PLoS ONE: BAY61-3606 Påvirker levedygtighed Colon Cancer Cells i en Genotype-Directed Manner

Abstrakt

Baggrund

K-RAS mutation udgør en særlig vanskelig problem for kræftbehandling. Aktiverende mutationer i K-RAS er almindelige i kræft i lungerne, pancreas og colon og er forbundet med dårlig respons på behandlingen. Som sådan, målrettede behandlinger, der ophæver K-RAS-induceret onkogenicitetsstudie vil være af enorm værdi.

Metoder

Vi søgte for små molekyle kinase inhibitorer, der fortrinsvis påvirker væksten af ​​kolorektal cancer celler, der udtrykker mutant K-RAS. Virkningsmekanismen af ​​en inhibitor blev undersøgt ved hjælp af kemiske og genetiske metoder.

Resultater

Vi identificerede BAY61-3606 som en inhibitor af proliferation i kolorektal cancer celler, der udtrykker mutante former af K-RAS, men ikke i isogene celler, der udtrykker vild-type K-RAS. Ud over sine anti-proliferative virkninger i mutantceller, BAY61-3606 udviste en distinkt biologisk egenskab i vildtypeceller, da den gav følsomhed for inhibering af RAF. I denne sammenhæng BAY61-3606 handlet ved at inhibere MAP4K2 (GCK), som normalt aktiverer NFκβ signalering i vildtypeceller som respons på inhibering af RAF. Som et resultat af MAP4K2 inhibering, vildtypeceller blev følsomme for AZ-628, en RAF-inhibitor, når også behandlet med BAY61-3606.

Konklusioner Salg

Disse studier indikerer, at BAY61-3606 udøver forskellige biologiske aktiviteter i forskellige genetiske sammenhænge

Henvisning:. Lau KS, Zhang T, Kendall KR, Lauffenburger D, Gray NS, Haigis KM (2012) BAY61-3606 Påvirker levedygtighed Colon Cancer Cells i en Genotype -dirigerede Manner. PLoS ONE 7 (7): e41343. doi: 10,1371 /journal.pone.0041343

Redaktør: David J. Reiner, University of North Carolina, USA

Modtaget: Februar 2, 2012; Accepteret: 20 Juni 2012; Udgivet: 18 Juli 2012

Copyright: © 2012 Lau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (K01-CA118425 og P30-CA006516) og American Cancer Society (MGO-114.877) og en donation fra Merlino Family Endowment Fund. KSL er en Robert Black Fellow af Damon Runyon Cancer Research Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

RAS familien GTPaser fungere som binære omskiftere, der undergår en konformationsændring efter binding til GTP, giver dem mulighed for at engagere et væld af downstream signalering effektorer herunder RAF, PI3K, og RalGDS [1]. Den iboende GTPase aktivitet af RAS hydrolyserer GTP til GDP, med hjælp af GTPase aktiverende protein (GAP) cofaktorer, at inaktivere sin signalering kapacitet. Missense mutationer i kodonerne 12, 13, 61, eller 146 er almindelige i cancer og er forbundet med resistens over for GAP-aktivitet, så RAS at fortsætte i den aktiverede, GTP-bundne tilstand. Aktivering K-RAS mutationer forekommer i ca. 15% af alle cancere (hvilket gør det til et af de mest almindeligt muterede onkogener), men er særligt udbredt i de mest dødelige former for kræft, som dem, der i galdevejene, colon, lunge, og bugspytkirtel [2]. I kolorektal cancer, for eksempel, er K-RAS muteret i næsten 40% af tilfældene [2]. Vigtigt er det, tumorer med K-RAS mutationer er særligt resistente over for konventionelle og målrettede behandlinger og er normalt forbundet med dårlig prognose [3] -. [5]

Den største udfordring for at modvirke de onkogene virkninger af aktiverede K-RAS er den manglende evne til direkte at inhibere mutant protein. Fordi signalering egenskaber K-RAS forstærkes via inaktivering af dets GTPase aktivitet direkte farmakologisk hæmning af RAS er ikke en levedygtig terapeutisk strategi. En alternativ strategi til at modvirke mutant K-RAS er at inhibere dets nedstrømseffektorer fx RAF-MEK-ERK (MAPK) pathway. MEK-inhibitorer har fået opmærksomhed på grund af deres allosterisk virkningsmekanisme, som giver ekstrem specificitet, og deres demonstrerede effektivitet i melanomer og tyktarmskræft udtrykker aktiverede B-RAF [6], [7]. MEK-inhibitorer klarer sig dårligt i kræftformer udtrykker mutant K-RAS dog måske på grund af sekundære mutationer, der påvirker respons eller eksistensen af ​​MEK-uafhængig signalering nedstrøms for RAF [8], [9]. I betragtning af den presumptiveness af disse scenarier, er det klart, at der er behov for en bedre forståelse af, hvordan K-RAS-signalering netværk opererer i kræft at udvikle nye behandlingsformer.

