PLoS ONE: Genome-Scale Discovery af DNA-methylering Biomarkører for blod-Based opdagelse af tyk- Cancer

Abstrakt

Baggrund

Der er en stigende efterspørgsel efter nøjagtige biomarkører for tidlig non-invasiv colorectal cancer detektion. Vi ansat en genom-skala markør opdagelse metode til at identificere og kontrollere kandidat DNA methylering biomarkører for blod-baseret detektion af tyk- og endetarmskræft.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte DNA methylering data fra 711 kolorektal tumorer, 53 matchede tilstødende-normal colon vævsprøver 286 sunde blodprøver og 4.201 tumor prøver af 15 forskellige typer cancer. DNA methylering data blev genereret af Illumina Infinium HumanMethylation27 og HumanMethylation450 platforme, der bestemmer status methylering af 27,578 og 482,421 CpG sites hhv. Vi uropført en flertrins markør udvalg til at identificere kandidat markører med høj methylering tværs af alle kolorektale tumorer, mens husly lav methylering i sunde prøver og andre kræftformer. Vi derefter brugt pre-terapeutiske plasma og serum prøver fra 107 patienter med tarmkræft og 98 kontroller uden kolorektal cancer, bekræftet af koloskopi, for at verificere kandidat markører. Vi valgte to markører for yderligere evaluering: methylerede

THBD

(THBD-M) og methylerede

C9orf50

(C9orf50-M). Ved afprøvning på kliniske plasma og serum prøver disse markører udkonkurreret carcinoembryonisk antigen (CEA) serum måling og resulterede i en høj følsom og specifik test ydeevne for tidlig kolorektal påvisning af kræft.

Konklusioner /Betydning

Vores systematisk markør opdagelse og verifikation undersøgelse for blod-baserede DNA methylering markører resulterede i to nye kolorektal cancer biomarkører, THBD-M og C9orf50-M. THBD-M især viste lovende resultater i kliniske prøver, begrunder den videre optimering og klinisk afprøvning

Henvisning:. Lange CPE, Campan M, Hinoue T, Schmitz RF, van der Meulen-de Jong AE, Slingerland H et al. (2012) Genom-Scale Discovery af DNA-methylering Biomarkører for blod-baseret detektion af kolorektal cancer. PLoS ONE 7 (11): e50266. doi: 10,1371 /journal.pone.0050266

Redaktør: Carmen J. Marsit, Dartmouth Medical School, USA

Modtaget: August 8, 2012; Accepteret: 17 oktober 2012; Udgivet: November 28, 2012 |

Copyright: © 2012 Lange et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. forfatterne vil gerne erklære, at PW Laird holder følgende udstedte patenter på MethyLight teknologi ( “Process for High Throughput DNA-methylering Analysis” US Patent # 6.331.393; Dato Gemt: Maj 14, 1999; Udstedelsesdato: 18. december 2001. “Proces for High Throughput DNA-methylering Analyse “US patent # 7.112.404; Dato Gemt: december 10, 2001, Udstedelsesdato: 26. september 2006.” Proces for High Throughput DNA-methylering Analysis “Dato Gemt: december 10, 2001, Udstedelsesdato: 30. juni 2009), som er blevet licenseret til Epigenomics AG. Desuden P.W. Laird, D.J. Weisenberger, og M. Campan er navngivet som opfindere på følgende verserende patentansøgning for Digital MethyLight teknologi ( “DNA-methylering Analyse af Digital Bisulfite Genomisk sekventering og Digital MethyLight” Pub App No: 20080254474; Dato Gemt: 14. april, 2008) . D.J. Weisenberger er konsulent for Zymo Research. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatterne, overholdelse af alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig sygdom med en anslået 143,460 nye tilfælde i USA i 2012 [1]. CRC er den tredje hyppigst diagnosticeret kræft hos mænd og kvinder i den vestlige verden og en betydelig procentdel af patienter, der får CRC vil have fjernmetastaser (fase IV) ved diagnose, som ofte er uhelbredelig. Det er klart, at lokaliserede cancer (fase I /II) opdages tidligt er mere modtagelig for helbredende terapi, med overlegen prognose [2], [3]. Følgelig kunne diagnostiske metoder, der resulterer i tidlig påvisning af malign eller endda præmaligne sygdom har betydelige kliniske fordele, reducerer mortalitet og morbiditet hos patienter med colorectal cancer. Ledige potentielle screening teknikker til CRC omfatter fækal okkult blodprøve, dobbelt kontrast barium lavement, endoskopi, med præference for pancolonoscopy, og virtuel koloskopi [4], [5]. Målingen af ​​serum carcinoembryonisk antigen (CEA) er også blevet foreslået som en mulig screening modalitet, men det mangler tilstrækkelig følsomhed til at detektere CRC på et tidligt tidspunkt, og dens niveau er også forhøjet i ikke-maligne sygdomme (f.eks diverticulitis, gastritis, diabetes) [6].

