PLoS ONE: Den følsomhed af kræftceller til pheophorbid a-Based Fotodynamisk terapi forstærkes af Nrf2 Silencing

Abstrakt

Fotodynamisk terapi (PDT) har vist sig som en effektiv behandling for forskellige solide tumorer. Transkriptionsfaktoren Nrf2 er kendt for at beskytte mod oxidativt og elektrofile stress; men dens konstitutiv aktivitet ved cancer giver resistens mod anticancerlægemidler. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi Nrf2 signalering som en potentiel molekylær determinant af pheophorbid a (Pba) -baseret PDT ved hjælp af

Nrf2

-knockdown brystcarcinom MDA-MB-231-celler. Celler med stabil

Nrf2

knockdown viste forbedret cytotoksicitet og apoptotisk /nekrotisk celledød efter PDT sammen med øgede niveauer af singlet oxygen og reaktive ilt arter (ROS). En konfokal mikroskopisk visualisering af fluorogent Pba viste, at

Nrf2

-knockdown celler akkumulerer mere Pba end kontrol celler. En efterfølgende analyse af ekspressionen af ​​membran lægemiddeltransportere viste, at den basale ekspression af

BCRP

er Nrf2-afhængig. Blandt målte narkotika transportører, den basale udtryk for brystkræft modstand protein (BCRP, ABCG2) blev kun mindskes ved

Nrf2

-knockdown. Desuden efter inkubation med BCRP specifikke inhibitor, differential cellulær Pba ophobning og ROS i to cellelinjer blev afskaffet. Desuden

Nrf2

-knockdown celler udtrykker lave peroxiredoxin 3 sammenlignet med kontrollen, hvilket indebærer, at formindsket mitokondrie ROS forsvarssystem kan bidrage til PDT sensibilisering. Rollen for Nrf2-BCRP vej hos Pba-PDT respons blev yderligere bekræftet i coloncarcinom HT29-celler. Konkret

Nrf2

knockdown resulterede i forøget celledød og forøget singlet oxygen og ROS niveauer efter PDT gennem den formindskede udtryk for BCRP. Tilsvarende blev PDT-induceret ROS-generering væsentligt forøget ved behandling med

Nrf2

shRNA i brystcarcinoma MCF-7-celler, coloncarcinom HCT116 celler, renale carcinoma A498 celler og glioblastoma A172 celler. Tilsammen indikerer disse resultater, at manipulation af Nrf2 kan forbedre Pba-PDT følsomhed i flere kræftceller

Henvisning:. Choi Bh, Ryoo Ig, Kang HC, Kwak MK (2014) Den følsomhed af kræftceller til pheophorbid a-Based Fotodynamisk terapi forstærkes af

Nrf2

Silencing. PLoS ONE 9 (9): e107158. doi: 10,1371 /journal.pone.0107158

Redaktør: Michael Hamblin, MGH, MMS, USA

Modtaget: Maj 2, 2014 Accepteret: August 6, 2014; Udgivet: 16 September, 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Research Foundation (NRF) finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (NRF-2013R1A2A2A01015497). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Fotodynamisk terapi (PDT) har vist sig som en effektiv behandling i adskillige faste tumorer [1] – [3]. PDT kræver tre elementer: i) en fotosensibilisator, der selektivt kan målrettes mod tumorvæv, ii) en passende lyskilde, som udsender lav-energi og tissue-gennemtrængende lys, og iii) molekylært oxygen [4]. Det første trin i PDT er aktivering af en fotosensibilisator af lys. Når den aktiverede fotosensibilisator i sine ophidsede tilstand vender tilbage til sin grundtilstand, overfører sin energi til ilt og genererer singlet oxygen (

1O

2), en meget reaktive og kortlivede reaktive ilt arter (ROS), som en type II reaktion. Samtidig kan den aktiverede fotosensibilisator reagere direkte med cellulære bestanddele og overførsler et hydrogenatom dannende radikaler, som til sidst producerer oxidationsprodukter gennem reaktion med oxygen (type I reaktion) [5]. Singlet oxygen og ROS er stærkt oxiderende molekyler; derfor PDT-behandlede celler undergår celledød gennem både nekrose og apoptose [6]. Ud over den direkte effekt på tumorceller, PDT påvirker tumorens mikromiljø ved at ødelægge sin mikrovaskulatur og ved at forbedre inflammatoriske reaktioner og tumor-specifikke immunreaktioner [4], [7], [8].

pheophorbid en (Pba) er et produkt af klorofyl opdeling, der er isoleret fra avlen ekskrementer [9] og kinesisk lægeurt

