PLoS ONE: Måling af kræft cellevækst Heterogeneity gennem Lentiviral Barcoding Identificerer Klonal Dominans som Karakteristisk for In Vivo Tumor Anslag af transplantatet

Abstrakt

Fremskridt inden for kræft initierende celler og high-throughput

in vivo

shRNA skærme har fremhævet et behov for at observere væksten af ​​tumorceller i kræftmodeller på klonale niveau . Mens

in vivo

cancercellevækst heterogenitet i xenotransplantater er blevet beskrevet, det har endnu ikke måles. Her testede vi en tilgang til kvantificere klonal vækst heterogenitet af kræftceller i subkutane xenograft musemodeller. Ved hjælp af en high-throughput sekventering metode, vi fulgte den skæbne

in vitro

i viv

o af titusinde HCT-116 celler individuelt mærket med en unik stregkode leveret af lentiviral transduktion. Mens væksten

in vitro

var mindre homogen end forventet, vi fortsat, at 95% af de endelige celler afledt fra 80% af de oprindelige celler. I xenotransplantater imidlertid 95% af de hentede stregkodede celler stammede fra kun 6% af de oprindeligt injicerede celler, en effekt vi udtrykket “klonal dominans”. Vi observerede denne klonal dominans i to yderligere xenograftmodeller (MDA-MB-468 og A2780

cis) og i to forskellige værtsstammer (NSG og Nude). Ved præcist og reproducerbart at kvantificere klonal vækst cancercellevækst

in vivo

, finder vi, at en lille delmængde af kloner tegner sig for langt hovedparten af ​​Descendanten celler, selv med HCT-116, en cellelinie rapporteret at mangle en tumor -initiating rum. Den stokastiske

in vivo

udvælgelsesprocessen beskriver vi har store konsekvenser for områderne

in vivo

shRNA screening og tumorfremkaldende celler

Henvisning:. Nolan-Stevaux O, Tedesco D, Ragan S, Makhanov M, Chenchik A, Ruefli-Brasse A, et al. (2013) Måling af kræft cellevækst Heterogeneity gennem Lentiviral Barcoding Identificerer Klonal Dominans som Karakteristisk for

In Vivo

Tumor Anslag af transplantatet. PLoS ONE 8 (6): e67316. doi: 10,1371 /journal.pone.0067316

Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Februar 5, 2013; Accepteret: 16 maj 2013; Udgivet: 26 juni 2013

Copyright: © 2013 Nolan-Stevaux et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Cellecta, Inc. var en udbyder af lentivirale shRNA biblioteker for denne undersøgelse og er arbejdsgiver for Donato Tedesco, Mikhail Makhanov og Alex Chenchik. Olivier Nolan-Stevaux, Seamus Ragan, Astrid Ruefli-Brasse, Kim Quon og Paul D. Kassner er ansat af Amgen. Denne undersøgelse blev finansieret af Amgen Inc. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

I de seneste år, xenograft musemodeller for kræft er blevet brugt til at undersøge grundlæggende spørgsmål i tumor biologi så forskellige som eksistensen af ​​kræft indlede celler eller muligheden for at identificere nye kræft målgener hjælp

in vivo

shRNA drop-out screening tilgange. I begge felter imidlertid forholdsvis ringe forståelse af væksten dynamik xenograftmodeller forårsaget forvirring.

Først resultater fra seriefortynding eksperimenter, i hvilke meget lave antal cancerceller injiceres subkutant i mus er blevet anvendt at støtte [1], [2] eller afkræfte [3] eksistensen af ​​sjældne kræft initierende celler inde heterogene puljer af kræftceller i solide tumorer [4]. Men kræftceller i tumorer ikke eksisterer i sig selv, men er omgivet af andre cancerceller. Hvis således et par cancerceller injiceres i en mus og ikke vokser, kan det afspejle deres manglende kræft initierende potentiale; eller mere prosaisk, det faktum, at de ikke var i et optimalt miljø, omgivet af andre cancerceller (tumorfremkaldende eller ej). Sporing adfærd formodede kræft initierende celler omgivet af formodede ikke-kræft initierende celler ville give tiltrængt klarhed.