der forventes en optimal screening test for at være yderst følsom og specifik, udgør nogen risiko for patienterne, og har høj accept patient. Det bør også være omkostningseffektive og lette at udføre. Som nuværende screening procedurer mangler tilstrækkelig positiv prædiktiv værdi, kræver ubehagelige forberedelse eller forårsage ubehag, er der behov for at udvikle nye non-invasive test til påvisning af CRC på et stadium tidligt nok til behandling for at blive en succes. DNA methylering markører er lovende værktøjer, som kan være nyttige til påvisning tidlig cancer. I det seneste årti er det blevet klart, at cancerceller har afvigende mønstre af DNA-methylering og som kan påvises disse abnormiteter i tumor-afledte DNA fundet i plasma eller serum fra cancerpatienter [7], [8]. Flere undersøgelser har dokumenteret tilstedeværelsen af ​​fri DNA fra solide tumorer i blodbanen af ​​kræftpatienter, hvilket rejser muligheden for at detektere disse kræft-specifikke molekyler i fag med eksisterende sygdom [9] – [22].

En række undersøgelser har allerede rapporteret anvendelsen af ​​methylering af DNA-markører for blod-baseret detektion af CRC med varierende resultater [9] – [22]. Men de fleste af disse undersøgelser har været baseret på test af et begrænset antal forudvalgte gener og om brug af ikke-kvantitative detekteringsmetoder, såsom gel-baserede methyleringsspecifik PCR. Formålet med denne undersøgelse er at identificere blod-baserede DNA methylering biomarkører for CRC under anvendelse af en genom-skala DNA-methylering tilgang til markering opdagelse og teste de udvalgte markører i præ-operative kliniske blodprøver fra patienter, der gennemgår kurativ kirurgi for CRC.

Metoder

humane prøver og etiske retningslinjer

De lokale og regionale institutionelle anmeldelse boards godkendt denne undersøgelse. Informeret samtykke blev opnået fra alle deltagende patienter og kontroller. Pre-terapeutiske plasma og serum prøver blev indhentet fra CRC patienter i ambulatoriet via tapning af medianen kubiske vene fra april 2008 til december 2011. plasma og serum blev isoleret inden for 30 minutter venapuncture som tidligere beskrevet [22]. Hver prøve plasma eller serum blev yderligere opdelt i to separate rør og opbevaret ved -80 ° C indtil bearbejdning. Serum CEA blev målt ved hvert venapuncture i CRC patienter.

Kontroller blev defineret som personer uden CRC eller malignitet i de seneste fem år, og blev inkluderet i denne undersøgelse ved endoskopi afdelingen. Personer, der gennemgår koloskopi, som viste ingen tegn på en kolorektal malignitet, var berettiget til at deltage. Indikationer for koloskopi for disse patienter var overvågning colonoscopies grund af inflammatorisk tarmsygdom (IBD, Crohns sygdom eller colitis ulcerosa), positiv familiehistorie med CRC, gastrointestinale klager eller rektal blodtab. En erfaren gastroenterolog udført alle colonoscopies. Patienter med mild, kontrolleret IBD blev inkluderet, så længe det var muligt at pålideligt inspicere colon mucosa ved koloskopi

og

hvis overvågning biopsier, der rutinemæssigt taget langs hele kolorektal tarmkanalen var patologisk normal (viser ingen tegn på dysplasi). Plasma- og serumprøver blev isoleret fra disse individer under anvendelse af den samme protokol som for CRC patienter.