Scutellaria barbarta

[10]. PBA absorberer lys ved længere bølgelængder end den første generation fotosensibilisator Photofrin. Den maksimale bølgelængde Pba er 666 nm, mens den for Photofrin er 630 nm [11]. Fordi penetration væv forøges ved længere bølgelængder, er Pba været betragtet som en fotosensibilisator til behandlingen af ​​store tumorer i bughulen [12]. Svarende til Photofrin, Pba inducerer apoptose og nekrose i pancreatisk carcinom, leukæmi, og hepatocellulære carcinomceller [13] – [15]. I uterine carcinomaceller, den underliggende mekanisme af apoptose er Pba akkumulering i mitokondrier, hvilket fører til dannelsen af ​​ROS og frigivelse af cytochrom c [16], [17]. Tilsvarende Pba forårsager mitokondrier-afhængige apoptose i brystcarcinoma MCF-7-celler [18]. Adskillige

in vivo

dyreforsøg har støttet effektiviteten af ​​Pba-PDT at forebygge tumorigenese. For eksempel kan en liposomal fremstilling af Pba-PDT forsinket tumorvækst i et coloncarcinom HT29 xenograft [19]. Intravenøs administration af 0,3 mg /kg Pba efterfulgt af lysbestråling signifikant inhiberede tumorvækst i nøgne mus, der huser et humant hepatoma xenograft [11].

En faktor, der bestemmer effektiviteten af ​​PDT er ekspressionen af ​​ATP-bindende kassette ( ABC) transportører i målvævet. Disse transportører styre den intracellulære akkumulering af fremmede kemikalier ved aktivt at transportere dem ud af cellen [20]. Den brystkræft modstand protein (BCRP eller ABCG2) er en ABC transporter, der oprindeligt blev identificeret i doxorubicin-resistente brystkræftceller [21]. Overekspression af BCRP i tumorer bibringer resistens over for kemoterapi [22]. Foruden anticancerlægemidler har BCRP blevet vist at transportere porphyrin-typen fotosensibilisatorer. Specifikt HEK-celler, der overudtrykker BCRP var resistente over for Pba-induceret cytotoksicitet [23]. Samtidig,

BCRP

-knockout mus var meget modtagelige for kosten Pba-induceret hud fototoksicitet [24].

transskription faktor NF-E2-relateret faktor 2 (Nrf2) er en medlem af cap’n’collar familie af basale leucin-zipper (CNC-bzip) transkriptionsfaktorer [25]. Nrf2 aktivitet er primært reguleret af cytoplasmatiske protein Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (KEAP1) [26], [27]. Gennem binding til Neh2 domæne Nrf2, KEAP1 medierer ubiquitinylation og efterfølgende proteasomalaktivitet nedbrydning af Nrf2. Under betingelser med oxidativt og elektrofile stress, Nrf2 er befriet fra KEAP1 og translokerer ind i kernen, hvilket resulterer i transkriptionen af ​​multiple mål-gener, der koder afgiftende enzymer, antioxidant proteiner, stress-respons-proteiner og lægemiddeltransportere [28] – [30] . Fordi sit mål gener har cytobeskyttende virkninger, er Nrf2 betragtes som en kritisk aktør i forsvarssystem mod oxidativ og elektrofile stress [31]. Derfor har flere undersøgelser vist, at genetiske sletning af

Nrf2

er forbundet med øget modtagelighed for vævsskader og skade som følge af miljø- og endogene stressfaktorer [28], [31], [32]. På den anden side, og flere tegn på, at cancerceller udnytte Nrf2 systemet for overlevelse ved at tilpasse sig det belastende tumormikromiljøet [33]. Nrf2 signalering konstitutivt aktiveret i flere tumortyper og dyrkede cancercellelinjer, der er forbundet med øget tumorvækst og modstand mod kemoterapeutiske midler. I kræftceller er Nrf2 signalering opreguleret efter udsættelse for kemoterapeutiske lægemidler, som giver det erhvervede resistens mod kemoterapi [34] – [36]. Tilsvarende PDT med hypericin i humane blære-carcinomaceller resulterede i forhøjet ekspression af nuklear Nrf2 protein og hæm oxygenase-1 (HO-1) gennem p38

MAPK og PI3K pathways [37]. Behandling af HepG2-celler med en ikke-toksisk koncentration af Pba efterfulgt af foto-aktivering i 90 min resulterede i forøget ekspression af BCRP og hæm oxygenase-1 (HO-1) i en Nrf2-afhængig måde [38].