I de seneste år, store funktionelle genomiske tilgange har været ansat til at opdage kinase mål, ved hammerslaget er “syntetisk dødelige” med mutant RAS. Potentielle terapeutiske mål, der er blevet identificeret omfatter TBK1 [10], STK33 [11], CDK4 [12], og PLK1 [13], selv om det stadig uvist, om nogen af ​​disse repræsenterer

bona fide

terapeutiske mål for K-RAS mutant cancere. Betragtninger forstå de mekanismer, som K-RAS-signaler gennem disse mål er centrale for udformningen af ​​effektive lægemidler, en mindre studerede, og ofte overset, Spørgsmålet er, hvorfor vildtype celler, som også udtrykker disse mål, tåle tab af funktion af disse enzymer. Dette spørgsmål er lige så vigtigt for udviklingen af ​​lægemidler, fordi fordelen ved målrettede behandlinger (i forhold til konventionelle kemoterapier) er deres potentielle selektivitet for maligne celler.

I denne undersøgelse har vi karakteriseret aktiviteten af ​​BAY61-3606 i forbindelse med kolorektal cancer, der giver indsigt i (1) potentielle terapeutiske mål for kræft, der udtrykker mutant K-RAS og (2) veje, der regulerer respons af ikke-mutant celler til målrettede hæmmere. BAY61-3606 blev oprindeligt identificeret som en oralt tilgængelig, ATP-kompetitiv inhibitor af Spleen Tyrosin kinase (SYK) [14]. Da SYK spiller en aktiv rolle i inflammatorisk respons, er BAY61-3606 hovedsageligt blevet brugt til at studere immun celle funktion. F.eks BAY61-3606 undertrykker antigeninduceret luftvejsinflammation i rotter og B cellemigrering i mus [14], [15]. Mens alle virkningerne af BAY61-3606 i immunceller har relation til dets evne til at inhibere SYK, er det uvist, om BAY61-3606 har alternative mål for biologiske relevans i andre cellulære sammenhænge. I denne undersøgelse har vi karakteriseret to SYK-uafhængige aktiviteter forbundet med BAY61-3606 i kolorektale cancerceller.

Metoder

cellelinjer, knockdowns og medicinsk behandling

Alle coloncancer cellelinier blev opretholdt i DMEM suppleret med penicillin (100 enheder /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% føtalt bovint serum (FBS). Rektal cancer cellelinie (CAR1) blev opretholdt i DMEM /F12 suppleret med penicillin (100 enheder /ml) /streptomycin (50 ug /ml) og 5% FBS. Knockdowns blev opnået med pSICOR eller pLKO lentivirusvektorer [16]. Målsekvenserne til knockdowns kan findes i tabel S2. I narkotikabehandlingstjenester eksperimenter blev celler udpladet i 24 timer før eksponering for lægemidlet. AZ-628 blev opnået fra AstraZeneca. CI-1040 blev opnået fra Pfizer. R406 blev syntetiseret på Gray laboratoriet. BAY61-3606 og IKK VII blev købt fra EMD Biosciences. BAY derivater blev syntetiseret til dette studie.

cellecyklusanalyse og cellelevedygtighedsassays

Cellecyklusanalyse blev udført via FACS-baserede propidiumiodid kvantificering, ved anvendelse af standardmetoder. For at måle cellelevedygtighed blev celler dyrket i plader med 96 brønde i nærvær eller fravær af lægemiddel i 72 timer, fikseret med 4% paraformaldehyd, og derefter farvet med Syto60 (Invitrogen). Plader blev afbildet og kvantificeret ved hjælp af LiCor Odyssey systemet (LiCor).