CRC væv blev opnået under kirurgisk resektion af tumoren og straks sendes til patologen. Patologen dissekeret en repræsentativ del af tumoren og lagres den frisk frosset prøve ved -80 ° C inden for en time efter kirurgisk resektion. Desuden blev en patologisk normal kolon udtaget mindst 10 cm væk fra kanten af ​​tumoren og lagres på samme måde

Marker Discovery:. Teknologier og datasæt

I markør opdagelse fase af denne undersøgelse anvendte vi DNA methylering data genereret af Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip® (HM27) og HumanMethylation450 BeadChip® (HM450) platforme. Den Infinium assay kvantificerer DNA methylering niveauer ved specifikke cytosinrester støder op til guaninrester (CpG loci), ved at beregne forholdet (β-værdi) af intensiteter mellem locusspecifikke methylerede og ikke-methylerede perle-bundne prober. Den β-værdi er en kontinuerlig variabel, der spænder fra 0 (ikke-methyleret) til 1 (fuldt methyleret) [23]. Den HM27 BeadChip® vurderer methylering niveau på 27,578 CpG sites placeret ved promotorområder 14.495 proteinkodende gener DNA. Den HM450 BeadChip® vurderer DNA methylering status på 482.421 CpG loci og dækker 99% af RefSeq gener og 96% af UCSC CpG øer (www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq, www.illumina.com).

Vi brugte tilgængelige Infinium HM27 og HM450 data fra 711 kolorektale tumorer, 53 matchede tilstødende-normale colon vævsprøver og 10 perifere prøver blod lymfocyt (PBL) i raske personer til at identificere og kontrollere kandidat DNA methylering tumormarkører. Derudover brugte vi Infinium data fra offentligt tilgængelige datasæt (GEO og TCGA), der repræsenterer 274 sunde PBL prøver og 4.201 maligne vævsprøver fra 15 forskellige typer kræft for at maksimere CRC specificitet (se tabel 1). De p-værdier på 611 CRC tumorer og 24 matchede tilstødende-normal colon vævsprøver blev hentet fra DNA methylering datasæt for CRC’er lagt ud på The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal (http: //tcga-data.nci.nih. gov /TCGA /tcgaHome2.jsp). Data for de øvrige 100 CRC tumorer og 29 matchede tilstødende-normal colon vævsprøver blev genereret på USC epigenome Center i en tidligere undersøgelse [24]. Infinium data for 274 PBL prøver blev hentet fra Omnibus (GEO) database Gene Expression ved National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, tiltrædelse nummer GSE 19711). Data for de 10 resterende PBL prøver blev genereret ved hjælp af HM27 platform for en tidligere markør opdagelse undersøgelse på USC epigenome center [25]. Dokument S1 opsummerer arkiv numre på alle offentligt tilgængelige GEO og TCGA datasæt anvendt i denne undersøgelse. DNA methylering status blev vurderet ved hjælp af HM27 BeadChip for 336 CRC prøver, 29 normale colon prøver og 274 PBL prøver (tabel 1). For de resterende 375 CRC tumorer og 24 normale colon prøver blev status for methylering af DNA evalueret med HM450 BeadChip (tabel 1). Vi genererede også HM450 data på to PBL prøver fra indsamling af 10 undersøgte på HM27-platformen. Af de 375 CRC, data fra kun 40 prøver var tilgængelige på det tidspunkt, vi udførte markøren opdagelse. DNA methylering data for de andre 335 CRC tumorer blev ikke anvendt i markørselektion algoritme. Vi har dog bruge disse data til at kontrollere de sidste to markører udvalgte

