PLoS ONE: D3-vitamin Regulerer Dannelse og nedbrydning af gap junctions i Androgen-Responsive human prostatakræft Cells

Abstrakt

1α-25 (OH)

2 vitamin D

3 (1- 25D), en aktiv hormonale form af vitamin D

3, er en velkendt kemoforebyggende og pro-differentierende middel. Det har vist sig at hæmme væksten af ​​flere prostata cancercellelinjer. Gap junctions, dannet af proteiner kaldet connexiner (Cx), er ensembler af celle-celle-kanaler, der tillader udveksling af små vækstregulerende molekyler mellem tilstødende celler. Celle-celle-kommunikation medieret af gap forbindelsesepitoper kanaler er en vigtig mekanisme til regulering af cellevækst og differentiering homeostatiske kontrol. Vi har undersøgt effekten af ​​1-25D på dannelsen og nedbrydningen af ​​gap junctions i en androgen-responsiv prostatacancer-cellelinie, LNCaP, der udtrykker retroviralt introducerede Cx32. Connexin32 udtrykkes af de luminale og godt differentierede celler fra normale prostata og prostatatumorer. Vores resultater dokumenterer, at 1-25D forøger ekspressionen af ​​Cx32 og den efterfølgende samling til gap junctions. Vores resultater viser yderligere, at 1-25D forhindrer androgen-reguleret nedbrydning af Cx32, posttranslationelt, uafhængig af androgen receptor (AR) -medieret signalering. Endelig vores resultater dokumenterer, at dannelsen af ​​gap junctions sensibiliserer Cx32 udtrykkende LNCaP celler til de væksthæmmende virkninger af 1-25D og ændrer deres morfologi. Disse resultater tyder på, at væksten-hæmmende virkninger af 1-25D i LNCaP celler kan være relateret til dets evne til at modulere samling af Cx32 i gap junctions

Henvisning:. Kelsey L, Katoch P, Ray A, Mitra S, Chakraborty S, Lin MF, et al. (2014) D-vitamin

3 Regulerer Dannelse og nedbrydning af gap junctions i Androgen-Responsive Menneskelig prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (9): e106437. doi: 10,1371 /journal.pone.0106437

Redaktør: Michael Koval, Emory University School of Medicine, USA

Modtaget: November 26, 2013; Accepteret: August 6, 2014; Udgivet: 4 September, 2014

Copyright: © 2014 Kelsey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health CA113903, DOD PCRP PC-081.198 og PC-111.867, Nebraska State Grant LB506 og R0-1DE12308. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

rolle vitamin D

3, og dets aktive hormonal form, 1α-25 (OH)

2 vitamin D

3 (1-25D), som en anti-neoplastisk, pro -differentiating, og pro-apoptotiske middel er blevet etableret i en lang række normale og maligne epitelceller, herunder prostatacancer (PSA) [1] – [4]. Virkningerne af 1-25D medieres ved binding til vitamin D-receptoren, et af medlemmerne af nuklear receptor superfamilien, som er udtrykt i en lang række celler, herunder prostata. Vitamin D-receptoren heterodimeriserer med RXR-receptoren og binder til vitamin D receptor responselement til at ændre genekspression [1]. Baseret på den iagttagelse, at PCA dødelighed i USA er omvendt proportional med den geografisk indfaldende ultraviolet stråling fra solen, og at ultraviolet lys er afgørende for D-vitamin

3 syntese i huden, en rolle for dette vitamin i faldende er blevet foreslået risikoen for at udvikle PCA [5], [6]. Talrige

in vitro

undersøgelser viser konsekvent vækst hæmmende og differentieringsinducerende effekter af vitamin D

3 på prostata carcinom celler og dyreforsøg viser, at det ikke kun reducerer forekomsten af ​​PCA ved at fungere som en kemoforebyggende middel men også undertrykker metastaser [7] – [10]