Bio-Plex signalering analyser

Bio-Plex analysesystem blev brugt til at måle signalering i lægemiddelbehandlede celler. Kort fortalt blev celler inkuberet i nærvær af lægemiddel til forskellige mængder af tid og derefter lyseret i Bio-Rad cellelyse-buffer (Bio-Rad). Protein kvantificering blev udført ved anvendelse BCA assay (Pierce) og 5 ug protein fra hver prøve blev anvendt til Bio-Plex analyse. Phospho-signalering analyser blev udført ved hjælp af tilgængelige phospho-signalering assay kits og kvantificeres på en Bio-Plex 200-systemet (Bio-Rad): p-Iκβα (Ser32 /Ser36), p-JNK (Thr183 /Tyr185), p-MEK1 ( Ser217 /Ser221), p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), p-p90RSK (Thr359 /Ser363), p-p38 (Thr180 /Tyr182), pc-jun (Ser63), p-ATF2 (Thr71 ), p-AKT (Ser473), p-S6 (Ser235 /Ser236), p-STAT3 (Ser727), p-STAT3 (Tyr705), og p-GSK3α /β (Ser21 /Ser9). Bio-Plex assay for total MEK1 blev også udført som en loading kontrol. Alle signaler blev normaliseret til en fælles kontrol cellelinje lysat, for analyser mellem plader til at være sammenlignelige.

Biokemiske aktivitetsassays

Den biokemiske aktivitet af BAY61-3606 og derivater blev målt på to måder . Først brugte vi Ambit s KINOMEscan ™ -teknologi til at identificere de kinaser, der er hæmmet af substrat binding af forbindelser, alle analyseret ved 1 uM. For det andet, vi brugte Invitrogens SelectScreen® Biokemisk kinase Profilering service at bestemme de

in vitro

IC50’er for forbindelser mod specifikke kinaser.

Kemisk afledning af BAY61-3603

Detaljer om syntesen af ​​BAY derivater, og strukturerne i de derivater, kan findes i figur S5.

Resultater

AZ-628 og BAY61-3606 undertrykke væksten i celler, der udtrykker K-RAS

G13D

i et forsøg på at identificere nye terapeutiske mål for tarmkræft udtrykker mutant K-RAS, vi spillede en skærm til små molekyle kinase inhibitorer, der påvirker levedygtigheden i en genotype-specifik måde. I disse undersøgelser anvendte vi et sæt isogene coloncancer cellelinier som kun afviger i deres K-ras-mutation status. De parentale cellelinier, HCT-116 og DLD-1, bære en heterozygot aktiverende mutation i K-RAS (G13D /+). De afledte cellelinier, HKE-3 og DKs-8, bevarer vildtype-allelen, men har mistet den mutante allel af K-RAS i kraft af gen-targeting [17]. I overensstemmelse med vores tidligere arbejde [9], fandt vi, at K-RAS mutant celler var overfølsomme over for AZ-628, en pan-RAF-hæmmer [18], [19], sammenlignet med vildtype-celler, men ufølsom over for CI-1040 , en MEK-inhibitor [6] (fig. 1a). Vi fandt også, at BAY61-3606, en Spleen tyrosin kinase (SYK) hæmmer, påvirkede overordnede levedygtighed i HCT-116 og DLD-1 celler i forhold til DS-3 og DKS-8 celler (fig. 1a, fig. S1a).

(a) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter 72 timers AZ-628, CI-1040 eller BAY61-3606 behandling i HCT-116 (K-RAS

G13D /+, rød) eller HKE-3 (K-RAS

– /+, blå) cellelinier. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til DMSO-vehikel behandlet kontrol for hver cellelinie. Fejl- søjler repræsenterer SEM for 3 uafhængige eksperimenter. Celler, der udtrykker mutant K-RAS var relativt følsomme over for AZ-628 og BAY61-3606, men ikke CI-1040. (B) cellecyklus profiler, som bestemt ved propidiumiodid-farvning, af colorektal cancer celler med mutante B-RAF (HT-29) behandlet med CI-1040 eller mutant K-RAS (DLD-1) behandles med BAY61-3606. Mens inhibition af MEK inducerer G1 standsning i HT-29-celler, som det fremgår af tabet af 4N peak, BAY61-3606 syntes ikke at ændre profilen af ​​DLD-1-celler. (C) Cellelevedygtighed af colorektal cancer celler, der udtrykker mutant B-RAF (V600E) efter 72 timers behandling med BAY61-3606 og /eller CI-1040. Celler, der udtrykker mutant B-RAF (HT-29 – fast skitse og RKO – stiplede omrids) var følsomme over for både BAY61-3606 og CI-1040, og disse to inhibitorer samarbejdede for at producere en forbedret respons. (D) Phospho-MEK1 (Ser217 /Ser221) og phospho-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) niveauer i K-RAS vildtype- og mutantceller Efter 45 minutters eksponering for 1 uM AZ-628, 1 uM BAY61-3606, eller kontrol køretøj. Signaler blev målt under anvendelse af Bio-Plex assays. Relativ signal blev normaliseret til en master kontrol lysat. AZ-628 behandling reducerede niveauet af phospho-MEK og phospho-ERK, men BAY61-3606 ikke.