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi Nrf2 som en ny molekylær determinant for PDT virkningsfuldhed. Fordi Nrf2 regulerer ekspressionen af ​​ROS-modvirkende komponenter og flere stoffer transportører, vi hypotese, at manipulere Nrf2 ekspression ville forbedre effektiviteten af ​​PDT. For at teste denne hypotese, vi etableret en stabil

Nrf2

-knockdown cellelinjer anvendelse af human bryst carcinom MDA-MB-231 celler og coloncarcinom HT29-celler, og måles PDT følsomhed. Vores resultater viste, at

Nrf2

knockdown forøger PDT-induceret celledød ved at øge produktionen af ​​ROS. Som en underliggende mekanisme blev BCRP udtryk undertrykt af

Nrf2

Knockdown, hvilket fører til øget cellulær ophobning af Pba og øget produktion af singlet oxygen.

Materialer og metoder

Materialer

Pba var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA). Nrf2 antistof blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Antistoffer, der genkender AKR1C1 og BCRP blev indkøbt fra Abnova (Taipei City, Taiwan) og Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), hhv. PRDX3 og β-tubulin-antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Ko143, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), og puromycin blev opnået fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). 5 (6) -Carboxy-2 ‘, 7’-dichlorofluorescein diacetat (DCFDA), trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren, og MitoGreen blev indkøbt fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Det lentiviral systemet indeholder en pre-designet menneske

Nrf2

shRNA og uspecifik scrambled RNA (scRNA) blev købt fra Sigma-Aldrich.

Cell kultur

Den menneskelige brystkræft celle line MDA-MB-231 og MCF-7, tyktarmskræft cellelinien HT29 og HCT116 og human renal carcinoma A498 blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Den humane glioblastom-cellelinje A172 blev købt fra koreansk cellelinje Bank (Seoul, Sydkorea). MDA-MB-231, MCF7, A498, A172, og HCT116 blev holdt i et medium indeholdende Dulbeccos modificerede Eagle-medium og Nutrient Mixture F-12 (Hyclone, Utah, USA) i forholdet 1:01 suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og penicillin /streptomycin (WelGene Inc., Daegu, Sydkorea). HT29 blev opretholdt i RPMI-1640-medium (Hyclone) med 10% FBS og penicillin /streptomycin. Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære.

Produktion af lentivirale partikler indeholdende

Nrf2

shRNA ekspressionsplasmid

Lentivirale partikler med shRNA blev produceret i HEK 293T celler efter transfektion af celler med

Nrf2

shRNA ekspressionsplasmid og emballagen mix (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt blev HEK 293T-celler podet i 60 mm plader ved en densitet på 7 x 10

5 celler pr. Den næste dag blev mediet erstattet af OptiMEM (Life Technologies) og efterfølgende, 1,5 ug pLKO.1-Nrf2 shRNA, som indeholder det humane

Nrf2

-specifik shRNA (5′-CCGGGCTCCTACTGTGATGTGAAATCTCGAGATTTCACATCACAGTAGGA-3 ‘), og emballagen mix blev transficeret ind i celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Den pLKO.1-scRNA plasmid blev anvendt som en ikke-specifik kontrol-RNA. På den anden dag, efter fjernelse af transfektion kompleks, blev det komplette medium tilsat til hver brønd. Medier indeholdende lentivirale partikler blev høstet efter 4 dage.

Etablering af

NRF

knockdown cellelinje

MDA-MB-231 celler i 6-brønds plade blev inkuberet med lentivirale partikler indeholdende enten scRNA eller Nrf2 shRNA ekspressionsplasmid. Efter en 48 h-inkubation blev cellerne udvundet i det komplette medium og puromycin (1 ug /ml) selektion blev fulgt i op til 4 uger.

Nrf2

knockdown HT29 cellelinje blev etableret som tidligere rapporteret [39].

Forbigående knockdown af Nrf2

MCF-7, HCT116, A172 og A498-celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

5 celler /brønd og dyrket natten over. Næste dag blev cellerne inkuberet med kolesterol i 15 minutter og derefter blev den lentivirale partikel indeholdende scRNA eller shNRF2 tilsat til hver brønd. Efter 48 timers inkubation blev viruspartikel-holdige medier fjernet, og cellerne blev udvundet i frisk medium natten over.