Gap junction (GJ) s er ensembler af celle-celle-kanaler, der signalerer ikke-kanonisk, ved at tillade direkte udveksling af små molekyler (≤1500Da) mellem. de cytoplasmatiske interiører af sammenhængende celler [11]. De konstituerende proteiner af GJS, kaldet connexiner (CXS), er kodet med 21 gener, som er blevet udpeget i henhold til deres molekylære masse [12]. Celle-celle-kanaler er bicellular strukturer dannet af kollaborativ indsats af to celler. For at danne en GJ celle-celle-kanal, CXS første oligomerisere i det endoplasmatiske reticulum eller trans-Golgi netværket som en hexamer, kaldet connexon, som dokker med connexon vises på en sammenhængende celle [13], [14]. Flere linjer af beviser nu låne tiltro til den opfattelse, at celle-celle kommunikation medieret af gap forbindelsesepitoper kanaler er en vigtig mekanisme til at regulere cellevækst og differentiering og til begrænsning tumorpromotion homeostatiske kontrol. For eksempel, svækket Cx ekspression eller tab af GJ funktion, er blevet impliceret i patogenesen af ​​flere typer af cancere og sygdomme [15] – [19]. Desuden har mutationer i flere Cx-gener blevet påvist i genetiske sygdomme karakteriseret ved aberrerende cellulær proliferation og differentiering [13], [20].

Vores tidligere undersøgelser viste, at ekspressionen af ​​Cx32, som udtrykkes af den luminale celler i prostata, faldt sammen med købet af den differentierede tilstand luminale celler [21], [22]. Desuden har vi dokumenteret, at udviklingen af ​​PCA fra en androgen-afhængige tilstand til en invasiv, androgen-uafhængig stat var præget af den afvigende handel med Cx32 og /eller forringet samling i GJS [22] – [24]. Desuden viste vores undersøgelser, at tvungen udtryk for Cx32 i androgen-responsiv human PCA cellelinie, LNCaP, retarderet cellevækst

in vivo

in vitro

[22]. Vi har også vist, at i LNCaP celler, der udtrykker Cx32, dannelse og nedbrydning af GJS blev reguleret af androgener, der kontrollerede ekspressionsniveauet af Cx32 posttranslationelt ved at forhindre dens nedbrydning af endoplasmatisk reticulum forbundet nedbrydning (ERAD) [25]. Androgener er nødvendige for at opretholde den sekretoriske (differentiering-relaterede) funktion af de luminale epitelceller i normalt prostata som udtømning af androgener ved kirurgisk eller kemiske midler udløser apoptose og /eller dedifferentiering af disse celler [26] – [29]. Vore nylige undersøgelser har vist, at retinoider, som også regulerer proliferation og differentiering af prostata epitelceller [28], [30], også øge samlingen af ​​Cx32 i GJS [31]. Disse undersøgelser låne tiltro til idéen om, at dannelse og nedbrydning af GJS kan være knyttet til spredning og differentiering af luminale prostata epitelceller.

Ligesom androgener og retinoider, D-vitamin er vigtigt for den normale udvikling

3 af prostata og er dokumenteret at modulere PCA progression [7], [9]. Nylige undersøgelser har vist, at D-vitamin undertrykt prostataepitelceller neoplasi i Nkx3.1 /PTEN transgene mus [32]. Epidemiologiske, cellekultur, og kliniske undersøgelser har impliceret antitumorvirkninger af 1-25D for PCA og det er blevet foreslået at være en kraftig kemoforebyggende middel [3], [4]. Men i modsætning til tyktarmskræft [1], [33], potentiale effektivitet 1-25D i chemoforebyggelse af PCA er forblevet kontroversiel trods talrige undersøgelser i transgene musemodeller for PCA og dets anvendelse i kliniske forsøg [1], [2]. Tidligere undersøgelser, herunder vores, har vist, at vækst-hæmmende og differentieringsinducerende virkninger af kemoforebyggende midler kan være relateret til deres evne til at forbedre hul junktionkommunikation [34] – [38]. Den luminale celler med normal prostata udtrykke Cx32 og danne store GJS og progression af PCA er ledsaget af tab af evne til at danne GJS [22], [23]. Dannelse af GJS er blevet impliceret i at opretholde polariserede og differentieret tilstand af epitelceller [39]. Disse undersøgelser fik os til at undersøge effekten af ​​1-25D om samlingen af ​​Cx32 i GJS i androgen-responsiv human PCA LNCaP. Fordi 1-25D har vist sig at øge ekspressionen af ​​AR i LNCaP-celler [40], vi rationaliseret, at det kan modulere androgen-regulerede dannelse og nedbrydning af GJS og påvirke væksten af ​​androgen-responsive PCA celler, som udtrykker Cx32. Ved at bruge androgen-responsive LNCaP-celler, som udtrykker retroviralt introducerede Cx32 [25], viser vi, at 1-25D forbedrer samlingen af ​​Cx32 i GJS. Endvidere viser vi endvidere, at 1-25D forhindrer androgen-reguleret nedbrydning af GJS posttranslationelt, uafhængig af AR-medieret signalering. Endelig vores resultater viser, at dannelsen af ​​GJS sensibiliserer LNCaP celler til vækst-hæmmende virkninger af 1-25D og ændrer deres morfologi.