Marker Discovery:. Filterkriterier

Vi ansat en flertrins filtrering proces i opdagelsen fase af denne undersøgelse. DNA methylering data fra de to forskellige BeadChips (HM27 og HM450) blev analyseret separat, men med samme filtrerings- trin (figur 1 og 2). Vi startede ved at udelukke alle Infinium sonder, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne. HM27 prober, blev ikke entydigt aligned til det humane genom (hg19, GRCh37), eller som er associeret med enkelt-polymorfismer (SNP’er) inden for 10 basepar af mål-CpG (identificeret ved hjælp af NCBI dbSNP bygger 126 og 128), eller prober, omfattet repetitive elementer (identificeret af RepeatMasker) blev også udelukket. Vi bestemt den højeste β-værdi for hver probe i 10 raske PBL prøver (β-PBL

H) og 10

percentil af CRC tumor p-værdier (β-CRC

10) (figur 2A). Vi udelukkede alle sonder med en β-PBL

H højere end 0,2 eller højere end den tilhørende β-CRC

10. Vi derefter filtreret de resterende prober mod normalt colon væv og 15 andre cancertyper. I detaljer, vi bestemt middelværdien β-værdi for hver sonde i normal colon væv (β-NC

M) og fjernet alle sonder, der havde en β-NC

M-værdi højere end 0,2 eller højere end den tilhørende β -CRC

10 værdi (figur 2B). Vi valgte top 25 markører i begge datasæt efter rangordne prober baseret på forskellen mellem β-CRC

10 og β-PBL

H (figur 2C). Til filtrering mod andre typer kræft, vi bestemt middelværdien β-værdi (β-OC

M) for de resterende sonder i hvert kræft type og fjernet alle sonder, der havde en β-OC

M højere end gennemsnittet CRC β-værdi (β-CRC

M). De resterende sonder blev udvalgt til MethyLight reaktion design og yderligere vurdering.

Vi brugte DNA methylering data fra Infinium HumanMethylation27 Beadchip (HM27) og HumanMethylation450 Beadchip (HM450) Infinium platforme til at screene 27.578 (HM27) og 482.421 (HM450 ) CpG loci for deres status methylering i CRC prøver, PBL prøver fra raske forsøgspersoner, parrede normale colorektale vævsprøver (NC) og 15 andre former for kræft (OC). Vi anvendte en trinvis fremgangsmåde eliminerer prober, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne, sonder, der indeholdt SNP’er eller gentagne sekvenser, prober med en højeste PBL β-værdi (β-PBL

H) eller en gennemsnitlig normal colon tissue β-værdi ( β-NC

M) højere end den tilknyttede 10. percentil af CRC tumor p-værdier (β-CRC

10) eller højere end 0,2 i nogen af ​​PBL eller NC prøver (Infinium panel). De resterende prøver blev rangeret baseret på forskellen mellem β-CRC

10 og β-PBL

H og top 25 blev udvalgt fra begge datasæt (HM27 og HM450) til filtrering mod OC prøver. Sonder med en gennemsnitlig OC β-værdi højere end den tilhørende middelværdi CRC β-værdi (β-CRC

M) blev elimineret. I alt 15 MethyLight reaktioner (markers) blev designet i 10 prober og testet i en sekvens af verifikationstrin (MethyLight panel). Markører blev elimineret, hvis deres præstation var ikke optimal i kontrol, såsom

in vitro

methylerede

Sss

en DNA, PBL og plasmaprøver fra raske kontroller og CRC tumorvæv. Markører blev også fjernes, hvis de ikke har kunnet påvise CRC methylerede DNA i samlet plasma og serum fra CRC patienter. To markører opfyldte alle udvælgelseskriterierne og blev fremført i støbeskeen for yderligere kontrol på individuelle patientprøver. (* Probes, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne, såvel som dem, der omfattede SNPs og gentag sekvenser; ** Andre cancertyper anvendt i denne undersøgelse er opsummeret i tabel 1, *** M.