For det andet, har metoder der anvender fælles biblioteker af lentivirusvektorer koder hundredvis af shRNA udløser blevet pioner for at identificere potentielle roman kræft-fremme gener

in vivo

[5], [6]. Men mens

in vitro

poolede shRNA drop-out-skærme (for et nyligt eksempel, se [7]), og

in vivo

poolede shRNA berigelse skærme til formål at identificere tumor-undertrykkere eller vækst hæmmende mekanismer har været en succes [8], [9],

in vivo

shRNA drop-out-skærme er ikke blevet bredt kopieret. Også her ville en bedre forståelse af væksten heterogenitet i xenograftmodeller hjælpe med at fortolke og forudsige resultater fra sådanne screening tilgange. Bemærkelsesværdigt, mens rumlige fænotypiske heterogenitet er blevet dokumenteret i xenograft kræftmodeller [10], [11], klonal kræft cellevækst heterogenitet i xenograftmodeller er aldrig blevet målt.

Her har vi brugt en metode til lentiviral stregkode tagging til præcist og samtidig måle vækstkarakteristika af tusinder af individuelle cancerceller inde i en pulje af umærkede cancerceller dyrkes

in vitro

eller injiceres subkutant

in vivo

i stærkt immuno-deficiente mus. Vores resultater viser den bemærkelsesværdige heterogene væksten af ​​kræftceller i flere xenograftmodeller, hvorved små antal individuelle cancer cellekloner overtage en indledningsvis jævnt fordelt og heterogen cellepopulation, en effekt vi har kaldt “klonal dominans”. Som et resultat af vores observationer, foreslår vi en ny klonal celle sporing metode til at omgå confounding effekt af klonal dominans i forbindelse med puljede

in vivo

shRNA drop-out-skærme. Vi anbefaler også brug af denne metode til at måle bidraget fra formodede kræft initierende celler subpopulationer, ikke i isolation, men inden for en heterogen kræftcelle befolkning.

Materialer og metoder

Etik erklæring og Mus Strain

Mus blev plejet i overensstemmelse med den

guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, 8

th

Edition fra National Institute of Health. Dyr blev opstaldet på et anlæg internationalt akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC), i ventilerede mikro-isolator boliger. Dyr havde

ad libitum

adgang til foder og vand via automatisk vandingssystem. Dyr blev holdt i en 12 timers: 12 h lys: mørke-cyklus, i rum ved 22 ° C og 45% fugtighed. Vores forskning protokol og stalde plan blev godkendt af Amgen South San Francisco Institutional Animal Care og brug Udvalg (Amgen South San Francisco IACUC, Protokol # 2011-01.108). Otte uger gamle NOD /SCID-mus IL2rg (NSG) (Jackson Laboratories stamme # 5557) og ti uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (Charles River stamme # 490) blev anvendt i denne undersøgelse.

Lentiviral Bibliotek titer Bestemmelse ved FACS

titeren af ​​den poolede lentiviral bibliotek blev bestemt direkte i HCT-116-celler ved FACS-målinger af procentdelen af ​​mCherry positive celler fra en seriel fortynding af den lentivirale pool. Kort fortalt titreringer af den lentivirale pulje blev sat til 1,5 × 10

5 HCT-116 celler i vækstmedium (McCoys 5A, 10% FBS) indeholdende DEAE Dextran (MP Biomedicals, katalog # 195.133) ved 10 ug /ml. Celler blev udsat for virus i 16 timer og infektion medium blev aspireret og erstattet med komplet vækstmedium uden DEAE Dextran. Celler forblev i kultur i yderligere 48-72 timer og blev trypsiniseret, vasket med Dulbecos PBS og fikseret i en 2% paraformaldehyd opløsning. Fikserede celler blev analyseret for procentdelen af ​​mCherry positive celler ved FACS (Becton Dickinson LSRII). Den infektionsmultiplicitet (MOI) og titer, rapporteret som transducerende enheder pr ml (TU /ml), blev bestemt ud fra procentdelen af ​​transducerede celler og volumenet af lentiviral materiel. MOI blev først bestemt ved anvendelse af ligningen% transducerede celler = 100 * (1- e