PDT og MTT-analyse

MDA-MB-231 og HT29 blev podet ved en densitet på 7 x 10

3 celler /brønd i plader med 96 brønde og inkuberet i 20 timer. Cellerne blev behandlet med Pba (0-2,5 ug /ml) i 6 timer og derefter bestrålet med 0,3 (HT29) eller 0,6 J /cm

2 (MDA-MB-231) laser i fravær af Pba. For laserbestråling, den 670 nm LED Hybrid Lampe systemet (Quantum Spectra Life, Barneveld, WI) blev anvendt. Cellerne blev udvundet i komplet medium i 18 timer og inkuberet med MTT i 4 timer. Efter fjernelse af MTT-opløsning blev 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) tilsat til hver brønd, og absorbansen blev målt ved 570 nm under anvendelse af en Spectro-star Nano mikropladelæser (BMG Labtechnologies, Offenburg, Tyskland).

Cytotoksicitet måling

cytotoksicitet ved PDT blev vurderet ved anvendelse CytoTox-Fluor assaysystem (Promega, Madison, WI, USA). Efter PDT blev cellerne opretholdt i 24 timer og derefter 50 pi bis-AAF-R110-substrat blev tilsat til hver brønd. Substrat indeholdende opløsning blev inkuberet i yderligere 2 timer med orbital omrystning ved 37 ° C. Intensiteter af fluorescens blev målt ved hjælp af en SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved 485 nm Ex /520 nm Em.

Total RNA ekstraktion og real-time PCR-analyse

Totale RNA’er blev isoleret fra celler ved anvendelse en Trizol-reagens (Life Technologies). Til syntese af cDNA’er, revers transkriptase (RT) blev udført ved at inkubere 200 ng af total RNA med en reaktionsblanding indeholdende 0,5 pg /pl oligo dT

12-18 og 200 U /pl Moloney Murine Leukemia Virus RT (Life Technologies). For real-time polymerase-kædereaktion (PCR) analyse blev Roche LightCycler (Mannheim, Tyskland) anvendes med Takara SYBR Premix ExTaq systemet (Otsu, Japan). Primere blev syntetiseret ved Bioneer (Daejeon, Sydkorea) og primersekvenserne for de humane gener er:

Nrf2

, 5′-ATAGCTGAGCCCAGTATC-3 ‘og 5′-CATGCACGTGAGTGCTCT-3’;

HO-1,

5′-GCTGCTGACCCATGACACCAAGG-3 ‘og 5′-AAGGACCCATCGGAGAAGCG-GAG-3’; aldo-keto reduktase 1C1 (

AKR1C1),

5′-CGAGAAGAACCATGGGTGGA-3 ‘og 5′-GGCCACAAA-GGACTGGGTCC-3’; NAD (P) quinon oxidoreduktase-1 (

NQO1

), 5’CAGTGGTTTGGAGTCCCTGCC-3 ‘og 5′-TCCCCGTGGATCCCTTGCAG-3’; de katalytiske underenheder af γ-glutamat cystein ligase (

GCLC

), 5′-TGAAGGGACACCAGGACAGCC-3 ‘og 5′-GCAGTGTGAACCCAGGACAGC-3’; epoxidhydrolase-1 (

EPHX1

), 5′-GCCTGCACTTGAACATGGCT-3 ‘og 5′-ATGTGCATGTAGCCGCTCTC-3’; superoxiddismutase 1 (

SOD1

), 5′-GATTCCATGTTCATGAGTTT-3 ‘og 5′-AGGATAACAGATGAGTTAAG-3’;

SOD2

, 5′-AACCTCACATCAACGCGCAGAT-3’and 5′-TCAGTGCAGGCTGAAGAGCTAT-3 ‘; katalase (

CAT

), 5’GTGCATGCAGGACAATCAGG-3 ‘og 5′-GAATGCCCGCACCTGAGTAA-3’; peroxiredoxin 3 (

PRDX3

), 5’GCCGTTGTCAATGGAGAGTTC-3 ‘og 5′-GCAAGATGGCTAAAGTGGGAA-3’;

PRDX5

, 5’GGTGGCCTGTCTGAGTGTTA-3 ‘og 5’ACCACCATGGAGAACCTCTTG-3’; glutathionperoxidase 1 (

GPX1

), 5′-TTCCCGTGCAACCAGTTTG-3 ‘og 5′-TTCACCTCGCACTTCTCGAA-3’;

GPX4

, 5′-TCACCAAGTTCCTCATCGACA-3 ‘og 5’GCCACACACTTGTGGAGCTA-3’; glutathion reduktase (

GSR

), 5′-ACCCCGATGTATCACGCAGTTA-3 ‘og 5′-TGTCAAAGTCTGCCTTCGTTGC-3’; glutaredoxin 2 (