Sss

jeg behandlede DNA)

A (øverste figur:. HM27, nederste figur: HM450), scatterplots af højeste PBL β-værdi (β-PBL

H) på 10 (HM27) og 2 (HM450) raske kontrolprøver (X-akse) mod den tilhørende 10. percentil af CRC tumor p-værdier (β-CRC

10) på Y-aksen. De blå prikker repræsenterer de eliminerede prober (HM27: n = 23.049; HM450: n = 367,833) og de røde prikker (HM27: n = 695; HM450: n = 30.207) repræsenterer de tilbageholdte sonder med en β-CRC

10 p-PBL

H eller en β-PBL

H 0,2. B, scatterplots for de gennemsnitlige normale colon tissue β-værdi (β-NC

M) for de tilbageholdte prober fra Panel A (X-akse) over den tilknyttede β-CRC

10 (Y-aksen). De røde prikker (HM27: n = 512; HM450: n = 28,428) repræsenterer de eliminerede sonder, de grønne prikker repræsenterer de tilbageholdte prober (HM27: n = 183; HM450: n = 1779) med en β-CRC

10 p-NC

M, eller en β-NC

M 0,2. C, scatterplots af de tilbageholdte sonder fra Panel B (grøn) vises af forskellen mellem β-CRC

10 og β-PBL

H (X-aksen) mod den tilhørende β-CRC

10 (Y -akse). Prikkerne i gule firkant er sonderne udvalgt til yderligere filtrering mod andre former for kræft. De hvide pile påpege proberne for de to kandidat-markører. D, ROC kurver for de anvendte prober i multipleksreaktionen baseret på methylering p-værdier på 335 uafhængige kolorektale cancer prøver og 23 uafhængige matchede normale colorektale vævsprøver (DNA methylering data i disse prøver blev ikke anvendt i markør opdagelse rørledning). Den mørkegrå farve er det område under kurven.

DNA Udvinding og Bisulfite Ændring

DNA fra to sunde PBL prøver og 25 CRC tumor prøver blev udvundet i henhold til den tidligere beskrevne protokol [25]. DNA fra plasma og serumprøver blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp® cirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen), specielt designet til at inddrive en maksimal mængde af cirkulerende celle-frit DNA fra serum eller blod. Den Zymo® EZ DNA-methylering kit (Zymo Research) blev anvendt til bisulfit konvertere det ekstraherede DNA. Alle ekstraktioner og konverteringer blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kvaliteten og mængden af ​​bisulfit-konverterede DNA, samt fuldstændigheden af ​​bisulfit konvertering, blev vurderet ved hjælp af et panel af kvalitetskontrol reaktioner som beskrevet tidligere [26].

MethyLight Analyse

Den MethyLight-assayet blev udført som tidligere beskrevet [27]. Sekvensen af ​​MethyLight-primere og prober, der anvendes i disse analyser, er beskrevet i tabel S1. De MethyLight reaktioner blev evalueret i fire trin. Første, M.

Sss

I (New England Biolabs) behandles PBL DNA (Promega) blev anvendt til at bestemme, om reaktionen amplificeret

in vitro

methyleret kontrol-DNA [28]. Reaktioner med en tærskel cyklus [C (t)] højere end 35 blev ekskluderet. Dernæst blev reaktionerne screenet mod 50 ng PBL DNA fra to raske individer. Reaktioner med C (t) værdier under 40 blev ekskluderet. De resterende reaktioner blev testet på 25 CRC DNA-prøver ved anvendelse af en ALU-baserede MethyLight reaktion og et M.

Sss

1 DNA standardkurve til beregning af den procentuelle Methyleret Reference (PMR) som tidligere beskrevet [27], [29]. Reaktioner med en PMR 10 i mere end en CRC tumorer blev elimineret. Endelig blev reaktionerne testet i 10 plasmaprøver fra raske donorer (svarer til 100 pi plasma) og sorteret efter deres C (t) værdier. Reaktioner med C (t) værdier mindre end 50 i en eller flere af disse prøver blev elimineret.

Digital MethyLight Analyse

samlede kliniske prøver.