Materialer og metoder

Cell Culture

Androgen responsivt human PCA cellelinie, LNCaP, blev dyrket som beskrevet [41], [42]. LNCaP-32-celler, en af ​​de adskillige kloner af LNCaP-celler, der udtrykker retroviralt transducerede rotte Cx32 og LNCaP-N-celler, en af ​​de adskillige kontrolsystemer kloner udvalgt i G418 efter infektion med kontrolgruppen retrovirus, er blevet beskrevet [25], [ ,,,0],31]. Parentale LNCaP-celler, i det følgende benævnt LNCaP-P-celler, blev dyrket i RPMI indeholdende 5% føtalt bovint serum i en atmosfære af 5% CO

2/95,% luft henviser LNCaP-N og LNCaP-32-celler blev holdt i RPMI indeholdende 5% føtalt bovint serum indeholdende G418 ved 200 pg /ml som beskrevet [25], [31]. Steroid-depleteret (kul-strippet) serum og phenol-rød-frit RPMI blev opnået fra HyClone Laboratories (Salt Lake City, UT).

Antistoffer og Immunfarvning

Kilderne til både monoklonale og polyklonale antistoffer mod Cx32 er blevet beskrevet tidligere [24], [25], [31], [43], [44]. Mouse anti-occludin (klon OC-3F10) var fra Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA). Kanin-antistoffer mod α- og β-catenin og muse-anti-β-actin (klon C-15) var fra Sigma (St. Louis, MO). Monoklonale antistoffer mod E-cadherin (E-cad), α-catenin, β-catenin, generøst tilvejebragt af Drs. Johnson og Wheelock (Eppley Institute), er blevet beskrevet [25], [43], [44]. En kanin polyklonalt anti-AR-receptor-antistof var fra Santa Cruz Biotech (sc-13.062, San Diego, CA). Celler (1,5 × 10

5), seedet i seks såvel klynger indeholdende dækglas og lov til at vokse til ca. 50% sammenløb, blev immunfarvet med forskellige antistoffer som beskrevet [24], [25], [31], [ ,,,0],43] – [45]. Sekundære antistoffer (kanin eller mus), konjugeret med Alexa 488 og Alexa 594, blev brugt som passende. Billeder af immunofarvede celler blev erhvervet med Leica DMRIE mikroskop (Leica Microsystems, Wetzler, Tyskland) udstyret med Hamamatsu ORCA-ER2 CCD-kamera (Hamamatsu-City, Japan) og analyseret ved hjælp af billedbehandling software (Volocity, Version 6.3, Improvision, Inc; Perkin Elmer) som beskrevet [43] -. [45]

Stock Solutions

Syntetisk androgen mibolerone (MB) og en naturlig androgen hydro-testosteron (DHT), 1-25D, og ​​Casodex ( bicalutamid) blev erhvervet fra BIOMOL (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). Stamopløsninger af MB og DHT blev fremstillet ved 1 mM i ethanol og opbevaret ved -20 ° C i små portioner beskyttet mod lys. Stamopløsning af 1-25D (10 uM) blev fremstillet i ethanol og opbevaret i portioner ved -80 ° C beskyttet mod lys. Stamopløsning af Casodex (10 mM) blev fremstillet i DMSO og opbevaret i portioner ved -20 ° C. De blev passende fortyndet i mediet på tidspunktet for behandlingen. Alle forsøg blev udført i gult lys, som beskrevet [36], [37].