– (MOI)) og titeren værdi blev bestemt ved anvendelse af ligningen Titer = [MOI × # celler ved infektion] /vol (ml virus) = TU /ml [12] – [15]. Til denne viral pool, 10 pi virus resulterede i 12,9% mCherry positive celler og den beregnede titer på 2 × 10

6 TU /ml blev anvendt til at bestemme den passende mængde af virus til efterfølgende eksperimenter på udvalgte MOI s.

Beregninger af transduktionseffektivitet og Antal Lentiviral Inserts per celle

viruspartikler forventes at distribuere tilfældigt i individuelle celler og procentdelen af ​​inficerede celler ved en given MOI (hvor MOI = Transducerende enheder /celle) kan estimeres ved en Poisson-fordeling, hvor procenten af ​​inficerede celler er lig med 100 * (1- e

– (MOI)) (tabel 1). Sandsynligheden for et vilkårligt antal viruspartikler i en given celle er således givet ved Poisson ligningen p (v) = (M

ve

-v) /v !, hvor M = MOI og v er antal vironer inficerer cellen. Disse formler kan bruges til at beregne titeren af ​​en viral pool i en given celle linje og vurdere procentdelen af ​​celler inficeret med et vilkårligt antal vironer (tabel 2).

Lentiviral Infektion Procedure for KE-U6-TET Bibliotek i HCT-116

HCT-116-celler (Colon Cancer Cell line – ATCC # CCL-247) med en fordoblingstid på 21 Timer. blev dyrket i komplet vækstmedium [McCoys 5A-medium (Life Technologies # 16.600-082), 10% Tet System Approved FBS (Clontech # 631.101), 0,1 mg /ml Normocin (Invivogen # ant-NR-1)]. KE-U6-TET, en lentiviral bibliotek indeholdende 27.500 individuelle Tet-inducerbare stregkodede shRNA sekvenser med en titer på 2 × 10

6 Transduktion enheder (TU) /ml blev anvendt i forbindelse med 10 ug /ml DEAE-dextran (MP Biomedicals # 195.133) for at opnå en (MOI) på 0,1, for hvilke sandsynligheden for at inficere en celle med mere end én lentiviral partikel beregnes til at være mindre end 5% (tabel 2) [15]. Kort fortalt, 3 × 10

6 HCT-116 celler blev resuspenderet i 8,5 ml komplet vækstmedium suppleret med DEAE Dextran (10 ug /ml) og transduceret med 150 pi KE-U6-TET bibliotek og inkuberet i 16 timer, hvilket resulterer i en cellepopulation på 3 × 10

6 celler indeholdende ~ 3 × 10

5-celler inficeret med en enkelt lentivirus og bærer en individuel stregkode.

Lentiviral Infektion Procedure for Luciferase bibliotek i HCT-116, MDA-MB-468 og A2870

cis

En lentiviral bibliotek indeholdende 27 neutrale Renilla

Luciferase

shRNAs sekvenser forbundet med 2% af stregkoder til stede i biblioteket var anvendes ved en MOI på 0,18, 0,17 og 0,15, henholdsvis i HCT-116, MDA-MB-468 (Breast Cancer Cell line – ATCC # HTB-132) og A2780

cis

(Cisplatin kræft i æggestokke Kræft Cell line – Sigma-Aldrich # 93112517) celler. Den forventede procentdel af inficerede celler med mere end en lentiviral partikel beregnes til at være mindre end 10% ved disse MOI’er (tabel 2). Kort fortalt, 3 × 10

6 celler blev resuspenderet i 8,5 ml vækstmedium suppleret med polybren (5 ug /ml), transduceret med den lentivirale bibliotek og inkuberet i 16 timer, hvilket resulterer i en cellepopulation af 3 × 10

6 celler, der indeholder ~ 5 × 10

5 transducerede celler, ~ 90% er forudsiges at være inficeret med en enkelt lentivirus og bærer en enkelt stregkode (tabel 2).

In vitro

Experiment

16 timer efter transduktion med KE-U6-TET bibliotek, prøver af 10

5 HCT-116 celler, der indeholder ~ 10

4 individuelt mærkede celler blev podet i tre eksemplarer på T175 celle kultur flasker og dyrket kontinuerligt i 8 dage i komplet vækstmedium, med medier opfyldning hver 2-3 dage. For hver

in vitro

replikere blev alle celler fra hver T175 kolbe bruges på høst på dag 8 for genomisk DNA isolation.