Digital MethyLight er en kvantitativ PCR teknik, hvor bisulfit omdannet DNA analyseres ved hjælp af MethyLight PCR-assay i en distributiv måde over 96 reaktionskamre for hver prøve. Denne teknik er en effektiv metode til at opnå DNA information methylering for prøver med små mængder DNA og blev udført som beskrevet tidligere [25], [30]. Vi forberedte fire separate puljer af plasma og fire pools af serum-DNA at teste kandidat markører (Pool 1 = 16 kontroller (uden IBD), Pool 2 = 16 patienter med mild IBD, Pool 3 = 16 patienter med trin I /II CRC og Pool 4 = 16 patienter med trin III /IV CRC). Hver af disse puljer indeholdt DNA fra 190 pi plasma eller serum fra hver af de 16 individer i puljen. For hver reaktion vi først afprøvet DNA fra 50 pi plasma eller serum fra hver pulje. For reaktionerne, der ikke resulterer i nogen PCR-amplifikationer (hits) med 50 pi blev volumenet øges til 150 pi tilsvarende. Endelig reaktioner, der ikke resulterer i nogen hits i CRC pools eller gav hits i kontrollerne med eller uden IBD blev udelukket.

De to kandidatlande markører, der overlevede denne elimination proces blev mærket med forskellige fluoroforer. Det gjorde det muligt reaktion specifikke farvede PCR resultater, der tillod os at skelne hits fra hver af disse markører, da de blev kørt sammen (multiplex). Alle prober og primere blev syntetiseret af Biosearch Technology, Inc., Novota, Californien, USA.

Individuelle kliniske prøver.

De to-markør multiplex blev testet på plasma og serum prøver fra 75 uafhængige CRC patienter og 70 kontroller med en test volumen på 1 ml. Tabel 2 giver en oversigt over de kliniske karakteristika for CRC patienter og kontrolpersoner bruges til klinisk markør test i denne undersøgelse.

Statistisk analyse

Beregningen af ​​konfidensintervaller af områder under kurven (AUC) og de statistiske tests blev udført i R (version 2.14.0), med R pakke Proc [31]. Metoden, som foreslået af DeLong og kolleger [32] blev anvendt til testen.

Resultater

Marker Discovery i Genome-Scale DNA-methylering Datasæt

Vi udførte en trinvis markør opdagelse analyse ved anvendelse tilgængelige DNA methylering datasæt fra et stort antal CRC tumorer, 15 forskellige andre cancertyper, og kontrolprøver fra plasma, PBL og matches tilstødende-normal colon væv (figur 1 og 2, tabel 1) for at identificere CRC DNA methylering markører. Vi brugte data genereret ved hjælp af to forskellige Illumina Infinium HumanMethylation BeadChip platforme, HM27 og HM450 (se Metoder afsnit). Efter at have fjernet potentielt problematiske sonder, probe sekvenser, der overlappede SNPs eller gentagne elementer, og prober, som undlod at udføre i alle prøver, der var 23,049 HM27 prober og 367,254 HM450 sonder. Af disse prober, 695 forblev i HM27 gruppen og 29.640 i HM450 gruppen, efter eliminering dem, der havde højere DNA methylering niveauer i raske PBL prøverne end i CRC tumorer. Desuden har vi udeladt alle prober med højere DNA-methylering i normal colon væv end i CRC og rangeret de resterende prober baseret på forskellen mellem sunde PBL og CRC tumor DNA-methylering. status DNA methylering af de kombinerede top 50 sonder (sorteret efter den største forskel mellem sund PBL og CRC DNA methylering) blev sammenlignet mellem CRC og 15 andre former for kræft. Sonder med en højere gennemsnitlig DNA methylering niveau i nogen anden form for kræft end i CRC blev udelukket. Ti CRC-specifikke kandidat sonder (forbundet med ti unikke genpromotorer) forblev, som viste højere betyde DNA methylering værdier i CRC end den gennemsnitlige tilsvarende DNA methylering værdien af ​​alle andre kræftformer.

Kandidat Marker MethyLight Assay Udvikling og Verifikation

Vi har designet og testet i alt 15 real time PCR-baserede MethyLight assays (markører) for de ti resterende sonder. MethyLight-baserede teknikker er meget følsomme metoder til påvisning af methylerede DNA-molekyler [27]. Grunder og probesekvenser til disse reaktioner er beskrevet i tabel S1. Rækkefølgen af ​​kontrolarbejdet udføres på disse markører er illustreret i det højre panel i figur 1. Tre MethyLight reaktioner ikke forstærke

in vitro

methylerede (M.