Androgen Udtømmelse og andre behandlinger

Celler blev podet i seks såvel klynger med dækglas (1,5 × 10

5 celler pr brønd) og i 6-cm (2 × 10

5 celler pr skål) og 10 cm skåle (3,5 × 10

5 celler pr skål) i 2, 4 og 10 ml komplet medium , henholdsvis. Cellerne blev behandlet ved påfyldning med frisk medium indeholdende forskellige reagenser i den ønskede koncentration, når de nåede 50% konfluens. Kontroller blev behandlet med ethanol, således at den endelige koncentration af opløsningsmidlet ikke oversteg 0,1%. Når celler skulle dyrkes under androgen-depleterede betingelser blev normal celledyrkningsmedium erstattet med androgen-udtømte celledyrkningsmedium (phenol-rød-frit RPMI indeholdende 5% trækul-strippet serum). Kontrollerne modtog frisk phenol-rød-frit medium indeholdende normalt serum. Vi anvendte phenol-rød-frit medium, fordi phenol-rød er blevet dokumenteret at have steroidogene virkninger på væksten af ​​hormon-responsive cellelinier, herunder LNCaP [46], [47].

Western blot-analyse og Detergent opløselighed Connexin32

Celler (5 x 10

5) blev podet i 10 cm skåle i replikat i 10 ml komplet medium og dyrket til konfluens i nærvær og fravær af forskellige reagenser. Cellelyse, detergent-opløselighed assay med 1% Triton X-100 (TX100) og ekspressionsniveauet af Cx32 blev analyseret ved Western blot-analyse som beskrevet [25], [43], [44]. Kort fortalt, efter lysering i buffer SSK (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 10 mM NEM, 10 mM Na

2VO

4, 10 mM iodacetamid, 1% TX100, pH 7,4 ), blev de samlede, vaskemiddel-opløselige og -insoluble ekstrakter adskilt af ultracentrifugering ved 100.000 × g i 60 min (35.000 rpm i analytisk Beckman ultracentrifuge; Model 17-65 ved hjælp af en SW50.1 rotor). Detergentsammensætningerne-uopløselige pellets blev opløst i puffer C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, 8 M urinstof, 10 mM NEM, 10 mM iodacetamid, 2,5% SDS og 0,1 M DTT). Efter normalisering baseret på celleantal blev totalt og TX100-opløselige og -insoluble fraktioner blandet med 4xSDS-ladningsbuffer til en slutkoncentration på 1 x og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time, før SDS-PAGE-analyse. Blots blev udviklet med C-Digit (Li-COR, Lincoln, NE) hjælp SuperSignal WestFemto Maksimal følsomhed Substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Kommunikation Analyser

Gap junktionkommunikation blev analyseret ved mikroinjektion Lucifer Yellow (MW 443 Da, Lithium salt), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da, A-10436), og Alexa Fluor 594 (MW 760 Da, A-10438) ved hjælp af Eppendorf InjectMan og FemtoJet mikroinjektion systemer (modeller 5271 og 5242, Brinkmann instrument, Inc. Westbury, NY) monteret på Leica DMIRE2 mikroskop. Efter optagelse af billeder af mikroinjicerede celler ved hjælp af CCD-kameraet (Retiga 2000R, FAST 1394) under anvendelse QCapture (British Columbia, Canada), permeabiliteten af ​​forskellige fluorescerende sporstoffer blev kvantificeret ved at score antallet af fluorescerende celler ved 1 min (Lucifer Yellow ), 3 min (Alexa 488) og 15 min (Alexa 594) efter mikroinjektion i test celle som beskrevet [22], [25], [43], [48].

Colony Dannelse og cellevækst assays

Cellevækst blev vurderet enten ved kolonidannende assay eller ved at tælle antallet af celler som beskrevet [22], [48]. For kolonidannende assay, 1 x 10

3-celler blev podet i 6 cm skåle i tre eksemplarer i 3 ml dyrkningsmedium. Efter 24 timer, en ml medium indeholdende 1-25D, MB eller DHT blev tilsat til skålene til opnåelse af den ønskede slutkoncentration. Celler blev dyrket i 21 dage, med et medium ændring hver 4 dage indeholdende den passende koncentration af de ovennævnte reagenser, når de dannede synlige kolonier. Kolonier i skåle blev fikseret med 3,7% bufret formaldehyd, farvet med 0,025% opløsning af krystalviolet i PBS, og fotograferet. Til måling af cellevækst, 5 × 10

4-celler blev podet i 6 cm skåle i replikat og behandlet med 1-25D beskrevet ovenfor. Celler fik lov til at vokse i 10 dage med en medium ændring på dag 5. Celler blev trypsiniseret og talt i et hæmocytometer.