NSG xenograft Experiment

16 timer post- transduktion med KE-U6-TET bibliotek, prøver af 10

5 HCT-116 celler, der indeholder ~ 10

4 individuelt mærkede celler blev blandet med 3 × 10

6 ikke-transducerede HCT-116 celler og resuspenderes i 200 pi 01:01 PBS: Matrigel løsning (BD Bioscience # 356.235) før subkutan injektion i 8 uger gamle kvindelige NSG mus (lager # 005.557, Jackson laboratorier). Hver xenograft fik lov til at vokse i 12 dage, indtil den resulterende subkutan tumor nåede en størrelse på ~500 mm

3. På dette tidspunkt blev tumorer høstet for genomisk DNA-isolering.

Nude xenograft Eksperimenter

16 timer efter transduktion med Luciferase bibliotek, 3 × 10

6 celler (HCT-116, MDA-MB-468 eller A2780

cis) resuspenderedes i 200 pi 01:01 PBS: Matrigel løsning (BD Bioscience # 356.235) før subkutan injektion i 10 uger gamle kvindelige Nude mus (lager # 490, Charles River Laboratories). HCT-116 og A2780

cis xenograft lodes vokse i 14 dage og MDA-MB-468 i 24 dage, indtil den resulterende subkutan tumor nåede en størrelse på ~500 mm

3. På dette tidspunkt blev tumorer høstet for genomisk DNA isolation.

Tet Undertrykkelse af shRNA Expression i fravær af doxycyclin og induktion med Doxycyclin

Effektiviteten af ​​TET repressor element i vektoren blev vurderet løbet en 15 dages eksperimentet. Tre uafhængige infektioner af 9 × 10

7 HCT116 celler i vækstmedier (McCoys 5A, 10% FBS) indeholdende DEAE Dextran (MP Biomedicals, katalog # 195.133) på 10 ug /ml blev udført med 27,5 k shRNA biblioteket på en MOI = 0,3 i Corning Cell Stack 10 fartøjer (katalog # 3271). For at maksimere repræsentation af biblioteket blev hver shRNA indført i ~1000 uafhængige celler. Efter 24 timer blev infektion medier aspireret og erstattet med komplet vækstmedium med 2 ug /ml puromycin (InvivoGen, katalog # ant-pr-5) for at starte selektion for inficerede celler. 72 timer efter transduktion, blev en celle pellet på ~ 9 × 10

7 celler indsamlet til reference for hver infektion tre eksemplarer (dag 0 prøve). 9 × 10

7 celler blev re-seedede og vedligeholdes i kultur med komplet medier med 2 mg /ml puromycin. Celler blev passeret ved 3 dages intervaller ud til 15 dage, tilsået 9 × 10

7-celler og opretholdelse selektivt tryk med puromycin under hele forsøget. Cell pellets for tredobbelte prøver fra dag 0 og 15 blev forelagt til sekventering af DNA-stregkoder ved high-throughput sekventering. Celler, hvor shRNA ekspression blev induceret blev behandlet efter re-seeding 9 × 10

7 celler på dag 0 med Doxycyclin (Sigma-Aldrich, katalog # D-9891) på 0,5 mg /ml i 15 dage.

Recovery og Kvantificering af Stregkoder

Sonder var forberedt på high throughput sekventering på Illumina HiSeq2000 efter Cellecta protokol (https://www.cellecta.com/resources/protocols). Sættet af stregkoder, der anvendes til konstruktion af biblioteket bestod af 27.500 18-nukleotid individuelle lange stregkoder, perfekt afbalanceret i AT /GC og purin /pyrimidin, konstrueret ved hjælp af en proprietær Cellecta algoritme. Mindste Hamming afstand mellem stregkoder i sættet er 4, så kan påvises op til 3 mutationer i en 18-nukleotidsekvens og den beskadigede stregkoder afvist, giver passende beskyttelsesniveau for den aktuelle nøjagtighed Illumina sekventering teknologi. Stregkode ID-numre blev kodet i stregkoden sekvens under anvendelse kvaternære numeriske system (A-0, T-1, G-2, C-3), så alignment procedurer for stregkode dekonvolution blev ikke nødvendigt. Brug Cellecta omvendelse algoritme blev stregkode id-numre udvundet fra hver korrekt stregkode og den overflod af hver stregkode i sekventeret prøve målt. Med denne procedure, kompleksiteten af ​​beregningen er ikke afhængig af kompleksiteten af ​​biblioteket. Kompleksiteten er O (n) var n er antallet af læser i de sekventerede sonder. FASTQ og qseq filer fra Illumina HiSeq2000 maskine blev anvendt i analysen.