GLRX2

), 5′-GTATTGCTCTCCATCCTCCTCG-3 ‘og 5’CTGGGAGCCTTTATGAGCGT-3’. thioredoxin-2 (

TXN2

), 5′-CACACCACTGTGCGTGGAAA-3 ‘og 5′-ACTGTAACACCCAACCCAGC-3’; brystkræft resistens protein (

BCRP /ABCG2

), 5’CACAACCATTGCATCTTGGCTG-3 ‘og 5’TGAGAGATCGATGCCCTGCTTT-3’; multilægemiddelresistens protein 1 (

MDR1 /ABCB1

), 5′-CTATGCTGGATGTTTCCGGT-3 ‘og 5′-TCTTCACCTGGCTCAGT-3’; multiresistens-associeret protein 1 (

MRP1 /ABCC1

), 5′-AGCTTTATGCCTGGGAGCTGGC-3 ‘og 5′-CGGCAAATGTG- CACAAGGCCAC-3’;

MRP2 /ABCC2,

5′-GCTGCCACACTTCAGGCTCT-3 ‘og 5′-GGCAGCCAGCAGTGAAAAGC-3’;

MRP3 /ABCC3,

5′-ATACGCTCGCCACAGT-CCTT-3 ‘og 5′-GCTGGCCATGATGACCACAA-3’;

MRP4 /ABCC4

, 5′-CTTG- GATCGCAA-TACCCTTG-3 ‘og 5′-GACACCTCTCTTCTGCTTTG-3’;

MRP5 /ABCC5,

5′-CAGAGACCGTGAAGATTCCA-3 ‘og 5′-TTTGGAAGTAGTCCGGATGG-3’;

MRP6 /ABCC6,

5′-TGTGTGGCTCACCACGATG-3 ‘og 5′-CATAGGTAG- GTGGACAG-GTGG-3’; organisk kation transportør roman 1 (

OCTN1;

SLC22A4), 5′-GCTGTATGTCTTCACTGCTG-3 ‘og 5′-GGTGAGGATTCCAATCAGGA-3’;

OCTN2 Hotel (

SLC22A5

), 5′-ATTGTTGTGCCTTCCACTATC-3 ‘og 5′-GGTCATCCACAGCATTATGG-3’; multidrug og toksin ekstrudering transportør 2 (

MATE2

;

SLC47A2

), 5′-TTCATTCCAGGACTTCCGGTG-3 ‘og 5′-AGGTGTGAGTGAGATGGATGG-3′; hypoxanthin phosphoribosyltransferase-1 (HPRT1), 5’-TGGCGTCGTGATTAGTGATG-3 ‘og 5′-GCTACAATGTG-ATGGCCTCC-3’.

Måling af singlet oxygen

Cellerne blev udsået i et dækglas parabol (SPL Life science, Gyeonggi-do, Sydkorea) og dyrkes i natten over. Efter PBA-laser bestråling blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med 50 pM trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren (Life Technologies) i 30 min. For kerner farvning blev Hoechst 33342 (H342) tilsat til ovennævnte skåle og inkuberet i 10 min. Grøn fluorescens fra singlet oxygen blev fundet straks med en LSM 710 konfokalt mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland) og intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af en ZEN2011 software (Carl Zeiss).

Måling af intracellulær ROS

Cellular ROS-niveauer blev undersøgt under anvendelse af en celle-permeable fluorogent probe, carboxy-H

2DCFDA. Cellerne blev podet i et dækglas bund skålen (SPL Life Science) og yderligere inkuberet natten over. Efter PBA-laserterapi blev celler vasket med PBS og inkuberet med 30 pM af carboxy-H

2DCFDA i 30 minutter ved 37 ° C. For kerner farvning, blev H342 inkuberet i 10 min. Så konfokal billeder blev opnået og grønne fluorescerende intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af en LSM 710 konfokalt mikroskop og ZEN2011 software

Måling af Pba ophobning

Pba er et fluorogent stof.; derfor niveauet af intracellulær akkumulering af Pba blev bestemt ved måling rød fluorescens i cellen. MDA-MB-231 og HT29 på cover objektglas blev inkuberet med Pba i 6 timer. Derefter Pba blev fjernet, og gange vask med PBS blev fulgt. Intensiteter af Pba rød fluorescens blev kvantificeret i konfokale billeder med ZEN2011 software. Som en alternativ måde til kvantificering, blev celler podet i 96-brønds plader (BD Biosciences) og inkuberet med Pba i 6 timer. Efter cellen vask blev Pba rød fluorescens detekteres ved anvendelse af et CellInsight Personlig Cell Imager (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og intensiteter blev kvantificeret ved CellInsight software (Thermo Fisher Scientific).