For at bestemme, hvordan BAY61-3606 påvirkede levedygtighed af celler, der udtrykker mutant K-RAS, vi analyserede cellecyklussen af ​​celler behandlet med lægemidlet. Vi fandt, at BAY61-3606 ikke ændrede cellecyklus profil DLD-1-celler, heller ikke inducere apoptose (fig. 1b). I modsætning til colorektale cancerceller, der udtrykker mutante K-RAS, cellelinjer, der udtrykker mutant B-RAF var følsomme for inhibering af MEK og behandling med CI-1040 induceret G1 arrest [6] (fig. 1b, c). Interessant fandt vi, at B-RAF mutante cellelinier var også følsomme over BAY61-3606 og at CI-1040 og BAY61-3606 samarbejdet om at producere en forøget negativ virkning på levedygtigheden af ​​celler, der udtrykker aktiveret B-RAF (fig. 1c). Taget sammen foreslår disse observationer (1) at BAY61-3606 inhiberer et protein, der er nødvendig for generelle levedygtighed i celler, der udtrykker mutant K-RAS eller B-RAF og (2) at BAY61-3606 målretter en vej, der er uafhængig af kanonisk MAPK /ERK-signalering.

for at teste den anden del af denne hypotese direkte, vi målte aktivering staten MEK og ERK i celler, der blev behandlet med BAY61-3606. Vi fandt, at hæmning af RAF med AZ-628 undertrykte MEK og ERK fosforylering, men at BAY61-3606 ikke var i stand til at gøre det (Fig. 1d). Således, mens AZ-628 og BAY61-3606 både selektivt påvirke levedygtigheden i K-RAS mutant celler, de synes at gøre dette gennem forskellige veje, med BAY61-3606 rettet mod en vej, der er uafhængig af MEK og ERK.

SYK er ikke målet for BAY61-3606 i celler, der udtrykker mutant K-RAS

da BAY61-3606 oprindeligt blev udviklet som en ATP-kompetitiv inhibitor af SYK [14], var det ikke overraskende, at det syntes at målrette en MEK /ERK-uafhængig vej. Ikke desto mindre gør HCT-116 celler, som er følsomme over for BAY61-3606, ikke udtrykke påviselige niveauer af SYK, hvilket tyder på, at det ikke kan være mål for BAY61-3606 i denne sammenhæng. For at udforske dette yderligere, vi brugte lentivirale shRNA at vælte SYK i DLD-1 celler (Fig. 2a). Knockdown af SYK ikke påvirke den samlede vækstrate heller ikke påvirke respons DLD-1 celler til BAY61-3606 (Fig. 2b) betydeligt. Desuden har behandling af celler med R406, et strukturelt forskellige inhibitor af SYK, ikke resultere i en præferentiel virkning i celler, der udtrykker mutant K-RAS (fig. 2b). Tilsammen disse resultater antydede, at SYK ikke var relevant mål for BAY61-3606 i kolorektal cancer celler, der udtrykker mutant K-RAS.

(a) Knockdown af SYK protein i DLD-1 celler via shRNA, som vist ved Western Blotting. The Ramos (R) cellelinje, en hæmatopoietisk cellelinie med en høj ekspression af SYK, blev anvendt som en positiv kontrol. (B) Cellelevedygtighed af DLD-1 celler (rød), og dets K-RAS vildtype (DKs-8 – blå) og SYK knockdown (rød skygge) derivater efter 72 timers behandling med 1 uM af BAY61-3606 eller R406, en tydelig SYK-hæmmer. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til DMSO-vehikel behandlet kontrol for hver cellelinie. Fejl- søjler repræsenterer SEM for 3 uafhængige eksperimenter. DLD-1 celler og dens K-RAS vildtype derivat ikke udviser følsomhed over for R406, mens vælte SYK i DLD-1 celler kun minimalt påvirket dens følsomhed over BAY61-3606.