Resultater

Vitamin D

3 Forbedrer Cx32 Expression niveau

Vi brugte LNCaP-32 celler, der udtrykker retroviralt transducerede rotte Cx32 beskrevet tidligere [25], [31]. Vi har tidligere vist, at i LNCaP-32-celler androgener reguleres dannelsen af ​​GJS, posttranslationelt, ved styring ekspressionsniveauet af Cx32 ved at hæmme dets ERAD-medieret nedbrydning [25]. Vores efterfølgende undersøgelser viste, androgen-reguleret nedbrydning af Cx32 blev ophævet af all-trans-retinsyre (ATRA) og 9-cis-retinoidsyre (9-CRA) [31]. Vi derfor rationaliseret at 1-25D kunne handle ligner ATRA og 9-CRA. Baseret på de tidligere undersøgelser viser virkningen af ​​vitamin D på LNCaP-cellevækst [10], [49] – [52], behandlede vi LNCaP-32-celler med forskellige koncentrationer af 1-25D at undersøge dens virkning på ekspressionsniveauet af Cx32 . Vi fandt, at 1-25D forøget Cx32 ekspressionsniveau i en dosisafhængig måde (figur 1A). Signifikant forbedring blev observeret selv ved koncentration så lav som 1 nM (figur 1B, venstre graf). Koncentrationer højere end 10 nM var toksiske for disse celler som bedømt ved den kolonidannelse assayet (upublicerede data). For efterfølgende undersøgelser valgte vi 10 nM 1-25D. Tidsforløb undersøgelser viste, at en signifikant stigning i Cx32 ekspressionsniveauet forekom så tidligt som 12 timer efter behandling med 1-25D og nåede et plateau ved 72 timer (figur 1CD, højre graf). Virkningen af ​​1-25D på Cx32 ekspressionsniveauet var så potent som syntetisk androgen, MB og 9-CRA. Desuden kombineret behandling med 1-25D og MB var mere effektiv til at øge Cx32 ekspressionsniveauet (fig 2AB). Vitamin D

3 havde tidligere vist sig at påvirke ekspressionen af ​​niveauet af E-cad, en bestanddel protein på adherensovergange, i colon cancerceller [33]. For at bestemme om 1-25D også påvirket ekspressionsniveauet for adherens junction associerede proteiner, målte vi ekspressionsniveauet af E-cad og dens tilknyttede proteiner a- og p-catenins 72 timer efter behandling med 1-25D. Resultaterne viste, at 1-25D havde nogen effekt på ekspressionen niveauet af E-cad og a- og p-catenins (figur 2C). Som målt ved semikvantitativ RT-PCR-analyse, 1-25D hverken inducerede ekspressionen af ​​endogene Cx32 i LNCaP-P eller LNCaP-N-celler (data ikke vist) eller ændret ekspressionsniveauet af retroviralt-transkriberet Cx32 mRNA i LNCaP-32 som dokumenteret tidligere [25].

A. Dosisafhængige forstærkning af Cx32 ekspressionsniveauet ved 1-25D behandling i 48 timer. B. Kvantitativ analyse af udtrykket niveauet af de data, der er vist i A. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​Mean fra 4-17 eksperimenter. Bemærk, at væsentlig forbedring observeres selv ved 1 nM. De stjerner (**) indikerer P-værdi på ≤0.0001. En tosidet Student s

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under antagelse ulige varians. C. Kinetik af forøgelse af Cx32 ekspressionsniveauet ved behandling med 1-25D (10 nM) i de angivne tidsrum. Bemærk, at ekstraudstyret er observeret så tidligt som 12 timer og plateauer på 72 timer. D. Kvantitativ analyse af udtrykket niveauet af de data, der er vist i C. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​Mean fra 3-11 eksperimenter. Stjernen (*) angiver P-værdi på ≤0.0016 og stjerner (**) angiver P-værdi på ≤0.0001. En tosidet Student s

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under antagelse ulige varians.