Fluorometric bestemmelse af intracellulær PBA

Celler i plader med 96 brønde blev inkuberet med PBA i 6 timer og derefter blev lyseret under anvendelse af 1% SDS efter PBS vask. DMSO blev sat til cellelysater at opløse cellulære Pba og fluorescensintensiteten blev målt ved hjælp af en SpectraMax M5 ved 415 nm Ex /673 nm Em.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret med RIPA buffer (50 mM Tris [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA og 1% nonyl phenoxypolyethoxylethanol 40) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Sigma-Aldrich). For BCRP protein ekstraktion blev 0,1% SDS tilsat til RIPA buffer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af en DC-protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De proteinprøver blev adskilt ved elektroforese på 12% SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Whatman, Dassel, Tyskland). Derefter blev membranen blokeret med 5% skummetmælk eller 3% bovint serumalbumin i 1 time og inkuberet med antistoffer. De chemiluminescens Billederne blev taget med et Fujifilm LAS-4000 mini Imager (Fujifilm, Tokyo, Japan) og intensiteter blev kvantificeret med tilhørende software.

Flowcytometri

NRFi-MDA-celler blev podet i 60 cm

2 retter på en tæthed på 1 x 10

5 celler /brønd og dyrket natten over. Efter PBA-laser bestråling blev cellerne trypsiniseret og centrifugeret ved 15.000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Derefter, 2 × 10

5 celler blev overført til 1,5 ml rør til centrifugering ved 8000

g

i 5 min ved 4 ° C. Derefter, 5 pi fluorochrom konjugeret Annexin V (BioLegend, San Diego, CA, USA) og 10 pi propidiumiodid (PI, BioLegend) opløsning blev tilsat i hvert rør og inkuberet under forsigtig vortex. Cellerne blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, og derefter blev 400 ul af Annexin V-bindingsbuffer (BioLegend) tilsat til hvert rør. Farvede celler blev analyseret under anvendelse af et Becton-Dickinson FACS Canto (SanJose, CA, USA) med og data blev analyseret med FACSDiva software (BD).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt ved en Student parret t-test fulgte eller en envejs variansanalyse (envejs ANOVA) efterfulgt af Student Newman-Keuls test for multiple sammenligninger ved hjælp af GraphPad Prism software (La Jolla CA, USA).

Resultater

Pba cytotoksicitet forstærkes af

Nrf2

knockdown i MDA-MB-231 brystkræftceller

for at undersøge inddragelsen af ​​Nrf2 i effektiviteten af ​​Pba-PDT for brystkræft, vi etableret en

Nrf2

-knockdown mammacancer cellelinje i MDA- MB-231 celler. Stabile cellelinjer, der udtrykker ikke-specifik scrambled RNA (sc-MDA) eller

Nrf2

-specifik shRNA (NRF2i-MDA) blev nået fra puromycinselektion i 4 uger. Ekspressionsniveauerne af Nrf2 og dets målgener blev evalueret i disse cellelinier. NRF2i-MDA celler viste en reduktion 85% i

Nrf2

mRNA og betydelige fald i udtryk for Nrf2 mål

AKR1C1

HO-1 Hotel (fig. 1A). Western blot analyse viste, at proteiner niveauer af Nrf2 og AKR1C væsentlige formindskes i knockdown-celler (fig. 1B). Disse bekræfter den succesfulde inhibering af Nrf2 signalering i etablerede stabil cellelinie. Dernæst undersøgte vi følsomhed

Nrf2

-knockdown MDA-MB-231 celler til PBA og laser kombinationsterapi. Uden laserbestråling, havde inkubation af sc-MDA og NRF2i-MDA-celler med Pba (0,025-2,5 pg /ml, 24 h) ikke signifikant påvirker cellelevedygtighed (fig. 1C). Tilsvarende havde laser bestråling uden Pba inkubation ikke påvirke cellernes levedygtighed (fig. 1D). For at vurdere PDT følsomhed blev celler bestrålet med en 0,6-J /cm

2 laser efter inkubation med Pba og MTT-analyse blev udført efter 18 timer recovery. Oprindeligt var PDT effekt evalueret med varieret inkubationstider af Pba. Inkubationen af ​​Pba (0,125 ug /ml) i 2, 6 og 18 timer udviste tilsvarende cytotoksicitet i sc kontrolceller (fig. 1E). Baseret på dette resultat blev den 6 h-inkubering af Pba opretholdt i denne undersøgelse.