BAY61- 3606-målene et lille antal kinaser

Vi hypotese, at aktiviteten af ​​BAY61-3606 i kolon kræftceller skyldtes en “off-target” effekt af inhibitoren, men lidt blev kendt om promiskuitet af denne særlige forbindelse. At identificere andre potentielle mål for BAY61-3606, vi først analyseret evne BAY61-3606 til kompetitivt at inhibere aktive sted binding i et panel af 402 kinaser. Vi fandt, at 1 pM BAY61-3606 inhiberede binding med mere end 90% for kun 15 kinaser (fig. 3a, tabel 1, tabel S1), hvilket indikerer, at det er en meget selektiv inhibitor, ligner i selektivitet for to kliniske kinaseinhibitorer, Imatinibs og Gefitinib [20]. Da hæmning af aktive site bindende kan, eller ikke kan, være direkte korreleret med hæmning af kinase aktivitet, vi udførte en sekundær analyse, hvor vi bestemt

in vitro

IC50-værdierne for BAY61-3606 mod mange af disse kandidat mål. Denne undersøgelse afslørede MAP4K2, en STE-20 familien kinase, som kinasen mest følsomme over for BAY61-3606, med en

in vitro

IC50 på 11,3 nM (tabel 1).

(a) TREEspot billede, der repræsenterer den inhibitoriske aktivitet af BAY61-3606. Kinaser, der er hæmmet for ATP binding af BAY61-3606 er angivet med røde prikker på det fylogenetiske træ af kinaser. Størrelsen af ​​den røde prik svarer til mængden af ​​hæmning af en uM BAY61-3606. Identiteten af ​​de individuelle kinaser kan findes i tabel S1. (B) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter shRNA-medieret knockdown af de potentielle BAY61-3606 mål i DLD-1 (rød) eller DKS-8 (blue) cellelinier. Relativ cellelevedygtighed normaliseres til de parentale cellelinier inficeret med vektor alene. Fejl søjler repræsenterer SEM for 2 uafhængige forsøg.

Genetisk analyse af potentielle BAY61-3606 mål

For at følge op på vores biokemiske analyser af BAY61-3606 aktivitet, vi brugte lentivirale shRNA at afgøre, om knockdown af en af ​​de potentielle mål kunne phenocopy behandling med lægemidlet (dvs. til selektivt påvirke levedygtigheden af ​​K-RAS mutantceller) (fig. S1c, tabel S2). Til disse undersøgelser vi udnyttet DLD-1 /DKS-8 isogene cellelinier, fordi vi havde brugt dette par til genetisk analyse af SYK (fig. 2). Knockdown af kun en af ​​de potentielle mål, som vi analyseret, HIPK2, var i stand til selektivt at påvirke levedygtigheden af ​​K-RAS mutantceller (fig. 3b). Ikke desto mindre kunne vi kun identificere en enkelt shRNA sekvens, produceret tilstrækkelig knockdown af dette mål. Som følge heraf denne undersøgelse antydede, men ikke afgørende, om en rolle for HIPK2 som et mål på BAY61-3606 i celler, der udtrykker mutant K-RAS. Vi søgte en uafhængig måde at identificere målet for BAY61-3606.

Identifikation af biologisk aktive BAY61-3606 derivater

Sekundært til vores genetiske analyse, vi tog en kemisk tilgang til at studere BAY61-3606 . I denne undersøgelse frembragte vi 30 strukturelt beslægtede derivater af BAY61-3606 og analyseret deres evne til selektivt påvirke levedygtigheden af ​​celler, der udtrykker mutant K-RAS (fig. S2). Af disse 30 derivater, kun én (derivat 6) bevaret sin selektivitet med potens ligner den oprindelige forbindelse (fig. 4a, b, Fig. S1b). Andre (fx derivat 8) bibeholdt selektivitet men tabte styrke. For at løse selektivitet BAY derivat 6 mere bredt, vurderede vi dets aktivitet i et panel af kolorektale cancer cellelinjer, der enten var mutant til vildtype for K-RAS. I overensstemmelse med vores analyse af isogene parvis udtrykker 4/5 cellelinier mutation aktiverede K-RAS svarede på BAY derivat 6 under 0/3 cellelinier udtrykker vild-type K-RAS reagerede (fig. S3).

(a) GI50 værdier for BAY61-3606 derivater udført i HCT-116 (rød) eller DS-3 (blå) celler. Derivat 6 blev valgt til yderligere undersøgelse for dets forøget styrke og specificitet for K-RAS mutantceller. (B) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter 72 timers udsættelse for BAY-derivat 6 i HCT-116 (rød) eller DS-3 (blå) celler. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til DMSO-vehikel behandlet kontrol for hver cellelinie. Fejl- søjler repræsenterer SEM for 3 uafhængige eksperimenter. HCT-116 celler var relativt følsomme over for BAY derivat 6.

For at sammenligne med BAY61-3606, vi analyseret evne flere derivater til kompetitivt hæmme aktive site bindende i et stort panel af kinaser. Bemærkelsesværdigt, hver af derivaterne, der blev testet i det væsentlige tabt deres evne til kompetitivt at inhibere aktive sted binding af 402 kinaser, der blev analyseret, herunder HIPK2 (fig. S4). I overensstemmelse med denne observation,

in vitro

aktivitetsassays viste et tab af kinase hæmning aktivitet for de to testede (fig. S5) derivater.