Cx32-udtrykkende LNCaP-32-celler blev behandlet med den 1-25D, 9-CRA, DHT og MB som angivet. A. Kombineret behandling med 1-25D med MB eller 9-CRA er mere effektiv til at øge Cx32 udtryk niveau end behandling med enkelt middel alene. B. Kvantitativ analyse af udtrykket niveauet af de data, der er vist i A. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​Mean fra 4-13 eksperimenter. De stjerner (**) indikerer P-værdi på ≤0.0001. En tosidet Student s

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under antagelse ulige varians. C. Virkning af 1-25D på adherens junction associerede proteiner. Ekspression af adherens junction proteiner E-cadherin (E-cad), α-catenin (α-cat), og β-catenin (β-cat) blev analyseret ved Western blot-analyse af totalt cellelysat (10 ug). Bemærk, at der ikke er nogen effekt.

D-vitamin

3 Forbedrer Gap Junction Assembly og junktionkommunikation

Vi næste undersøgte effekten af ​​1-25D om samlingen af ​​Cx32 ind GJS. Vi fandt, at, samtidig med en stigning i ekspressionsniveauet af Cx32, 1-25D steg også GJ samling som vurderet ved immuncytokemisk analyse (figur 3A) og biokemisk ved Western blot-analyse af totalt, TX100-opløselige og -insoluble ekstrakter ved 48 timer efter behandling (fig 3BC). Denne biokemiske metode er baseret på det princip, at CXS, som er indarbejdet i GJS, bliver uopløseligt i TX100 mens CXS, der ikke er indarbejdet i GJS forbliver opløselig [53]. Dette assay er blevet reproducerbart vist at måle samlingen af ​​cxs i GJS som dokumenteret af tidligere undersøgelser [24], [25], [53]. Desuden har vi fundet, at forøgelse af GJ samling var ledsaget af en 2-3 fold parallel stigning i junktionkommunikation som bestemt ved forbindelsesområdet overførsel af tre GJ permeable fluorescerende sporstoffer, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570), og Alexa 594 (MW 760). F.eks 1-25D øget junktionel overførsel af Alexa 594 med 2-3 folder sammenlignet med kontroller (tabel 1). Virkningen af ​​1-25D på junktionkommunikation var så potent som syntetisk androgen, MB, og den naturlige androgen DHT (tabel 1). For at bestemme om 1-25D påvirkede samlingen af ​​andre samlingskomplekserne undersøgte vi også den detergent-opløselighed adherens og tight junction associerede proteiner. Rationalet bag disse undersøgelser var, at E-cad har vist sig at lette samlingen af ​​cxs i GJS [43], [44], [54], og Cx-ekspression er blevet vist at lette samlingen af ​​tight junctions og tilknyttede proteiner [39]. Vi fandt, at 1-25D havde ingen effekt på opløseligheden af ​​E-cad og dets tilknyttede proteiner, α- og β-catenin, og tight junction-associerede proteiner, ZO-1 og occludin, i TX-100 tyder på, at deres samling ikke var yderligere forbedret i respektive celle junctions (figur 3B). Taget sammen antyder disse data at 1-25D, ligesom androgener og retinoider, øger ekspressionsniveauet af Cx32 og dets efterfølgende samling til GJS, uden discernibly ændre ekspressionsniveauet af andre celle junction associerede proteiner.

LNCaP -32 celler, dyrket enten i seksbrønds klynger eller 10-cm skåle blev behandlet med 1-25D (10 nM), MB (5 nM) og 1-25D plus MB i 48 timer. A. Samling af Cx32 (grøn) i GJS blev vurderet immuncytokemisk. E-cad er vist med rødt og kernerne er i blåt. Bar = 20 uM. Bemærk, at GJ-dannelse blev forbedret ved behandling med 1-25D og MB. B. TX100- opløselighed assay blev anvendt til måling samlingen af ​​Cx32 i GJS, af tight junction protein, occludin (OCCL) og ZO-1, og adherens junction protein, E-cadherin (E-cad) og α-catenin (α-cat). T = total fraktion; S = opløselig fraktion og I = uopløselig fraktion. C. Kvantitativ analyse af ekspressionsniveauet af Cx32 vist i B. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​Mean fra 4-17 eksperimenter. Bemærk, at både det samlede niveau og detergent-uopløselige fraktion af Cx32 steget betydeligt. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen af ​​Mean fra 3-11 eksperimenter. Stjernen (*) angiver P-værdi på ≤0.0016 og stjerner (**) angiver P-værdi på ≤0.0001. En tosidet Student s

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under antagelse ulige varians. Bemærk fraværet af effekt på adherens junction associerede proteiner, E-cad, og tight junction protein, occludin (OCCL).