(A) Udskrift niveauer af

Nrf2

,

AKR1C1

, og

HO-1

blev målt i kontrolgruppen (sc-MDA) og

Nrf2

-knockdown celler (NRF2i-MDA) ved hjælp af relativ kvantificering af real-time PCR. HPRT1 blev anvendt som en husholdning kontrol gen. Data repræsenterer forhold med hensyn til sc-MDA og rapporteres som middelværdier ± standardafvigelser (SDS) af 3 eksperimenter. (B) Protein niveauer af Nrf2 og AKR1C1 blev bestemt ved Western blot-analyse i sc kontrol og NRF2i-MDA celler. (C) De sc-MDA og NRF2i-MDA celler blev inkuberet med Pba (0-2,5 ug /ml) i 6 timer, og levedygtige celler blev kvantificeret under anvendelse af et MTT-assay efter 18 timer recovery. (D) Celler blev bestrålet med en laser i fravær af Pba, og levedygtige celler blev kvantificeret under anvendelse af et MTT-assay efter 18 timer recovery. (E) SC-MDA blev inkuberet med Pba for 2, 6 eller 18 timer og blev bestemt antal levedygtige celler efter laserbestråling. Dataene repræsenterer procentdele i forhold til køretøjets gruppe for hver cellelinie og er rapporteret som middelværdi ± SD af 8 brønde.

I MTT-analyse, de Nrf2-MDA-celler var relativt mere følsomme over for Pba -baserede PDT: levedygtige celletal efter PDT var lavere i NRF2i-MDA celler end i kontrolgruppen celler (figur 2A.). Tilsvarende, når døde celleafledt peptidaseaktivitet blev målt i mediet ved anvendelse af en CytoTox substrat

Nrf2

knockdown-celler viste en betydelig høj cytotoksicitet sammenlignet med sc kontrol (fig. 2B).

( A) sc kontrol og NRF2i-MDA-celler blev præinkuberet med Pba (0-2,5 ug /ml) i 6 timer og blev derefter bestrålet med 0,6 J /cm

2-laser. Derefter udførtes MTT-analyse efter en 18 timer recovery. Dataene repræsenterer procentdele i forhold til køretøjets gruppe for hver cellelinie og er rapporteret som middelværdi ± SD af 8 brønde.

AP 0,05 i forhold til sc-MDA kontrol ved hver koncentration af Pba. (B) PDT-induceret cytotoksicitet blev vurderet ved at måle døde celle proteaseaktivitet i en celle dyrket medium. Celler blev inkuberet med Pba (0,125 og 0,25 pg /ml) i 6 timer efterfulgt af laserbestråling, og inkuberet i 18 timer. Dead celleafledt proteaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse fluorogent substrat AAF-R110. Dataene repræsenterer relativ cytotoksicitet i forhold til køretøjets gruppe for hver cellelinie og er rapporteret som middelværdi ± SD af 8 brønde.

AP 0,05 i forhold til hver fm-MDA kontrol. (C) En flowcytometrisk analyse af apoptotiske og nekrotiske celler blev udført i NRF2i-MDA celler efter Pba-laserbehandling. Cellerne blev inkuberet med PI og Annexin V, og cellepopulationer blev vurderet. (D) Søjlediagrammet viser cellepopulation i Annexin V (AV) + /PI +, AV + /PI- eller AV- /PI + fase fra tre separate forsøg.

AP 0,05 sammenlignet med ingen laser kontrol. (E) NRF2i-MDA-celler blev co-inkuberet med Z-VAD-FMK (10 uM) eller necrostatin (NEC-1, 50 uM) og Pba (0,125 ug /ml) i 6 timer; derefter blev cellerne vasket med PBS og bestrålet med en laser. Efter 18 timers inkubation blev levedygtige celler kvantificeret under anvendelse af et MTT-assay. Dataene er procentdele i forhold til kontrol (ingen PDT og køretøjet behandling) og er angivet som middelværdi ± SD af 8 brønde.

aP. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

PDT inducerer celledød via apoptotiske og nekrotiske veje [6], [40]. Dernæst for at identificere mekanismen for celledød involveret i PDT-behandlede