Klon Size Estimation

For hver prøve, at antallet af stregkode tæller svarende til en enkelt transduceret celle blev beregnet ud fra den samlede antallet af stregkode tæller i prøven og det samlede antal af transducerede celler i prøven (sidstnævnte ansat efter genomisk DNA genopretning og transduktion MOI, og bekræftet ved PCR-sonde udbytte). For at estimere størrelsen af ​​hver klon i transducerede cellepopulation (antal celler, der bærer den samme stregkode), stregkode tæller blev derefter normaliseret til den beregnede enkelt celle stregkode tæller.

Resultater

Måling Clone Recovery Rate

in vivo

for at spore kloner stammer af individuelle celler i en kræftcelle befolkning, vi smittet HCT-116 kolorektal cancer celler med en lentiviral bibliotek indeholdende 27.500 uafhængige inducerbare shRNA sekvenser, hver er knyttet til en individuel 18 nukleotid stregkode. Vi inficerede 3 × 10

6 HCT-116-celler ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 0,1. Under disse infektion betingelser, Poisson-fordeling analyse forudser et minimalt antal dobbelt infektion begivenheder ( 5% af transducerede celler) [15] (Tabel 2). Transduktionen gav -3 × 10

5 individuelt stregkodede celler (tabel 1). Tre sæt af 10

4 HCT-116 stregkodede celler (10

5 af total-cellerne et MOI på 0,1) blev dyrket i kultur

in vitro

i 8 dage eller omkring 9 populationsfordoblinger. Genomisk DNA fra de tre puljer af celler dyrket

in vitro

blev underkastet stregkode high-throughput sekventering og størrelsen (celleantal) af hver detekteret klon i den transducerede population blev beregnet baseret på antallet af gange hver bar -kode blev hentet (fig. 1).

A lentiviral bibliotek indeholdende 27.500 unikke stregkoder blev anvendt til at transducere HCT-116-celler ved en MOI på 0,1. Puljer af 10

5 celler, svarende til 10

4 individuelt mærkede celler blev enten blandes med 3 × 10

6 celler og implanteres subkutant i NSG mus eller dyrket i kultur

in vitro

. Celler blev høstet efter 9 dage og tumor fjernet efter 12 dage, og den samlede DNA-præparater fra celler eller tumorer blev udsat for stregkode hentning procedure den.

Parallelt tre sæt af 10

4 barkode HCT-116-celler (10

5 af total-cellerne et MOI på 0,1) fra samme oprindelige virale transduktion begivenhed blev opsamlet 16 timer efter transduktion og individuelt blandet med 3 × 10

6 uinficerede HCT-116-celler og fortyndet i 50% Matrigel, før subkutan injektion i flanken af ​​tre alvorligt immun-deficiente kvindelige NSG mus. Hver xenograft fik lov til at vokse i 12 dage, indtil den resulterende subkutan tumor nåede en størrelse på ~500 mm

3. Genomisk DNA fra de tre xenotransplantattumorer blev udsat for de samme stregkode nyttiggørelse og klon størrelse skøn som

in vitro

prøver (fig. 1).

in vivo

klon hentning blev beregnet som forholdet mellem det gennemsnitlige antal stregkodede kloner identificeret i de tre xenotransplantattumorer og det gennemsnitlige antal stregkodede-kloner identificeret i de tre cellepopulationer vokset

in vitro

, uafhængigt af klon størrelse (fig. 1). Som vist i tabel 3, den observerede klon hentning sats var næsten 60%, og antallet af kloner identificeret i

in vitro

indstilling i hver gentagelse var meget tæt på den forudsagte værdi af 10

4 kloner. Notatet når en celle suspension indeholdende Matrigel injiceres subkutant, en lille mængde (ca. 10%) af den injicerede væske siver ud af injektionsstedet, der tegner sig for en brøkdel af de tabte stregkoder i

in vivo

indstilling.