D-vitamin

3 modulerer Androgen-reguleret Formation og nedbrydning af gap junctions

Tidligere undersøgelser med LNCaP-32 celler havde vist, at androgen udtømning forårsagede nedbrydning af Cx32 af ERAD, og ​​at androgener forbedret GJ dannelse ved omdirigering af ERAD målrettet pulje af Cx32 til celleoverfladen , hvilket gør det modtagelig for GJ samling [25]. I efterfølgende undersøgelser viste vi, at androgen-regulerede dannelse og nedbrydning af GJS blev forhindret af 9-CRA og Atras [31]. Vi rationaliseret at 1-25D kunne forbedre GJ samling ved at redde den ERAD målrettet pulje af Cx32 ligesom 9-CRA og ATRA. Derfor undersøgte vi ekspressionsniveauet af Cx32 og dets samling til GJS upon androgen depletering i nærvær og fravær af 1-25D i LNCaP-32-celler. Til disse undersøgelser anvendte vi androgen-depleteret (kul-strippet) og phenol-rød-frit celledyrkningsmedium at dyrke celler, fordi phenol-rød har en svag steroidogene virkning [46]. Som det blev observeret i vores tidligere undersøgelser [25], fandt vi, at androgen-depletion faldt ekspressionsniveauet af Cx32 inden for 12 timer, som ikke kun blev forhindret ved tilsætning af MB, men også af 1-25D (fig 4AB). Desuden kombineret behandling med MB og 1-25D syntes at være mere effektiv til at forøge ekspressionsniveauet af Cx32 (figur 4A, øvre blot). Vi fandt også, at androgen depletering faldt ekspressionsniveauet af AR, som også blev forhindret ved behandling med ikke kun androgener men også med 1-25D (figur 4A, nedre blot). For at underbygge ovenstående data, vi yderligere vurderet dannelsen af ​​GJS immuncytokemisk (figur 5A) og funktionelt ved at måle junktionel overførsel af Lucifer Yellow, Alexa 488, og Alexa 594 (tabel 2). Resultaterne viste, at GJS knapt blev observeret i celler dyrket i androgen-udtømte medium som bedømt ved manglen på Cx32-specifik immunfarvning ved kontakt celle-celle områder, mens de let blev observeret, når androgen-depleteret medium blev suppleret med 1-25D og MB (figur 5A). Funktionelle assays viste, at forbindelsesområdet overførsel af Lucifer Yellow, Alexa 488 og Alexa 594 faldt betydeligt ved androgen depletering, som blev forhindret ved påfyldning androgen-udtømte medium med MB og 1-25D (tabel 2), således at underbygge de immuncytokemiske data.

LNCaP-32-celler, podet i 10 cm skåle, blev skiftet til trækul-strippet (androgen-depleteret) medium (ST). Ekspressionsniveauet af Cx32 og AR blev bestemt ved Western blot-analyse (A) i nærvær og fravær af 1-25D (10 nM) og MB (5 nM). Bemærk, at Cx32 og AR nedbrydes ved androgen udtømningen og forringelsen er blokeret på 1-25D behandling. BC. Kvantitative analyser af ekspressionsniveauet af Cx32 (B) og AR (C) af de data, der er vist i A. Hver søjle repræsenterer middelværdien og standardfejlen af ​​middelværdien fra 5-11 forsøg. De stjerner (**) indikerer P-værdi på ≤0.0001. En tosidet Student s

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under antagelse ulige varians.

LNCaP-32-celler, podet i seksbrønds klynger eller 10 cm skåle, blev skiftet til trækul -stripped, androgen-udtømte medium (ST). GJ montage og ekspressionsniveauet af Cx32 blev bestemt ved immuncytokemisk (A) og Western blot (B) analyser af TX100-opløselighed assay i nærvær og fravær af 1-25D (10 nM) og MB (2,5 nM). I (A), Cx32 er i grøn og E-cad er rød og kerner (blå) er farvet med DAPI. Scale bar i A = 20 uM. I (B), T = total fraktion; S = opløselig fraktion og I = uopløselig fraktion. TX100-opløselige og uopløselige fraktioner samt immuncytokemisk analyse blev udført 24 timer efter stripning som beskrevet i Materialer og Metoder. Bemærk at GJS nedbrydes på androgen udtømningen og forringelsen er blokeret på 1-25D behandling (A). Bemærk også, at TX100-opløselige fraktion af E-cad (E-cad), β-catenin (β-cat) og ZO-1 påvirkes ikke. Bemærk også, at androgen-depletion øger den opløselige fraktion af occludin (B) uden at påvirke det samlede occludin niveauer, som kvantificeret i D. Stjernen (*) angiver P-værdi på ≤0.0016 og stjerner (**) indikerer P-værdi på ≤0.0001. En to halet Students

t

test blev anvendt til at beregne P-værdi under forudsætning af ulige varians.