Nrf2

knockdown brystcancerceller, FACS-analyse med Annexin V og PI dobbelt farvning blev udført. NRF2i-MDA celler blev behandlet med PDT; umiddelbart derefter blev cellerne trypsiniseret og farvet med Annexin V (tidlig apoptose markør) og PI (sen apoptose og nekrose markør). Efter Pba-laser kombinationsbehandling, flertallet cellepopulationen flyttet til den apoptotiske-nekrotisk fase (fig. 2C). Kvantificering af eksperimentelle gentagelser viste, at 16,7% af cellerne var i den tidlige apoptotiske fase (Annexin V + /PI-) og 61,3% af cellerne var i den sene apoptotiske /nekrotiske fase (Annexin V + /PI +). Kun 15,7% af cellerne var i den ikke-apoptotiske og ikke-nekrotisk fase (fig. 2D). Disse viser tydeligt, at PDT inducerer celledød involverer processen af ​​apoptose og nekrose. Som en bekræftelse, når celler blev co-inkuberes med en caspase pan-hæmmer Z-VAD-FMK (10 uM) og PDT (Pba 0,125 mikrogram /ml) procentdel af levedygtige celler antallet steget fra 63% til 80,1% (fig. 2E ). Desuden inkubationen med necrostatin (50 uM), en potent inhibitor af programmeret nekrotisk celledød, forhøjet antal levedygtige celler til 78,2%. Tilsammen opnåede resultater viser, at

Nrf2

knockdown sensibiliseret brystcancer MDA-MB-231 celler til Pba-baserede PDT, hvilket resulterer i forøget celledød.

PDT-stimuleret ROS-generering er forhøjet i

Nrf2

knockdown MDA celler

Pba-laser kombinationsbehandling udgivelser singlet oxygen i cellen, og den resulterende ROS er en stor bidragyder til PDT s cytotoksicitet [5]. Derfor monitorerede vi PDT-afledte singlet oxygen-niveauer i begge cellelinier. Celler præ-behandlet med Pba (2,5 ug /ml i 6 timer), blev bestrålet med en 0,6-J /cm

2 laser, og niveauerne af singlet oxygen blev bestemt ved hjælp af trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren, et fluorescerende farvestof, som er specifikt for singlet oxygen. I forhold til behandling med Pba kun eller laser bestråling alene, trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren-baserede metode viste, at Pba-laser kombination gruppe viser en forbedret fluorescerende signal i cellen (data ikke vist), hvilket bekræfter stigningen i singlet-oxygen ved PDT. I vores første vurdering, inkubationen af ​​trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren i 5 minutter, 30 minutter og 50 minutter viste lignende øge niveauet af singlet oxygen-afledte fluorogent pyren intensitet (fig. 3A). Dette bekræfter, at singlet-oxygen-afledte pyren fluorescens kan være pålideligt detekterbar i disse inkuberinger gange; derfor et konfokalt bestemmelse blev gjort efter 30 minutters inkubation af trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren i vores undersøgelse. Den sammenlignende måling af singlet oxygen viste, at

Nrf2

-knockdown MDA-MB-231-celler genererer højere niveauer af singlet oxygen end kontrolcellerne (fig. 3B). De fluorescerende signaler blev fordelt inde i cytoplasmaet samt kernen, og den totale fluorescensintensitet var 1,5 gange højere hos de knockdown-celler end i kontrolceller. Derfor blev det samlede niveau af ROS, hvilket blev overvåget ved anvendelse DCFDA, væsentligt forhøjet efter behandling med PBA-laser kombination i begge cellelinier; Men stigningen var større i de NRF2i-MDA celler. Specifikt efter behandling med 2,5 ug /mL Pba og laserbestråling, stigningen i ROS var 4,6 gange højere i

Nrf2

-knockdown cellelinje end i kontrolgruppen cellelinien (fig. 3C). Ligeledes efter behandling med den lave koncentration af Pba (0,125 ug /ml) og laserbestråling, stigningen i ROS var 3,5 gange højere i NRF2i-MDA-celler (fig. 3D). Disse resultater tydede på, at forhøjelse af singlet oxygen og ROS forbedrer følsomheden af ​​

Nrf2

-knockdown brystcancerceller til PDT.

(A) sc kontrolceller blev inkuberet med Pba i 6 timer og bestrålet med en 0,6 J /cm

2-laser. Lige efter PDT blev en singlet oxygen følsom trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren tilsat, og cellerne blev yderligere inkuberet i 5, 30 eller 50 min i nærvær af trans-1- (2’methoxyvinyl) pyren. Derefter konfokal observation blev udført for at detektere fluorogent farvestof dannelse, som blev dannet ved omsætning med singlet oxygen.