In vivo

“Klonal Dominans” Inside HCT-116 Xenografter

for at vurdere og sammenligne, hvordan de stregkodede celler delt

in vitro

og

in vivo

analyserede vi distributionen af ​​deres stregkoder efter hvor ofte de blev hentet af HTS. Det fulde datasæt af kloner og stregkode tæller er tilgængelig (tabel S1)

I et første diagram, vi analyserede klonale fordeling af celler dyrket

in vitro

:. Vi plottede antallet af uafhængige kloner (. figur 2A – blå søjler) eller den samlede samlede antal celler (fig 2A -. appelsin søjler) for hver klon størrelseskategori over X-aksen. For eksempel,

in vitro

, var der 2.649 uafhængige kloner af en størrelse på mellem 512-1023 celler, hvilket indikerer, at disse kloner i kategorien “512-1023” celler skal have undergået et gennemsnit på 8 populationsfordoblinger ( figur 2A -. blå bar værdi for X-aksen kategorien “512-1023”). Disse 2.649 kloner bidrog i alt 1,017,216 efterkommer Barcoded celler på

in vitro

kultur i 8 dage (figur 2A -. Orange bjælke værdi for X-aksen kategorien ‘512-1023’). Som bevis på, at

in vitro

klonal vækst er hovedsagelig homogen, 95% af afkommet stregkodede celler fundet efter 8 dages

in vitro

kultur blev afledt fra 80% af den oprindeligt mærkede kloner og var indeholdt i klon kategorierne ‘128-4095’ angiver mindst 7 befolkningstal divisioner.

for hver graf, antallet af uafhængige kloner (blå søjler) eller den samlede samlede antal celler (Orange søjler) er afbildet for hver klon størrelse kategori på tværs af X-aksen. (A) Fordeling af HCT-116 stregkoder

in vitro

: 80% af stregkoder (kloner) blev identificeret i kategorierne “128-255” til “2048-4095”, hvilket indikerer, at 80% af cellerne delt mellem 7 og 12 gange; 95% af cellerne blev identificeret i kategorierne “128-255” til “2048-4095”, hvilket indikerer, at 95% af cellerne tilhører kloner afledt fra 80% af de oprindeligt transducerede celler, som fordelt mellem 7 og 12 gange. Skala for antallet af celler blev indstillet 500 gange for at tillade side om side sammenligninger af klon numre og celleantal. (B) Fordeling af HCT-116 stregkoder

i

vivo

: 75% af de stregkoder findes i kategorierne “mangler” til “2-3”, hvilket indikerer, at de enten ikke overleve på alle, ikke dele sig, eller deles ikke mere end én gang og kun udgjorde 1% af de hentede mærkede celler. kun 6% af de bar-koder, blev imidlertid placeret i kategorierne “64-127” til “16.384-32.767”, hvilket indikerer, at de delte mellem 6 og 14 gange; 95% af cellerne er opsamlet i kategorierne “64-127” til “16.384-32.767”, hvilket indikerer, at 95% af de mærkede celler er afledt fra 6% af de oprindeligt stregkodede kloner, som delte mest. Skala for antallet af celler blev indstillet 25 gange for at tillade side om side sammenligninger af klon numre og celleantal.

I et andet diagram, analyserede vi den klonale fordeling af celler dyrket

in vivo

: vi igen plottet antallet af uafhængige kloner (fig 2B – blå søjler.) eller den samlede samlede antal celler (fig 2B – appelsin barer.) for hver klon størrelse kategori på tværs af X-aksen.

in vivo

distributioner ser dramatisk forskellig fra de

in vitro

distributioner.