immuncytokemiske og junktionel dataoverførsel De blev yderligere bekræftet af den TX100-opløselighed assay ( Figur 5BC). Vi undersøgte også virkningen af ​​androgen-depletion på detergent-opløseligheden af ​​E-cad og β-catenin og stramme-kryds-associerede proteiner, ZO-1 og occludin. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser [25], viste resultaterne, at androgen depletering øgede detergent-opløselighed occludin men ikke af ZO-1 og E-cad og β-catenin (fig 5BD). Vi undersøgte også effekten af ​​MB og 1-25D enten alene eller i kombination på dannelsen af ​​GJS i forældrenes LNCaP-P og G418-resistente LNCaP-N-celler og fandt, at de havde ingen effekt (data ikke vist). Kollektivt antyder disse data, at 1-25D forhindrer androgen-reguleret nedbrydning af Cx32 og forbedrer GJ dannelse i LNCaP-32-celler. Fordi kombineret behandling med androgener og 1-25D forøgede ikke GJ samling yderligere, er det sandsynligt at samlingen blev forstærket ved redning samme pulje af Cx32 der blev målrettet til ERAD upon androgen depletion. Som blev observeret i vores tidligere undersøgelser, samling og vaskemiddel-opløselighed Cx32 og occludin i celle vejkryds, eller omvendt, ser ud til at blive reguleret sideordnet [25].

1-25D Forbedrer Gap Junction Formation uafhængigt af androgen receptor Funktion

Vores data viser, at 1-25D forhindrede nedbrydningen af ​​AR på androgen udtømning (figur 4A, bund blot). Også behandling af LNCaP-celler med 1-25D havde vist sig at forbedre AR ekspressionsniveau [40]. , Betragtede vi således den mulighed, at effekten af ​​1-25D om en forbedring af GJ forsamling afhang funktionen af ​​AR alene – og ikke på den uafhængige effekt af 1-25D. For at teste dette begreb behandlede vi LNCaP-32-celler med anti-androgen, Casodex (bicalutamid), til at blokere androgen virkning [55], [56]. Både androgen depletering og behandling med Casodex forårsagede nedbrydning af AR (figur 6A, øvre blot, figur 6B) og ophævede virkningen af ​​MB og DHT på Cx32 ekspressionsniveauet (figur 6A, bund-blot, figur 6B) som blev observeret i vore tidligere undersøgelser [25], [31]. Vi fandt imidlertid, at Casodex havde ingen effekt på forbedring af ekspressionsniveauet af Cx32 følge af behandling med 1-25D i androgen-udtømte medium (figur 6AB). For at underbygge disse data, vi næste undersøgt dannelsen af ​​GJS immuncytokemisk i celler behandlet med bicalutamid i nærvær og fravær af MB eller 1-25D. Vi fandt, at GJS ikke blev dannet, når celler blev behandlet med bicalutamid i normalt serum eller i androgen-udtømte medium indeholdende MB som blev observeret i vore tidligere undersøgelser (figur 7) [25], [31]. På den anden side, fandt vi, at GJS rigeligt blev dannet, når celler blev behandlet med bicalutamid og 1-25D (figur 7). Tilsammen antyder disse data, at den mekanisme, hvormed 1-25D forhindrer nedbrydningen af ​​Cx32 og forbedrer GJ formation upon androgen depletering er uafhængig af AR.

LNCaP-32-celler, podet i 6 cm-skåle, blev dyrket til 70% konfluens. Celler blev derefter dyrket i yderligere 24 timer i normalt medium (NS), androgen-udtømte medium alene (ST), normalt serum suppleret med Casodex (CDX; NS + CDX), androgen-udtømte medium tilsat MB (ST + MB), MB og Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D og Casodex (ST + 1-25D + CDX) og i normalt serum med 1-25D (NS + 1-25D ).