BAY61-3606 mål MAP4K2 at påvirke respons af vilde -type celler til AZ-628

i analysen af ​​de relative aktiviteter af AZ-628 og BAY61-3606, vi testede, om disse to forbindelser ville samarbejde om at producere en forbedret effekt i celler, der udtrykker mutant K-RAS, svarende til den kooperative effekt set med CI-1040 og BAY61-3606 i celler, der udtrykker mutant B-RAF. AZ-628 og BAY61-3606 samarbejdede ikke i HCT-116-celler (fig. 5a), dog tyder på, at de kan målrette en fælles vej. Interessant disse to inhibitorer samarbejdede til negativ indflydelse levedygtigheden af ​​celler, der udtrykker vildtype K-RAS. I det væsentlige, HKE-3 celler, der var formelt resistente over for AZ-628 blev følsomme, når de også blev behandlet med BAY61-3606 (fig. 5a). BAY derivat 6, som bevarede sin evne til selektivt at undertrykke proliferation i celler, der udtrykker mutant K-RAS (fig. 4b), mistet sin evne til at samarbejde med AZ-628 i celler, der udtrykker vildtype-K-RAS (fig. 5b).

(a) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter 72 timers kombinatorisk behandling med forskellige koncentrationer af BAY61-3606 og 1 uM AZ-628 i HCT-116 (rød linje) eller DS-3 (blå linjer) celler. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til DMSO-vehikel behandlet kontrol for hver cellelinie. Fejl- søjler repræsenterer SEM for 3 uafhængige eksperimenter. De to inhibitorer samarbejder i vildtypeceller, men ikke i celler, der udtrykker mutant K-RAS. (B) Cellelevedygtighed efter 72 timers kombinatorisk behandling med varierende koncentrationer af BAY afledte 6 og 1 uM AZ-628 i HCT-116 og DS-3-celler. BAY derivat 6 giver ikke ekstra følsomhed over for AZ-628 upon HKE-3 celler. (C) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter 72 timers AZ-628 behandling i HCT-116 eller DS-3 cellelinjer med MAP4K2 knockdown. Tab af MAP4K2 påvirker ikke AZ-628 respons i celler, der udtrykker mutant K-RAS, men øger virkningen af ​​AZ-628 i celler, der udtrykker vild-type K-RAS. (D) Cell levedygtighed efter 72 timers kombinatorisk behandling med 1 uM BAY61-3606 og 1 pM alene AZ-628 (skraveret) eller 1 pM AZ-628 (klar) i DS-3 celler med MAP4K2 knockdown. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til 1 um AZ-628 behandlede prøver. I forældrenes HKE-3 celler, BAY61-3606 giver følsomhed over for AZ-628. Ved tab af MAP4K2, sensibiliserer BAY61-3606 ikke længere.

Med undtagelse af SYK, BAY61-3606 var mere end 10 gange mere effektive til at inhibere MAP4K2 end nogen anden kinase. Desuden BAY derivat 6 mistet sin evne til effektivt at inhibere

in vitro

kinaseaktiviteten af ​​MAP4K2 (fig. S5). Baseret på disse observationer, vi undersøgt, om MAP4K2 spiller en rolle i følsomheden af ​​vildtype og K-RAS mutantceller til BAY61-3606. HKE-3 og Dks-8 celler, der mangler MAP4K2 var overfølsomme over for AZ-628, mens MAP4K2 knockout havde ingen virkning på reaktionen af ​​HCT-116 eller DLD-1-celler (fig. 5c, fig. S6A). Vi ræsonnerede, at hvis inhibering af MAP4K2 af BAY61-3606 udgjorde den ændret respons af vildtypeceller til AZ-628, derefter K-RAS vildtype celler, der mangler MAP4K2 ville ikke blive yderligere sensibiliseret til AZ-628 ved behandling med BAY61- 3606. Som forudsagt, BAY61-3606 og AZ-628 ikke samarbejdsvilligt påvirke levedygtigheden i HKE-3 celler mangler MAP4K2 (fig. 5d). Resultaterne antyder kraftigt, at BAY61-3606 ændrer responset af celle, der udtrykker vildtype K-RAS til AZ-628 ved at inhibere kinaseaktiviteten af ​​MAP4K2.