In vivo

, 75% af de kloner grupperet i “Missing-3 ‘kategorier, der angiver, at 75% af cellerne oprindeligt injiceres

in vivo

undergik færre end to celledelinger (fig. 2B – blå søjler – “Missing” eller “1” eller “2-3» kategorier). Bekræfter, at disse kloner voksede ikke

in vivo

, disse kloner kun udgjorde 1% af det samlede aggregat antal celler inden den taggede cellepopulation identificeret ved HTS i den resulterende tumor. På den anden side, 6% af de injicerede celler var i stand til at dele sig mere end fem gange for at generere kloner med mindst 64 celler (Fig 2B -. Blå søjler mærket 6%). Bemærkelsesværdigt, disse kloner tegnede sig for 95% af det samlede aggregat antal celler i mærkede cellepopulation (Fig 2B -. Appelsin søjler mærket 95%), hvilket viser meget betydelig vækst heterogenitet

in vivo

, hvor de to mest rigeligt genvundet kloner alene (ud af en anslået 10.000) gennemgik 14 populationsfordoblinger og genererede en forbløffende 7,5% af de samlede celle tags inddrives af HTS i xenotransplantater. (fig 2B -. kloner og celler i kategorien ‘16.384-32.767’)

Vi kalder dette fænomen “klonal dominans”, hvorved en lille fraktion af cellerne implanteres

in vivo

opdele langt mere end det store flertal af andre kloner og bidrage overvældende til efterkommer cellepopulation. Bemærk, at tidligere undersøgelser konkluderede, at HCT-116 cellelinje ikke indeholder en stilk-celle eller tumor-initierende delpopulation (se Diskussion).

Med undtagelse af Effekt af de kodede shRNA

in vitro

og

in vivo

shRNA kodet i lentivirus klones nedstrøms for U6-TET-promotoren og reguleres af en Tet-repressor, der kodes i lentivirus, at sikre undertrykkelse af shRNA hårnål udtryk i fravær af doxycyclin. Således i forbindelse med dette forsøg, indholdet af de lentivirale vektorer blev rent anvendt som en bar-kodesystem af de inficerede celler og blev ikke forudsiges at interferere med cellevækst. For at sikre at kodede shRNA ikke påvirker cellevækst, vi voksede cellerne i et medium, der indeholder Tet-systemet godkendt FBS, designet til at minimere de-undertrykkelse af initiativtagerne i fravær af doxycyclin. Men for at bekræfte eksperimentelt, at uforudsete shRNA induktion ikke påvirkede stregkoden fordelingen i fravær af doxycyclin, vi sammenlignet også fordelingen af ​​stregkoder er indeholdt i KE-U6-TET bibliotek efter HCT-116 transduktion ved dag 0 og på dag 15 efter infektion. Til dette forsøg vi transducerede HCT-116 celler med KE-U6-TET lentiviral bibliotek ved en MOI på 0,3 og opsamlede celler lige efter infektion (dag 0) eller efter 15 dage

in vitro

vækst i fravær af doxycyclin (dag 15) (fig. 3A). Vi observerede en meget stram korrelation (R = 0,99) mellem antallet af læser opnået for hver shRNA stregkode på dag 0 og dag 15 (fig. 3B). Vi derefter evalueres, hvis de to shRNA fordelinger på dag 0 (fig. S1A), og dag 15 (fig. S1B) var signifikant forskellige fra hinanden ved hjælp af en ikke-parametrisk Kruskal-Wallis Rank Sum Test og opnåede en P-værdi på 0,972, indikerer ingen statistisk forskel mellem rangordenen af ​​de forskellige shRNA i shRNA befolkning på dag 0 og på dag 15 (fig. S1D). Ligeledes var der ingen ændring i den samlede fordeling af shRNA mellem de to tidspunkter, som er oprettet ved en t-test p-værdi på 0,99 (fig. S1D). Disse resultater viser, at i fravær af doxycyclin blev U6-TET-drevne shRNA hårnåle ikke påvirker væksten og distributioner af stregkoder i transducerede HCT-116 cellepopulation

in vitro

, og var derfor ikke sandsynligt, at påvirke deres fordeling i xenotransplantaterne, forudsat at de hårnåle forblev ikke-induceret

in vivo

.

