2 m bundet konventionel MHC-I-ekspression. Endelig

β-actin

transskription fungerer som en belastning kontrol. For mere detaljeret forklaring se hovedteksten.

Den samme disposition som figur 1 gælder, men denne gang de klatter indeholder tumor og kontrol (tilstødende sygdomsfri væv) baner.

Efter at have konstateret, at

MIC

transskriberes og derfor potentielt oversat i nogen /alle væv, sætter vi nu til at undersøge relevansen af ​​

MIC

og indirekte, at af MIC-NKG2D udtryk i auto- immunitet. For sådan blev tre prototypiske autoimmune sygdomme valgt på grund af deres iboende relevans i forståelsen human autoimmunitet [25], [41], [42], klinisk /medicinsk interesse samt det faktum, at med hensyn til RA, tidligere data havde sat fingeren MIC-CD4

+ NKG2D

+ interaktion i sygdomsætiologi /patogenese [15]

til denne analyse følgende kohorte af personer var samlet:. 25 raske kontrolpersoner og 75 patienter, der lider fra de ovennævnte autoimmune lidelser dvs. 35 RA, 15 SLE og 25 SS (tabel 1). Blandt disse en undergruppe herunder 10 kontrolpersoner, 10 RA, 2 SS og 2 SLE patienter blev udførligt immunophenotyped med et bredt panel af antistoffer, i forskellige kombinationer, for at måle interne standarder inden skala indsats fuld (se materialer og metoder for komplet liste over antistoffer). Herved bliver forskellige T, B og NK cellepopulationer blev undersøgt. Der sås ingen signifikant forskel mellem patienten og kontrolpopulationer (data ikke vist). Mere specifikt fordelingen af ​​NKG2D ved overfladen af ​​αβ CD8

+ og γδ T-lymfocytter samt NK-celler, indledningsvist testet med total blodcellepræparater perifere, afslørede ikke, som forventet, nævneværdig forskel mellem patienter og kontroller. Vi vendte derefter vores fokus til befolkningen af ​​interesse, dvs. CD4

+ NKG2D

+ T-celler (figur 3). Forholdet mellem NKG2D ekspression på CD4

+ T-celler viste sig at være lige så ens i alle raske frivillige (0,8-8,5%, betyde 2,7%, standardafvigelse 2), alle RA (0,4-9,7%, betyde 2,1%, standardafvigelse 1,9), alle SLE (0,3-7,8%, betyde 2,4%, standardafvigelse 2), og alle SS-patienter (0 til 36,2%, betyder 4%, standardafvigelse 7,6) (figur 4). To SS-patienter fandtes faktisk at have højere NKG2D udtryk på deres CD4

+ T-celler (18,6% og 36,2% henholdsvis) (se nedenfor for yderligere analyse) (figur 4 og 3.

NB

: Figur 3 afbilder faktisk en sådan patient). Fordi en præcedens undersøgelse, som havde fundet signifikant højere CD4

+ NKG2D

+ T-celler i RA vs. kontroller, havde anvendt en anden anti-NKG2D mAb, dvs. 1D11 (BD PharMingen) (vs. ovenfor anvendte ON72 klon , Beckman Coulter), vi også testet dette antistof. Sammenligning af NKG2D farvning med enten antistoffer på CD4

+ T-celler i 3 raske frivillige, 4 RA, en SLE og 2 SS afslørede ikke nogen signifikant forskel (gennemsnitlig forskel: 0,21; standardafvigelse: 0,24). Endvidere sammenlignet vi også denne immunofænotypebestemmelse sammenligne totale perifere blod vs. mononukleære celler under anvendelse ON72 mAb. Dette blev vurderet i en raske frivillige, 2 RA og 2 SS uden at antyde at nogen forskel (gennemsnitlig forskel: 0,33; standardafvigelse: 0,52). Endelig og for fuldt ud at validere setup, intra-individuelle stabilitet NKG2D udtryk på CD4

+ T-lymfocytter blev verificeret over tid i 2 raske frivillige på henholdsvis dag 1/14 og 1/120, for en RA patient på d1 /D120 og i 2 SS-patienter ved D1 /D150. Ingen bemærkelsesværdige forskelle (gennemsnit: 0,31; standardafvigelse: 0,5) blev observeret i forskellige lymfocytsubpopulationer og især dem CD4

+ T-celler, der udtrykker NKG2D. I betragtning af, at det samme ovennævnte rapport havde antydet til induktion af NKG2D udtryk på CD4

+ T celler efter adjunction af TNF (

in vitro

), RA patienter under anti-TNF-behandling er ikke medtaget i denne undersøgelse, til trods for at en foreløbig analyse af tre RA-patienter behandlet med infliximab ikke viste nogen signifikant forskel på niveauet af NKG2D ekspression på CD4

+ T-lymfocytter (data ikke vist). Derfor alt i alt, var vi ikke i stand til at finde nogen signifikant forskel mellem CD4

+ NKGD

+ befolkning i raske kontrolpersoner vs RA, SS eller SLE-patienter. Endelig Figur 5 giver et komplet billede af CD4

+ T-celle pool med hensyn til NKG2D og /eller tilstedeværelse eller fravær af CD28.