MAP4K2 aktiverer NFKB-vejen til at modvirke AZ628-afhængig vækstinhibering

Da MAP4K2 er vigtig for respons af vildtypeceller til AZ-628, vi næste spurgt, hvordan MAP4K2 funktioner til at regulere respons på RAF inhibering. At identificere den pathway ansvarlig for MAP4K2 handling, anvendte vi Bio-Plex phospho-proteinanalyse at måle effekterne af MAP4K2 knockdown på forskellige cellulære signalveje. I alt vi profileret 13 phospho-proteiner: Iκβα (Ser32 /Ser36), JNK (Thr183 /Tyr185), MEK1 (Ser217 /Ser221), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), RSK (Thr359 /Ser363) , p38 (Thr180 /Tyr182), c-jun (Ser63), ATF2 (Thr71), AKT (Ser473), S6 (Ser235 /Ser236), STAT3 (Ser727), STAT3 (Tyr705), og GSK3α /β (Ser21 /Ser9 ) (fig. S7). Vi fandt to forskelle mellem HKE-3 og HCT-116, som vi postulerede kan være relateret til funktionen af ​​MAP4K2. Først fandt vi, at det basale niveau af Iκβα phosphorylering var signifikant lavere i HCT-116 end i HKE-3-celler, hvilket antyder, at NFκβ signalering undertrykkes i celler, der udtrykker aktiveret K-RAS (fig. S7). Iκβα phosphorylering blev yderligere fremkaldt i HKE-3-celler efter behandling med AZ-628 og denne induktion var afhængig MAP4K2 (fig. 6a). Denne observation er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser forbinder MAP4K2 til NFκβ signalering [21]. For det andet, fandt vi, at JNK var stærkt aktiveret i HKE-3-celler efter behandling med AZ-628 (fig. S7). Selv MAP4K2 tidligere er blevet forbundet med JNK signalering, havde denne aktivering ikke synes at kræve MAP4K2 (fig. S6B).

(a) Tidsforløb for phospho-Iκβα (Ser32 /Ser36) aktivering efter en uM AZ- 628 behandling i HCT-116 (røde linjer) eller DS-3 (blå linje) celler med MAP4K2 banke ned, målt via Bio-Plex. Relativ signal blev normaliseret til en master kontrol lysat. Fejl- søjler repræsenterer SEM for 3 uafhængige eksperimenter. NFκβ signalering blev styrket i HKE-3 celler efter eksponering for AZ-628 og dette var afhængig MAP4K2. (B) Cellelevedygtighed kvantificeret ved Syto60 efter 72 timers kombinatorisk behandling med IKK inhibitor VII og 1 uM AZ-628. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til DMSO-vehikel behandlet kontrol for hver cellelinie. Ligesom BAY61-3606, IKK inhibitor VII forbedret virkningen af ​​AZ-628 specifikt i K-RAS vildtypeceller. (C) Cell levedygtighed efter 72 timers kombinatorisk behandling af en uM IKK inhibitor VII og 1 pM AZ-628 (skraveret) eller 1 pM AZ-628 alene (klar) i HKe3 celler med MAP4K2 knockdown. Relativ cellelevedygtighed blev normaliseret til 1 um AZ-628 behandlede prøver. Tab af MAP4K2 ophævet evne IKK inhibitor VII at sensibilisere HKE-3-celler til AZ-628.

Siden NFκβ blev syntes at Hyper-aktiveret i vildtypeceller i en MAP4K2-afhængig måde, vi formodede, at hæmning af NFκβ vej ville have den samme virkning som BAY61-3606 eller MAP4K2 knockdown. Det vil sige, vi forventede, at inhibering af NFκβ ville forøge følsomheden af ​​K-RAS vildtypeceller til AZ-628 uden at påvirke følsomheden af ​​K-RAS mutantceller. Som forudsagt, inhibering af NFκβ øget følsomhed HKE-3 og Dks-8 celler til AZ-628, i det væsentlige phenocopying MAP4K2 knockdown (Fig. 6b, fig. S6c). Derimod har inhibering af JNK ikke ændre følsomheden af ​​HKE-3-celler til AZ-628 (fig. S6d). Endvidere, som med BAY61-3606 behandling, knockdown af MAP4K2 afskaffet evne NFκβ inhibering at sensibilisere vildtypeceller til AZ-628 (fig. 6c). Ud fra disse data, konkluderer vi, at MAP4K2 fungerer opstrøms i NFκβ vej til at regulere respons kolorektal cancer celler til hæmning af RAF.