Sss

I-behandlet) kontrol-DNA og blev derfor fjernet. Fem markører, der var positive i raske PBL prøver og tre markører, der havde en PMR 10 i mere end en af ​​25 testet af MethyLight CRC-tumorer blev også elimineret. De fire resterende markører blev testet i plasmaprøver fra ti raske donorer og ingen af ​​dem blev påvist i disse prøver (data ikke vist). Alle fire markører næste analyseret ved Digital MethyLight i poolede serum- og plasmaprøver fra kontroller med eller uden IBD og CRC patienter. To markører, der ikke kunne påvises i de poolede CRC prøver blev elimineret (data ikke vist). De sidste to kandidat-DNA methylering biomarkører, der opfyldte alle vores strenge udvælgelseskriterier var:.

THBD

(THBD-M) og

C9orf50

(C9orf50-M)

Indledende ydeevne evaluering af

THBD

og

C9orf50

Vi evaluerede effektiviteten af ​​

THBD

(Infinium sonde nummer cg24562819) og

C9orf50

( Infinium sonde nummer cg14015706) i at diskriminere CRC væv og tilstødende-normal kolorektal væv i et uafhængigt datasæt af 335 CRC tumorer (tabel 1).

THBD

og

C9orf50

havde β-værdier 0,4 i 95% og 100% af alle analyserede CRC tumorer hhv. Figur 2 viser modtageren opererer karakteristiske (ROC) kurver for

THBD

og

C9orf50

i diskrimination af CRC tumorprøver versus normal colon væv. AUC for

THBD

og

C9orf50

var 0,97, og 1,0 hhv. Vigtigt er det, begge mærker opnåede lavere DNA methylering niveauer i alle andre typer cancer, herunder bryst-, lunge-, prostata-, skjoldbruskkirtel, livmoder, nyre, ovarie, mave, bugspytkirtel og blære kræft, samt melanom, akut myeloid leukæmi, glioblastoma multiforme og hoved og hals pladecellekræft (figur 3).

Jitter plots repræsenterer Infinium-baserede DNA-methylering p-værdier på

THBD

(venstre panel) og

C9orf50

(højre panel) i 335 uafhængige CRC tumorer, matchede normale colon væv, en række andre typer kræft og PBL fra raske individer. Det konkrete antal prøver for hver vævstype er beskrevet i tabel 1.

Test af ydeevne THBD-M og C9orf50-M i individuelle kliniske prøver

Vi udviklede en multiplex reaktion for de to markører ved hjælp af forskellige reporter farvestoffer til hver af reaktionerne. Den THBD-M probe blev mærket med en QUASAR fluorofor, der resulterer i et rødt fluorescerende signal og C9orf50-M probe blev mærket med den blå FAM fluorofor. De primere og prober i de to markører blev testet for interferens ved at kombinere dem i én løsning i forskellige koncentrationer ved hjælp M.

Sss

jeg behandlet kontrol-DNA for MethyLight og Digital MethyLight analyser (data ikke vist). Da multipleks reaktion af de to markører udførte samt de individuelle reaktioner vi bruges førstnævnte for yderligere klinisk afprøvning.

I alt 106 CRC patienter og 98 kontrolpersoner uden CRC, verificeret af koloskopi, blev inkluderet i denne prospektiv undersøgelse. Parrede serum- og plasmaprøver var tilgængelige fra alle knapper og 103 CRC patienter, mens kun plasma opnåedes fra tre CRC patienter. Selvom stadie IV CRC var en udelukkelse kriterium i denne undersøgelse blev uspecifikke abnormiteter set på præ-operative billeddiagnostiske diagnostik for tre patienter (fx små pulmonale knuder på CT-thorax), som senere, men før operation, viste sig at være fjernmetastaser. Disse patienter blev efterfølgende upstaged at iscenesætte IV CRC. Toogtredive plasma- og serumprøver fra kontroller og CRC patienter blev tidligere anvendt i samleprøve analyse som nævnt ovenfor.