Dette eksempel taget fra en af ​​de to SS-patienter (MRS XET) huser en særligt højt forhold mellem CD4

+ NKG2D

+ T-celler (36,2%) illustrerer den metode, der anvendes for at optælle disse celler i alle individer (kontroller og patienter) inkluderet i dette arbejde under en rutinemæssig 50 000 arrangementer analyse.

Denne figur viser forholdet mellem CD4

+ NKG2D

+ T-celler inden for den samlede perifere CD4 pool i kontrol, RA, SLE og SS individer. Variabiliteten i SS-patienter skyldes 2 personer som repræsenterer en usædvanlig høj andel (se hovedteksten for forklaring). Ingen af ​​forskellene er betydelig, da vurderet af Wilcoxon tekst: p = 0,1658 for kontrol vs. RA; p = 0,9547 for kontrol vs. SLE og p = 0,5012 for kontrol vs. SS.

Dette, mere globale tal, analyserer forholdet mellem CD4

+ T celler, der huser eller ikke CD28 og /eller NKG2D, eller ej. Ingen af ​​forskellene er statistisk signifikant.

Slutningen-mål i RA er den fælles, vi satte sig ved siden af ​​analysere CD4

+ NKG2D

+ ekspressionsniveauerne inden mononukleære celler i fluidet artikulære høstes efter Ficoll densitetsgradientcentrifugering fra en RA albue og 5 kontroller (tre knæ slidgigt og to ikke autoimmun knæet arthritis) patienter. Igen ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​NKG2D på CD4

+ T-celler blev fremhævet mellem kontroller og RA i fælles væsker og mellem perifert blod og ledvæske i en RA-patient (data ikke vist). For yderligere at undersøge betydningen af ​​ekspressionen af ​​NKG2D på CD4

+ og CD8

+ T-celler

in situ

, synoviale væv blev analyseret ved immunohistokemi for at kvantificere tilstedeværelsen af ​​CD4, NKG2D, CD8 og MICA /B udtrykkende celler. Dette blev udført i en RA (hoftealloplastik) og én osteoarthritis kontrol (knækirurgi) individ. I kontrolgruppen fandtes individuelle NKG2D at blive udtrykt på 3,8% af perifert blod CD4

+ T-lymfocytter versus 2,5% af dem, der findes i ledvæsken. Da denne person ikke har foretaget nogen aktiv inden ledbetændelse, var det ikke overraskende ikke at observere en bemærkelsesværdig infiltration af CD4

+, CD8

+ +/- NKG2D

+ lymfocytter (ingen MIC udtryk blev fundet enten i denne patient). I RA patient blev NKG2D udtrykt på 0,9% af cirkulerende CD4

+ T-celler (ingen ledvæsken kunne hentes fra RA hofte undergår kirurgi). Vævet infiltrere i RA (figur 6A) var primært CD4

+ (figur 6B), mens CD8 udtryk var mindre vigtigt (figur 6C). NKG2D udtryk var tydeligvis eksklusive CD4 og mere i overensstemmelse med den af ​​CD8 (figur 6D) (NB .: disse er forskellige vævssnit, derfor ingen overlejring er meningsfuldt). Endelig blev MICA /B udtrykt på fibroblastiske /epitelceller og ikke på inflammatoriske infiltrater (figur 7A og B).

(A) Farve plet ved Hematoxylin-eosin-farvning. Immunohistokemisk analyse under anvendelse af (B) CD4 (C) CD8 og (D) NKG2D antistoffer. Den infiltrat er tydeligvis af lymfatisk oprindelse med et flertal af CD4 T-celler.

immunhistokemisk analyse af (A) (B) RA synovitis og en (C) (D) SS tilbehør spytkirtel farvet med en anti-MICA monoklonalt antistof. MIC udtryk er klart for epitelial /fibroblastisk natur i begge væv /organer.

Selv om vores resultater i RA er i strid med nogle af de tidligere offentliggjorte data, kan en afklaring af sidstnævnte hjælpe med at sætte vores resultater og faktisk hele spørgsmålet i perspektiv. Forud for at gøre sådan, vi helt klart ikke replikere arbejde ved Groh et al. med hensyn til udvidelse af CD4

+ NKG2D

+ i RA selvom vi gjorde vores bedste for at holde sig til deres protokol, f.eks anvendelse af de samme anti-NKG2D antistoffer etc. [15]. Der kan være rationelle forklaringer på sådan, det ene er mangel på detaljerede oplysninger med hensyn til deres patientpopulation, f.eks fraktionen under anti-TNF-behandling etc. En dybere analyse af litteraturen viser faktisk, at udvidelsen af ​​denne tid, CD4

+ CD28

– T-celler, er ikke så patognomoniske af leddegigt, som det kunne have syntes i begyndelsen [18]. Faktisk en nyere analyse af en uafhængig kohorte af patienter viser tydeligt, at halvdelen af ​​de patienter med RA (n = 94) (ifølge forfatterne dem blottet for nodulær RA og sicca syndrom) havde ikke en signifikant stigning i deres perifere CD4

+ CD28

– T-celle pulje med hensyn til kontroller (se figur 1 i [43] Endelig Saez-Borderias et al bringe i en ny drejning på problemet, ved at rapportere induktion af CD4

+ NKG2D..