(a) en lentiviral bibliotek indeholdende 27.500 unikke stregkoder blev anvendt til at transducere HCT-116 celler ved en MOI på 0,3 . Efter 72 timer af puromycinselektion, celler blev kontinuerligt passeret i 15 dage i fravær af doxycyclin. Dag 0 og dag 15 celle alikvoter blev opnået og totalt DNA fra begge tidspunkter blev underkastet sekventering hentning procedure high-throughput stregkode. (B) Korrelation plot for dag 15 måling mod dag 0. shRNA stregkode læser for alle prøver fra alle tidspunkter blev først normaliseret til 2 × 10

7 læser. Værdier for tredobbelte prøver blev midlet. På dag 15, stærk undertrykkelse af shRNA udtryk i fravær af Doxycyclin er tydeligt i de korrelationer med dag 0 reference. Plot af log10 betyder normaliseret læser for dag 0 mod dag 15 (Pearson korrelation: R = 0,99).

For at modellere, hvad der ville ske, hvis de hårnåle blev de-undertrykt i en kræftcelle befolkning, vi også sammenlignede shRNA stregkode distribution i transducerede HCT-116 celler på dag 0 og på dag 15 efter

in vitro

vækst i tilstedeværelse af doxycyclin (Dag 15 – Dox -. fig S1c). Under disse betingelser, mens den samlede shRNA befolkningsfordelingen ikke blev signifikant påvirket (p-værdi på en t-test mellem de to populationer var 0,99), blev rang-rækkefølgen af ​​de forskellige shRNA stregkoder dybt påvirket (p-værdi på en ikke -parametric Kruskal-Wallis rank-order test var 1,75 × 10

-8 -. figur S1D). Vi analyserede derefter fordelingen af ​​stregkoder mest rigeligt identificeret i tre

in vivo

xenograft gentagelser (identificeret som en del af top 6% af kloner, der bidrager til 95% af de hentede tags -. Se figur 2) til fjerne to mulige, men trivielle forklaringer på klonale dominans vi observerede: (i) at en indledende stregkode repræsentation bias og (ii) den mulige virkning af utætte hårnåle, der ville have nydt nogle kloner frem for andre

in vivo

. Først havde vi ikke observere en stregkode fordeling skævhed, der ville have begunstiget de kloner, der blev hentet

in vivo

. De 4.109 hyppigst forekommende shRNA stregkoder hentet i tre

in vivo

replikater blev fordelt over hele shRNA befolkningsfordeling og kan ikke forklare den klonale dominans effekt vi observerer (fig. 4A). For det andet, hvis den utætte udtryk for shRNA hårnåle

in vivo

var en faktor i klonal dominans, ville vi forvente, at de kloner, der blev valgt

in vivo

ville indkode shRNA hårnåle, der begunstiger HCT-116 vækst, eller i det mindste, ikke er giftige for HCT-116. Dette var ikke tilfældet: et stort antal af de mest udbredte stregkoder, der blev hentet

in vivo

(farvet røde i figur 4B) faktisk indkode shRNA hårnåle, der er giftige for HCT-116

in vitro

, da de faktisk klynge i venstre side af shRNA fordelingskurve, hvilket indikerer en vækstinhiberende virkning efter

in vitro

induktion ved Doxycyclin i 15 dage (fig. 4B), hvilket kraftigt antyder, at disse shRNA hårnåle blev ikke de-undertrykt under væksten af ​​den implanterede tumor. Havde disse giftige shRNA hårnåle været utæt eller de-undertrykt, ville de have hindret væksten af ​​kloner, der kodede dem og deres stregkode ville sandsynligvis ikke have været blandt de mest udbredte shRNA stregkoder hentet

in vivo

.

(A) fordeling af de 4.109 unikke stregkoder hentet mest rigeligt fra de tre xenotransplantattumorer (markeret med røde lodrette linier) på tværs af hele shRNA befolkningen distribution i shRNA biblioteket. (B) Påvisning af en stor del af de mest udbredte stregkoder fra de tre xenotransplantattumorer (markeret med rødt) i shRNA population mest giftige for HCT-116 upon Doxycyclin induktion

in vitro

i 15 dage (målt ved en negativ log2 forhold på gennemsnitlig læse tæller for individuelle shRNA på dag 15 efter Doxycyclin at betyde læse tæller på dag 0).

Klonal Dominans er observeret i andre xenograftmodeller og i en anden mus Host

for yderligere at validere vores observationer med yderligere cellelinjer og med en anden vært stamme, vi transduceret 3 × 10

6 HCT-116, MDA-MB-468 og A2780

cis celler i to eksemplarer på en MOI på