Vi testede de multipleksede Digitale MethyLight assays for THBD-M og C9orf50-M markører på individuelle plasmaprøver fra 75 CRC og 66 kontroller, og på individuelle serumprøver fra 72 CRC og 66 kontroller. Figur 4 viser antallet af molekyler (summen af ​​de to markører) påvises i 1 ml plasma (panel A) og serum (panel D) for forskellige stadier af CRC sammenlignet med kontroller. ROC kurver illustrerer test ydelse for multipleksreaktionen pr sygdomsstadium (panel B) og for begge markører særskilt i plasma (felt C) og serum (panel E og F). AUC pr sygdom fase er beskrevet i figur 4. For alle stadier, der var borderline signifikant forbedret test ydeevne for serum i forhold til plasma som test medium (p = 0,06 for alle faser af CRC). THBD-M væsentligt bedre sammenlignet med C9orf50-M i både plasma og serum (p 0,001). Tilføjelsen af ​​C9orf50-M til THBD-M til påvisning af CRC ikke forbedre test ydeevne. AUC pr scenen, for hver markør separat og multipleks reaktion, er opsummeret i tabel S2.

Digital MethyLight udførtes i 1 ml plasma (A) og serum (D) for at påvise THBD-M og C9orf50- M i CRC og kontrolprøver. Det absolutte antal molekyler detekteres af multipleks (summen af ​​to markører) omsætning registreres på y-aksen. CRC prøver arrangeret af scenen. Stjerner (*) angiver prøver med mere end 25 molekyler detekteret (op til 153 molekyler i plasma og 157 molekyler i serum). ROC kurver og AUC (95% konfidensintervaller) af de forskellige CRC stadier i plasma (B) og serum (E) baseret på antallet af fundne molekyler. ROC analyse og AUC (95% konfidensintervaller) for THBD-M, C9orf50-M som individuelle reaktioner og som en multipleks reaktion i plasma (C) og serum (F).

Vi bestemt også CEA-niveauer i præoperative serumprøver fra 107 CRC patienter. En forhøjet serum CEA (≥5.0 ng /ml) blev observeret hos 35/107 (33%) patienter. For trin I CRC serum CEA blev forhøjet i 14%, i fase II i 33% for stadium III i 39% og for trin IV i 67%. Tabel S3 opsummerer præoperative CEA serumniveauer af alle patienter med det tilhørende antal påviste THBD-M og C9orf50-M-molekyler pr 1 ml plasma og serum.

Diskussion

Et af de vigtige mangler i de offentliggjorte CRC biomarkør undersøgelser er afhængigheden af ​​en kandidat gen tilgang til markør opdagelse. Denne tilgang er ofte baseret på en nonsystematic udvalg af kandidat markørgener, der er testet hos raske og ondartede væv og derefter valideret i en patientpopulation [9] – [22]. Selv om nogle af disse undersøgelser har resulteret i lovende biomarkører til tidlig CRC påvisning, manglen på en grundig biomarkør opdagelse strategi rejser spørgsmålet, om overlegne markører kan være blevet overset. Med de mere avancerede nuværende teknologier, er det muligt at opnå genom-skala DNA-methylering data, der kan være nyttige for biomarkør opdagelse. Vi udførte et genom-skala flertrins markør opdagelse til at identificere CRC biomarkører vha HM27 og HM450 BeadChip platform; sidstnævnte evaluerer status af methylering af DNA på over 482.000 CpG loci og dækker 96% af alle UCSC CpG-øer. Vi har for nylig gennemført en lignende markør-pipeline strategi for kræft i æggestokkene og identificeret nye følsomme gentagelse biomarkør IFFO1-M [25]. For nærværende undersøgelse forbedrede vi vores opdagelse strategi ved hjælp af methylering af data DNA fra 4.201 kræft prøver af forskellig oprindelse til at optimere CRC specificitet. Vores resultater viser, at denne opdagelse strategi virker med succes for CRC, hvilket resulterer i to nye biomarkører: THBD-M og C9orf50-M. Med AUC for 0,97 og 1,0 henholdsvis på Infinium analysen, disse to markører har en fremragende evne til at skelne mellem CRC tumorer og matchet normalt colon væv.