+ T-celler i respons på human cytomegalovirus (HCMV), hvilket fører til forestille, at den tidligere rapporterede udvidelser kan være nødvendigt at revurderes i lyset af HCMV serologiske status af patienterne og kontroller. Dette åbner også avenue for denne delpopulation at anerkende, ud over HCMV, andre mikrobielle midler, et punkt ikke testet i tidligere (og nuværende) undersøgelser [44].

for at sondere den potentielle betydning af CD4

+ NKG2D

+ T-celler i immunpatologi af SS blev immunhistokemi udført på spytkirtel væv formål at påvise CD4, NKG2D, CD8 og glimmer /B. Tre SS spytkirtel væv blev opnået ved biopsi under indlæggelse, mens én kontrol spytkirtel væv blev opnået fra en ellers raske frivillige individ under næsekorrektion for uafhængige årsager. I kontrolgruppen individ, har immunhistokemi ikke afsløre tilstedeværelsen af ​​eventuelle bemærkelsesværdige antal CD4, CD8 og /eller NKG2D udtrykker celler i overensstemmelse med mangel af inflammatorisk infiltrat; dette var lige tilfældet for MICA /B-ekspression (data ikke vist). I SS blev NKG2D udtrykt på henholdsvis 0,4, 0,9, 2% af perifert blod CD4

+ T-lymfocytter. Immunhistokemi (figur 8A), focalized på inflammatoriske infiltrater, viste, at i alle 3 patienter, CD4 T-celler var mest udbredt, igen gensidigt udelukkende med CD8-farvning (figur 8B og C). Mængden og fordelingen af ​​NKG2D ekspression syntes at være sammenlignelig med den for CD8 med undtagelse af den CD4 (figur 8D, C og B). Desuden blev MICA /B-ekspression påvist på epitelceller fra glandulær kanaler, men ikke på lymfoide infiltrater (figur 7C og D).

(A) Farve plet ved Hematoxylin-eosin-farvning. Immunohistokemisk analyse under anvendelse af (B) CD4 (C) CD8 og (D) NKG2D antistoffer. Den infiltrat er tydeligvis af lymfatisk oprindelse med et flertal af CD4 T-celler.

Med hensyn til SS, i betragtning af den dokumenterede udtryk for MIC gener og proteiner i epitelceller [24], formodet inddragelse af forskellige virus i SS patofysiologi [45] og den relative lethed til at få adgang til målvævet, dvs. spytkirtler; vi havde til formål at kvantificere niveauet for

MIC

transskription i sunde og SS plaget spytkirtler. Dette blev opnået ved real-time kvantitativ PCR-analyse af

glimmer

MICB

udskrifter. Forud for at gøre sådan på kirtel RNA blev metoden valideret på HeLa-celler; dokumenteret at være huser

glimmer /MICB

udskrifter på betydelige niveauer, hvor disse er reguleret af celle stress, f.eks varmechok [7], [24]. Varmechok blev udført som tidligere beskrevet [24]. Med hensyn til

MICA

der var en 8x induktion efter 15 minutter og 3,5 × for

MICB

. Efter 60 minutter forblev induktion ved 4,5 × til

GLIMMER

og 2 × for

MICB

. Typiske QRT-PCR plots er vist i figur 9A og B. Inden spytkirtel væv, selvom udtrykket viser en klar inter-individuel variation, kunne observeres ingen signifikant forskel mellem patienter og kontroller (Figur 10A og B).

GLIMMER Hotel (A) og

MICB

(B) udtryk profil som analyseret ved RT-qPCR. ▪ Prøver 15 minutter efter varme chok, ♦ prøver 60 minutter efter varme chok, ▴ ubehandlede kontroller.

Relativ udtryk niveau af

GLIMMER Hotel (A) og

MICB

(B) i Sjögrens syndrom patienter sammenlignet med raske kontroller. Forskellene mellem patienter og kontrolpersoner ikke er væsentlige som vurderet af Mann-Whitney

U

test (α = 0,27 for

glimmer

og α = 0,53 for

MICB

).

Som omtalt ovenfor, blandt alle 75 patienter analyseret, to SS-patienter (Mrs. XET og xrl, i denne rækkefølge i dette afsnit) har faktisk udgør en særlig høj grad af CD4

+ NKG2D

+ T-lymfocytter i perifert blod (henholdsvis 36,2% og 18,6%).