Diskussion

K-RAS er mutation aktiveres i ca. 40% af tarmkræft [2]. Aktiveret K-RAS menes at give onkogenicitetsstudie via sine kanoniske nedstrøms signalveje, fx RAF-MEK-ERK (MAPK) signaleringskaskade. I overensstemmelse med denne idé, aktiverende mutationer i B-RAF forekommer i 15% af tarmkræft, og de er gensidigt udelukkende med K-RAS mutationer [22]. Alligevel inhibering af MAPK signalering, typisk ved direkte inhibering MEK, har stort set været ineffektiv til behandling af K-RAS mutant colorectal cancer [9], [23]. Den manglende effekt af MEK-inhibitorer i denne sammenhæng kan skyldes den pleiotropiske funktion af K-RAS, som har vist sig at fremme transformation gennem PI3K og RAL effektor pathways foruden MAPK [24], [25]. Alligevel PI3K pathway mutationer også forekomme i kolorektale cancere og er ofte sammenfaldende med K-RAS mutationer, hvilket antyder, at PI3K ikke er en fælles effektor af K-RAS signalering i tyktarmskræft [26]. Og mens PI3K mutationer er blevet associeret med resistens mod MEK-inhibitorer i cancercellelinier [27], [28], K-RAS mutant coloncancerformer fra genetisk manipulerede mus er uløseligt resistente over for inhibering af MEK [9]. Vores data er i overensstemmelse med en alternativ forklaring på den manglende effekt af MEK-inhibitorer i tarmkræft udtrykker mutant K-RAS -., At der findes en alternativ /parallel vej nedstrøms for B-RAF, der medierer K-RAS-induceret onkogenicitetsstudie

i vores undersøgelse, vi kendetegnet aktiviteten af ​​et lille molekyle, BAY61-3606, som fortrinsvis påvirket levedygtighed i colorektale cancerceller, der udtrykker mutant K-RAS sammenlignet med isogene celler der kun udtrykker vild-type K-RAS (fig. 1a, fig. S1a). Da BAY61-3606 er en ATP-konkurrence kinase inhibitor, dens evne fortrinsvis påvirke celler, der udtrykker mutant K-RAS oprindeligt foreslået, at det mål en kinase fungerende neden for K-RAS at fremme spredning. Vi har tidligere vist, at K-RAS fremmer coloncancer celleproliferation gennem en RAF-afhængig, men MEK-uafhængig, signalvejen [9]. Tre stykker af beviser implicerer BAY61-3606 som en inhibitor af denne MEK-uafhængige vej nedstrøms for RAF. For det første har BAY61-3606 ikke samarbejder med AZ-628 i celler, der udtrykker mutant K-RAS (fig. 5a), hvilket tyder på, at disse inhibitorer målrettet en fælles vej. For det andet, BAY61-3606 påvirkede væksten i KRAS mutantceller, men i modsætning til AZ-628, påvirkede ikke phosphoryleringstilstanden af ​​MEK eller ERK (fig. 1d). Endelig BAY61-3606 bremset væksten af ​​kolorektal cancer celler, der udtrykker mutant B-RAF og samarbejdede med en MEK-inhibitor til at producere en forstærket reaktion i disse celler (fig. 1c).

Selvom BAY61-3606 blev oprindeligt karakteriseret som en ATP konkurrencedygtig kinase inhibitor, dets selektivitet for at nedsætte levedygtigheden af ​​K-RAS mutant celler kan ikke kræve denne aktivitet. Vore studier af BAY61-3606 derivater viser, at de mangler evnen til at påvirke aktive site binding kan stadig opretholde deres evne til selektivt påvirke cellernes levedygtighed. En mulig forklaring på denne observation er, at det relevante mål for BAY61-3606 og dets biologisk aktive derivater er et ikke-kinase protein. Bortset fra inhibering kinaser, kan ATP-analoger påvirke biologi gennem andre processer, herunder nukleinsyrer syntese [29], [30] og mikrotubulus motordrevet transport [31]. Alternativt kan den relevante mål ikke være blandt de 402 kinaser, der blev undersøgt i vores analyse eller BAY61-3606 og derivater kunne hæmme kinase aktivitet uden at påvirke aktive site binding. Hvis det er tilfældet, ville de ikke score i vores skærm

Ud over sin aktivitet i celler, der udtrykker mutant K-RAS eller B-RAF, vi også identificeret en sekundær biologisk effekt af BAY61-3606.; det tillagt vildtypeceller, der normalt er resistente over for AZ-628, følsomhed over for RAF inhibering (fig. 5a). Ved hjælp af en række metoder, identificerede vi MAP4K2 som mål for BAY61-3606 i vildtypeceller.